一种熊去氧胆酸的制备方法
阅读说明：本技术 一种熊去氧胆酸的制备方法 (Preparation method of ursodeoxycholic acid ) 是由 陈曦 崔云凤 冯进辉 卜丹丹 吴洽庆 朱敦明 于 2020-07-23 设计创作，主要内容包括：为了解决熊去氧胆酸的生物制备需要过量共底物来实现辅因子再生的问题,本发明通过在黄素还原酶的作用下,以核黄素为底物,实现了共底物的催化量加入,利用空气中的氧气作为底物大大降低了由鹅去氧胆酸氧化为7-羰基石胆酸的生产成本。以7-羰基石胆酸为底物,异丙醇为共底物,底物浓度可以有效提高。本发明为熊去氧胆酸的绿色生产提供了一条廉价的生物催化工艺。(In order to solve the problem that the biological preparation of ursodeoxycholic acid requires excessive co-substrate to realize cofactor regeneration, the invention takes riboflavin as a substrate under the action of flavin reductase to realize the addition of a catalytic amount of the co-substrate, and the production cost of oxidizing chenodeoxycholic acid into 7-carbonyl lithocholic acid is greatly reduced by taking oxygen in the air as the substrate. The concentration of the substrate can be effectively improved by using 7-carbonyl lithocholic acid as the substrate and isopropanol as a co-substrate. The invention provides a cheap biological catalysis process for green production of ursodeoxycholic acid.)
技术领域
本发明涉及利用多种氧化还原酶作为催化剂，以鹅去氧胆酸为底物制备熊去氧胆酸，属于生物工程领域。
背景技术
胆酸及其衍生物具有广泛的生物活性，是内源性的天然产物。由于其本身高度的光学纯度和两亲的分子的结构特点，生物活性研究一直是药理学和药物发现领域的研究热点之一。胆酸类药物己经在临床上有应用，如熊去氧胆酸及牛横熊去氧胆酸已用于肝脏疾病的治疗(熊去氧胆酸联合来适可治疗脂肪肝合并高脂血症患者的效果，魏鸿，2017，30,133)，。而近几年来，胆酸及其衍生物的药理活性研究取得了很大的突破，2015年，FDA批准了两个胆酸类药物上市，分别为用于治疗胆汁酸合成障碍罕见病的Cholham胶囊(主要成分为胆酸)和用于颏下脂肪的溶脂针剂Kybella(主要成分为脱氧胆酸)。
传统的熊去氧胆酸制备的文献(NAD+-Dependent Enzymatic Route for theEpimerization of Hydroxysteroids,Fabio Tonin,Linda G.Otten,IsabelW.C.E.Arends, 2018,11,1-13；Flavin Oxidoreductase-Mediated Regeneration ofNicotinamide Adenine Dinucleotide with Dioxygen and Catalytic Amount ofFlavin Mononucleotide for One-Pot Multi-Enzymatic Preparation ofUrsodeoxycholic Acid,Xi Chen,Yunfeng Cui,Jinhui Feng, Yu Wang,Xiangtao Liu,Qiaqing Wu,Dunming Zhu,Yanhe Ma,2019,DOI: 10.1002/adsc.201900111)虽然是一锅法进行，但是往往需要使用共底物来实现辅酶的再生。尤其是第一步的氧化过程中，往往需要过量的共底物加入推进反应的进行。
上式为鹅去氧胆酸制备熊去氧胆酸
发明内容
为了有效的降低从鹅去氧胆酸制备熊去氧胆酸的生产成本，本发明通过使用催化量的共底物加入，降低熊去氧胆酸的生产成本。
本发明的有益效果：通过更改辅酶再生方法，有效的降低了共底物的使用量从而降低了生成成本，为熊去氧胆酸的制备提供了一条廉价的制备方法。
具体实施方式
下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
本发明中使用的黄素还原酶基因来源于Mycobacterium goodii的核黄素还原酶(MFR)(GenBank:ABX11274.1)，7α-羟基甾体脱氢酶(7α-HSDH)基因来源于 Brevundimonassp.(GenBank:WP_046653274.1)，7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)基因来源于Clostridiumsp.Marseille(GenBank:WP_066892209.1)，TB醇脱氢酶(TBADH) 基因来源于Thermoanaerobacter ethanolicus(GenBank:X64841.1)将上述构建到pET21a 或者pRSFDuet-1表达载体上。将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌BL21 (DE3))，获得相应的工程菌株。将工程菌株接种至L-B培养基中，25℃培养16 小时。离心收集菌体，破菌留取上清液。
实施例1：黄素还原酶与7α-胆酸脱氢酶制备7-Keto-石胆酸
在1mL反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-羟基甾体脱氢酶(7α-HSDH)，辅因子NAD+(0.1mM)，黄素还原酶(MFR)，核黄素-5-磷酸(0.1mM)30℃反应， 2小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例2：鹅去氧胆酸制备熊去氧胆酸
在10mL反应体系中，加入鹅去氧胆酸(30mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)，辅因子NAD+(0.1mM)，黄素还原酶(MFR)，核黄素-5-磷酸(0.1mM)30℃反应，4小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。随后加入TBADH，7β-HSDH和45mM异丙醇，继续30℃反应，24小时后检测，熊去氧胆酸生成率>95％。
实施例3：鹅去氧胆酸制备熊去氧胆酸
