一种功能性醇溶鲟鱼软骨制剂的制备方法
阅读说明：本技术 一种功能性醇溶鲟鱼软骨制剂的制备方法 (Preparation method of functional alcohol-soluble sturgeon cartilage preparation ) 是由 袁丽 储倩 伍晓云 石彤 李欣 高瑞昌 于 2021-01-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于水产品高值化利用领域,涉及一种功能性醇溶鲟鱼软骨制剂的制备方法；本发明通过前处理、高温液化、双酶分步酶解及醇提手段从鲟鱼软骨中得到具有醇溶性的软骨水解产物,以其对NO释放的抑制效果为分离评价指标,采用Sephadex G-15凝胶柱、ODS疏水层析柱对此水解产物进一步分离纯化,得到活性强、纯度高的醇溶性鲟鱼软骨抗炎肽；该肽组分对细胞活力未表现出明显影响,并能显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NO的释放；本发明在不完全破坏鲟鱼软骨原有加工路线的同时,有助于实现鲟鱼副产物高值化利用,具有广阔的市场前景。(The invention belongs to the field of high-value utilization of aquatic products, and relates to a preparation method of a functional alcohol-soluble sturgeon cartilage preparation; the method obtains the cartilage hydrolysate with alcohol solubility from the sturgeon cartilage by means of pretreatment, high-temperature liquefaction, double-enzyme stepwise enzymolysis and alcohol extraction, further separates and purifies the hydrolysate by using a Sephadex G-15 gel column and an ODS hydrophobic chromatographic column with the inhibiting effect on NO release as a separation evaluation index, and obtains the alcohol-soluble sturgeon cartilage anti-inflammatory peptide with strong activity and high purity; the peptide component has NO obvious influence on the cell activity, and can obviously inhibit the release of NO in RAW264.7 macrophage induced by LPS; the method provided by the invention is beneficial to realizing high-value utilization of sturgeon byproducts while not completely destroying the original processing route of the sturgeon cartilage, and has a wide market prospect.)
技术领域
本发明属于水产品高值化利用领域，具体涉及一种功能性醇溶鲟鱼软骨制剂的制备方法。
背景技术
生物活性肽是指在蛋白中含2-20个氨基酸残基的特殊片段，主要通过酶水解、胃肠道消化和发酵等手段从蛋白中释放出来，因其氨基酸序列、长度、组成及肽结构等不同而发挥抗高血压、免疫调节、抗氧化、抗癌、抗菌等功能性作用。
生物活性肽来源广泛，包括牛奶、鸡蛋、鱼、大米、大豆、豌豆、小球藻、螺旋藻、牡蛎和贻贝等。其中，鱼类在加工过程中会产生超过60％的副产物，包括皮肤(1-3％)、鱼鳞(5％)、头部(9-12％)、内脏(12-18％)、零碎的肌肉(15-20％)、肝脏、骨骼(9-15％)和鱼卵。这些副产物含有丰富的蛋白质，通常被加工成低市场价值的产品，如动物饲料、鱼粉和肥料。据估计，全世界每年平均产生1000万吨来自水产品和肉类(牛、猪和家禽)的废弃物，这不仅严重增加了经济成本，同时也易造成严峻的环境问题。因此，如何将此类副产物回收利用，并将其内在价值(生物活性物质)转化为具有较好经济潜力的新产品或者保健品是一个亟需解决的问题。
据《中国渔业统计年鉴2019》报道，2018年鲟鱼养殖产量比2017年增加了16.7％。然而，鲟鱼的大部分副产物并未得到充分利用，如被称为“鲨鱼翅、鲟鱼骨”的软骨。鲟鱼软骨占体重的5.7％，在加工过程中，多被废弃或者用于硫酸软骨素的粗提，对其中的蛋白却少有回收利用。因此，如何实现鲟鱼软骨的高效利用对鲟鱼的持续发展至关重要。并且目前关于鲟鱼软骨副产物抗炎活性的研究还较为少见。
发明内容
针对以上问题，本发明以NO抑制率为指标，从废弃软骨中制备出具有抗炎活性的肽。本发明首次利用鲟鱼废弃软骨的醇提酶解产物进行抗炎活性的分离纯化，其次对有效活性肽组分进行鉴定，得到两种具有抗炎潜能的新型多肽序列。
本发明制备方法包括如下步骤：
(1)前处理步骤：将鲟鱼的软骨通过加热煮沸处理，去除肉、脂质和筋膜，洗净沥干，利用低温真空斩拌机将软骨斩碎，得到鲟鱼软骨颗粒；
(2)热压液化：取步骤(1)中鲟鱼软骨颗粒于去离子水中进行液化处理，使软骨中的蛋白迁移到液体中，冷却后经均质处理，得到鲟鱼软骨热压提取物；
(3)酶解：用去离子水调整步骤(2)得到的鲟鱼软骨热压提取物的可溶性固体含量，得到混合溶液；混合溶液中可溶性固体含量的质量分数为1％-6％；在混合溶液中加入胰蛋白酶进行酶解，根据混合液中可溶性固体含量的含量加入胰蛋白酶，每1g可溶性固体含量加入0.13g胰蛋白酶，设定胰蛋白酶的酶解温度、pH进行振荡酶解，酶解后得到混合液E；
然后在混合溶液E中加入木瓜蛋白酶进行酶解，酶解条件如下：根据混合液中可溶性固体的含量加入木瓜蛋白酶，每1g可溶性固体加入0.1g木瓜蛋白酶，设定木瓜蛋白酶的酶解温度、pH，进行振荡酶解；酶解结束后，得到酶解液加热至一定温度灭活酶，然后冷却至室温，离心后收集上清液进行抽滤，经抽滤后得到的溶液进行低温冷冻干燥，得到的产物即为鲟鱼软骨酶解产物；
(4)醇提：将(3)中得到的鲟鱼软骨酶解产物用去离子水复溶，搅拌均匀得到混合溶液A，随后加入无水乙醇，得到混合溶液B，经静置、离心后，取上清液进行低压旋蒸以去除乙醇，收集溶液，经冷冻干燥处理后，得到的产物即为鲟鱼软骨醇溶性水解物；
(5)利用Sephadex G-15凝胶柱对步骤(4)中鲟鱼软骨醇溶性水解物进行纯化，以去离子水为洗脱液，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集纯化后的组分并冻干，得到冻干的组分；
(6)利用ODS疏水层析柱对步骤(5)中冻干的组分进一步纯化，以乙醇为流动相进行线性梯度洗脱，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集纯化后的组分，经低压旋蒸、冻干，得到的产物即为含有抗炎活性肽的醇溶鲟鱼软骨制剂；
优选的，步骤(2)中所述鲟鱼软骨颗粒与去离子水的质量比为1:(1-2.5)；所述液化温度为121℃，时间为90-120min。
优选的，步骤(3)中所述胰蛋白酶的酶解温度为37℃，酶解pH为7.0；所述振荡酶解的具体操作是：在恒温摇床中200rpm振荡酶解2h。
优选的，步骤(3)中所述木瓜蛋白酶的酶解温度为60℃，酶解pH为7.0；所述振荡酶解的具体操作是：在恒温摇床中200rpm振荡酶解2h。
优选的，步骤(3)中所述加热至一定温度为90℃，灭活酶的时间为20min；所述离心的条件为：4℃，10000rpm离心30min。
优选的：步骤(4)中，所述混合溶液A中酶解产物的浓度为20-200mg/mL，混合溶液B中乙醇的体积浓度为85％-95％；
优选的：步骤(4)中，所述静置是在4℃中静置24h；所述离心是在4℃、10000rpm离心30min。
优选的：所述步骤(5)中，所述纯化时上样的样品为醇溶性鲟鱼软骨水解物与去离子水的混合溶液，样品浓度为10-30mg/mL；所述柱规格为1.2cm×50cm-1.2cm×70cm，流速为0.8-1.2mL/min，上样体积为1-2mL；
优选的：所述步骤(6)中，所述纯化时上样的样品为冻干的组分与去离子水的混合溶液，样品浓度为5-10mg/mL；所述柱规格为1.2cm×50cm，流速为0.6-0.8mL/min，上样体积为1-2mL，洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，所述洗脱液A为10％乙醇水溶液，洗脱液B为纯乙醇溶液。