在10mL反应体系中，加入鹅去氧胆酸(100mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)，辅因子NAD+(0.1mM)，黄素还原酶(MFR)，核黄素-5-磷酸(0.1mM)30℃反应，8 小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。随后加入TBADH，7β-HSDH和150mM异丙醇，继续30℃反应，24小时后检测，熊去氧胆酸生成率>95％。
实施例4：鹅去氧胆酸制备熊去氧胆酸
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(500mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)，辅因子NAD+(10mM)，黄素还原酶(MFR)，核黄素-5-磷酸(5mM)30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。随后加入TBADH，7β-HSDH和750mM异丙醇，继续30℃反应，48小时后检测，熊去氧胆酸生成率>95％。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 12-羟基胆酸脱氢酶及其应用
<130> 1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 777
<212> DNA
<213> Eggerthella lenta
<400> 1
catatggaca tgggtctgaa ggataaagtg gttctgatta ccggtggcgg tggcggtatt 60
gcgcgtggca ttgagcgtgc gttcgcgacc gaaggtgcga agttcatcct gaccgacctg 120
tttagcggcg gtctggaggc ggcgaaagag gaactggagc gtgatttcgg cagcgaagtt 180
tttaccattc tggcgaacgg tagcgtggag gaagaggttc gtgcggcggt tgaggcgggt 240
gcggaacact ttggcggtcg tatcgacgtg ctgattaaca acgcgcaggc gagcgcgagc 300
ggtctgaccc tggttcaaca cagcgaagag gactttgatc tggcggtgcg tagcggtctg 360
tacgcgacct tcttttatat gaagcacgcg tacccgtatc tgaaagaaac cgcgggcagc 420
gttattaact ttgcgagcgg tgcgggtatc ggcggtaacc cgggtcagag cagctacgcg 480
gcggcgaaag agggtatccg tggtatgagc cgtgttgcgg cgagcgaatg gggtccggat 540
aacatcaacg tgaacattgt ttgcccgatc gtgatgacca aggcgctgga agagtggcgt 600
gaacgtgagc cggaaatgta tgagaagaac gttaaagcga ttccgctggg ccgttttggt 660
gacgcggaaa aagatgtggg tcgtgtgtgc gttttcctgg cgagcccgga cgcgagcttt 720
gttaccggcg ataccatcat ggtgcaaggc ggtagcggta tgaaaccgta actcgag 777
<210> 2
<211> 255
<212> PRT
<213> Eggerthella lenta
<400> 2
Met Asp Met Gly Leu Lys Asp Lys Val Val Leu Ile Thr Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ile Ala Arg Gly Ile Glu Arg Ala Phe Ala Thr Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Phe Ile Leu Thr Asp Leu Phe Ser Gly Gly Leu Glu Ala Ala Lys
35 40 45
Glu Glu Leu Glu Arg Asp Phe Gly Ser Glu Val Phe Thr Ile Leu Ala
50 55 60
Asn Gly Ser Val Glu Glu Glu Val Arg Ala Ala Val Glu Ala Gly Ala
65 70 75 80
Glu His Phe Gly Gly Arg Ile Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gln Ala
85 90 95
Ser Ala Ser Gly Leu Thr Leu Val Gln His Ser Glu Glu Asp Phe Asp
100 105 110
Leu Ala Val Arg Ser Gly Leu Tyr Ala Thr Phe Phe Tyr Met Lys His
115 120 125
Ala Tyr Pro Tyr Leu Lys Glu Thr Ala Gly Ser Val Ile Asn Phe Ala
130 135 140
Ser Gly Ala Gly Ile Gly Gly Asn Pro Gly Gln Ser Ser Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ala Lys Glu Gly Ile Arg Gly Met Ser Arg Val Ala Ala Ser Glu Trp
165 170 175
Gly Pro Asp Asn Ile Asn Val Asn Ile Val Cys Pro Ile Val Met Thr
180 185 190
Lys Ala Leu Glu Glu Trp Arg Glu Arg Glu Pro Glu Met Tyr Glu Lys
195 200 205
Asn Val Lys Ala Ile Pro Leu Gly Arg Phe Gly Asp Ala Glu Lys Asp
210 215 220
Val Gly Arg Val Cys Val Phe Leu Ala Ser Pro Asp Ala Ser Phe Val
225 230 235 240
Thr Gly Asp Thr Ile Met Val Gln Gly Gly Ser Gly Met Lys Pro
245 250 255
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