LC-MS/MS鉴定肽序：对(6)中含有抗炎活性肽的醇溶性鲟鱼软骨制剂进行鉴定和多肽序列分析，得到多种具有抗炎潜能的多肽，其中两种的氨基酸序列记为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
SEQ ID NO.1：Leu-Thr-Gly-Pro；
SEQ ID NO.2：Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro。
LC-MS/MS鉴定肽序方法：先对ODS-3进行还原烷基化，脱盐后经液质联用(LC-MS/MS)分析；液相色谱分析柱为Acclaim PepMap RPLC C18(150μm×150mm，1.9μm)，流动相A为：0.1％甲酸，2％乙腈(ACN)；为：0.1％甲酸，80％乙腈(ACN)；
流动相A与流动相B混合洗脱，洗脱程序如下：0-5min，流动相B的体积分数6％-9％；5-20min，流动相B的体积分数9％-14％；20-50min,流动相B的体积分数14％-30％；50-58min，流动相B的体积分数30％-40％；58-60min，流动相B的体积分数40％-95％。采用Denove的方法进行多肽序列解析；得到两种具有抗炎潜能的多肽。
本发明具有如下优点和有益效果：
(1)采用酶法制备活性肽，条件温和，能尽可能地保持其抗炎活性，醇沉部分仍能进一步加工生产硫酸软骨素；
(2)本发明结果显示，醇溶性鲟鱼软骨水解物具有抗炎效果，同时无明显的细胞毒害作用，经Sephadex G-15凝胶柱，ODS疏水层析纯化得到的肽与原始酶解产物相比，具有更强的抗炎活性；
(3)本发明首次从鲟鱼软骨中鉴定并得到两种新型具有抗炎潜能的多肽序列；
(4)本发明扩大了鲟鱼的应用范围，一方面实现了给予鲟鱼副产物高附加值，另一方面未来也有可能作为一种潜在的功能性因子，对食品、医药以及保健食品等行业的发展具有重要意义。
附图说明
图1为实施例5中醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的红外(A)、紫外(B)色谱图。
图2中A为实施例5中醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)对RAW264.7细胞活力影响的测定结果图；B为实施例5中醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7细胞NO释放量影响的测定结果图。
图3中A为实施例5中醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)经Sephadex G-15柱层析后得到的不同组分，经冷冻干燥处理后，得到鲟鱼软骨醇溶性水解物分别记为F1、F2、F3；
B为F1对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量影响的测定结果图；
C为F2对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量影响的测定结果图；
D为F3对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量影响的测定结果图。
图4中A为实施例5中醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)经ODS疏水层析柱层析后得到的不同组分，分别记为ODS-1、ODS-2、ODS-3、ODS-4：
B为ODS-1对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量影响的测定结果图；
C为ODS-2对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量影响的测定结果图；
D为ODS-3对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量影响的测定结果图；
E为ODS-4对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量影响的测定结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。
实施例1:
(1)鲟鱼废弃软骨沸水加热20min，剔除表面的肉、脂质和筋膜，用水冲洗后晾干，在4℃下利用低温斩拌机将软骨粉碎，得到鲟鱼软骨颗粒；
(2)称取鲟鱼软骨颗粒100g(蛋白含量为9.44％)，按1:2(w/w)的比例加入去离子水，进行液化处理，液化温度为121℃，时间为90min，使软骨中的蛋白迁移到液体中，冷却后使用匀浆机进行均质，30s/次，共3次，得鲟鱼软骨热压提取物；
(3)用去离子水调整步骤(2)得到的鲟鱼软骨热压提取物的蛋白质含量，得到混合溶液，调整混合溶液中可溶性固体的质量分数为6％，并根据混合液中可溶性固体含量的含量加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的质量分数为0.78％(每1g可溶性固体含量加入0.13g胰蛋白酶)，设定胰蛋白酶的酶解温度为37℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h，酶解后得到混合液E；然后在混合溶液E中加入木瓜蛋白酶进行酶解，同样根据混合液中可溶性固体的含量加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的质量分数为0.6％(每1g可溶性固体加入0.1g木瓜蛋白酶)，设定木瓜蛋白酶的酶解温度为60℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h；酶解结束后，得到酶解液加热至90℃持续20min灭活酶，然后通过冰浴快速冷却至室温，在4℃下，10000rpm离心30min，收集上清液进行抽滤，经抽滤后得到的溶液进行低温冷冻干燥，得到的产物即为鲟鱼软骨酶解产物；
(4)鲟鱼软骨酶解产物用去离子水复溶，浓度为20mg/mL，得到混合溶液A置于磁力搅拌器上，设置转速为500，至其完全溶解；随后加入无水乙醇，得到混合溶液B，使无水乙醇在混合溶液B中的体积分数为85％，在4℃中静置24h后，4℃、10000rpm离心30min，取上清液在液在45℃下低压旋蒸以除去乙醇，收集剩余液体冻干得醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)，进行NO释放的抑制效果测定；
通过CCK-8法测定所得醇溶性鲟鱼软骨水解物对细胞活力的影响，包括：将RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，对照组为不含ESCH的培养基，同时调零组设置为不含细胞仅含培养基，每个浓度设3个复孔。培养24h后，每孔加入10μL CCK-8工作液。孵育1h后，轻轻晃动后于450nm下测定吸光值。Griess法测定NO释放量，包括：将RAW264.7细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，预处理2h后加入LPS(终浓度为2μg/mL)继续培养22h。收集上清，利用NO试剂盒(Bytime公司)测定NO释放量，使用酶标仪在540nm处检测OD值，根据标准曲线计算细胞上清中的NO含量；
(5)使用Sephadex G-15凝胶色谱柱对醇溶性鲟鱼软骨水解物进行分离；纯化时的溶剂为去离子水；将冻干粉加入溶剂中溶解得到样品；柱规格1.2cm×70cm，上样量为1mL(上样浓度为30mg/mL)，流速为0.8mL/min，去离子水洗脱，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，冻干，得到冻干的组分；对不同组分作用后的NO释放量进行测定；
(6)使用ODS疏水层析柱对(5)中冻干的组分进一步分离纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为10％乙醇水溶液，洗脱液B为纯乙醇溶液，线性梯度洗脱；将(5)中的冻干粉溶解在10％乙醇水溶液中得到样品，上样量为1mL(上样浓度为10mg/mL)，流速为0.8mL/min，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，45℃下低压旋蒸以除去乙醇后冻干备用，对NO释放量进行测定，活性最高的分离亚组分即为醇溶性鲟鱼软骨制剂，经LC-MS/MS鉴定可得到鲟鱼软骨醇溶性抗炎活性肽。
实施例2:
(1)鲟鱼废弃软骨沸水加热20min，剔除表面的肉、脂质和筋膜，用水冲洗后晾干，在4℃下利用低温斩拌机将软骨粉碎得到鲟鱼软骨颗粒；
(2)称取鲟鱼软骨颗粒100g(蛋白含量为9.44％)，按1:2(w/w)的比例加入去离子水，进行液化处理，液化温度为121℃，时间为90min，使软骨中的蛋白迁移到液体中，冷却后使用匀浆机进行均质，30s/次，共3次，得鲟鱼软骨热压提取物；
(3)用去离子水调整步骤(2)得到的鲟鱼软骨热压提取物的蛋白质含量，得到混合溶液，调整混合溶液中可溶性固体的质量分数为1％，并根据混合液中可溶性固体含量的含量加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的质量分数为0.78％(每1g可溶性固体含量加入0.13g胰蛋白酶)，设定胰蛋白酶的酶解温度为37℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h，酶解后得到混合液E；然后在混合溶液E中加入木瓜蛋白酶进行酶解，同样根据混合液中可溶性固体的含量加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的质量分数为0.6％(每1g可溶性固体加入0.1g木瓜蛋白酶)，设定木瓜蛋白酶的酶解温度为60℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h；酶解结束后，得到酶解液加热至90℃持续20min灭活酶，然后通过冰浴快速冷却至室温，在4℃下，10000rpm离心30min，收集上清液进行抽滤，经抽滤后得到的溶液进行低温冷冻干燥，得到的产物即为鲟鱼软骨酶解产物；
(4)鲟鱼软骨酶解产物用去离子水复溶，浓度为200mg/mL，得到混合溶液A置于磁力搅拌器上，设置转速为500，至其完全溶解；随后加入无水乙醇，得到混合溶液B，使无水乙醇在混合溶液B中的体积分数为85％，在4℃中静置24h后，4℃、10000rpm离心30min，取上清液在45℃下低压旋蒸以除去乙醇，收集剩余液体冻干得醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)，进行NO释放的抑制效果测定；
通过CCK-8法测定所得醇溶性鲟鱼软骨水解物对细胞活力的影响，包括：将RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，对照组为不含ESCH的培养基，同时调零组设置为不含细胞仅含培养基，每个浓度设3个复孔。培养24h后，每孔加入10μL CCK-8工作液。孵育1h后，轻轻晃动后于450nm下测定吸光值。Griess法测定NO释放量，包括：将RAW264.7细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，预处理2h后加入LPS(终浓度为2μg/mL)继续培养22h。收集上清，利用NO试剂盒(Bytime公司)测定NO释放量，使用酶标仪在540nm处检测OD值，根据标准曲线计算细胞上清中的NO含量。
(5)使用Sephadex G-15凝胶色谱柱对醇溶性鲟鱼软骨水解物进行分离；纯化时的溶剂为去离子水；将冻干粉加入溶剂中溶解得到样品；柱规格1.2cm×50cm，上样量为1mL(上样浓度为10mg/mL)，流速为0.8mL/min，去离子水洗脱，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，冻干，得到冻干的组分；对不同组分作用后的NO释放量进行测定；
(6)使用ODS疏水层析柱对(5)中冻干的组分进一步分离纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为10％乙醇水溶液，洗脱液B为纯乙醇溶液，线性梯度洗脱。将(5)中的冻干粉溶解在10％乙醇水溶液中得到样品，上样量为2mL(上样浓度为5mg/mL)，流速为0.6mL/min，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，45℃下低压旋蒸以除去乙醇后冻干备用，对NO释放量进行测定，活性最高的分离亚组分即为醇溶性鲟鱼软骨制剂，经LC-MS/MS鉴定可得到鲟鱼软骨醇溶性抗炎活性肽。
实施例3:
(1)鲟鱼废弃软骨沸水加热20min，剔除表面的肉、脂质和筋膜，用水冲洗后晾干，在4℃下利用低温斩拌机将软骨粉碎得到鲟鱼软骨颗粒；
(2)称取鲟鱼软骨颗粒100g(蛋白含量为9.44％)，按1:2(w/w)的比例加入去离子水，进行液化处理，液化温度为121℃，时间为90min，使软骨中的蛋白迁移到液体中，冷却后使用匀浆机进行均质，30s/次，共3次，得鲟鱼软骨热压提取物；
(3)用去离子水调整步骤(2)得到的鲟鱼软骨热压提取物的蛋白质含量，得到混合溶液，调整混合溶液中可溶性固体的质量分数为4％，并根据混合液中可溶性固体含量的含量加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的质量分数为0.78％(每1g可溶性固体含量加入0.13g胰蛋白酶)，设定胰蛋白酶的酶解温度为37℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h，酶解后得到混合液E；然后在混合溶液E中加入木瓜蛋白酶进行酶解，同样根据混合液中可溶性固体的含量加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的质量分数为0.6％(每1g可溶性固体加入0.1g木瓜蛋白酶)，设定木瓜蛋白酶的酶解温度为60℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h；酶解结束后，得到酶解液加热至90℃持续20min灭活酶，然后通过冰浴快速冷却至室温，在4℃下，10000rpm离心30min，收集上清液进行抽滤，经抽滤后得到的溶液进行低温冷冻干燥，得到的产物即为鲟鱼软骨酶解产物；
(4)鲟鱼软骨酶解产物用去离子水复溶，浓度为100mg/mL，得到混合溶液A置于磁力搅拌器上，设置转速为500，至其完全溶解；随后加入无水乙醇，得到混合溶液B，使无水乙醇在混合溶液B中的体积分数为90％，在4℃中静置24h后，4℃、10000rpm离心30min，取上清液在液在45℃下低压旋蒸以除去乙醇，收集剩余液体冻干得醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)，NO释放的抑制效果测定；
通过CCK-8法测定所得醇溶性鲟鱼软骨水解物对细胞活力的影响，包括：将RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，对照组为不含ESCH的培养基，同时调零组设置为不含细胞仅含培养基，每个浓度设3个复孔。培养24h后，每孔加入10μL CCK-8工作液。孵育1h后，轻轻晃动后于450nm下测定吸光值。Griess法测定NO释放量，包括：将RAW264.7细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，预处理2h后加入LPS(终浓度为2μg/mL)继续培养22h。收集上清，利用NO试剂盒(Bytime公司)测定NO释放量，使用酶标仪在540nm处检测OD值，根据标准曲线计算细胞上清中的NO含量。
(5)使用Sephadex G-15凝胶色谱柱对醇溶性鲟鱼软骨水解物进行分离；纯化时的溶剂为去离子水；将冻干粉加入溶剂中溶解得到样品；柱规格1.2cm×70cm，上样量为1mL(上样浓度为20mg/mL)，流速为1.0mL/min，去离子水洗脱，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，冻干，得到冻干的组分；对不同组分作用后的NO释放量进行测定；
(6)使用ODS疏水层析柱对(5)中冻干的组分进一步分离纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为10％乙醇水溶液，洗脱液B为纯乙醇溶液，线性梯度洗脱。将(5)中的冻干粉溶解在10％乙醇水溶液中得到样品，上样量为1.5mL(上样浓度为7.5mg/mL)，流速为0.7mL/min，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，45℃下低压旋蒸以除去乙醇后冻干备用，对NO释放量进行测定，活性最高的分离亚组分即为醇溶性鲟鱼软骨制剂，经LC-MS/MS鉴定可得到鲟鱼软骨醇溶性抗炎活性肽。
实施例4:
(1)鲟鱼废弃软骨沸水加热20min，剔除表面的肉、脂质和筋膜，用水冲洗后晾干，在4℃下利用低温斩拌机将软骨粉碎得到鲟鱼软骨颗粒；
(2)称取鲟鱼软骨颗粒100g(蛋白含量为9.44％)，按1:2.5(w/w)的比例加入去离子水，进行液化处理，液化温度为121℃，时间为100min，使软骨中的蛋白迁移到液体中，冷却后使用匀浆机进行均质，30s/次，共3次，得鲟鱼软骨热压提取物；
(3)用去离子水调整步骤(2)得到的鲟鱼软骨热压提取物的蛋白质含量，得到混合溶液，调整混合溶液中可溶性固体的质量分数为5％，并根据混合液中可溶性固体含量的含量加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的质量分数为0.78％(每1g可溶性固体含量加入0.13g胰蛋白酶)，设定胰蛋白酶的酶解温度为37℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h，酶解后得到混合液E；然后在混合溶液E中加入木瓜蛋白酶进行酶解，同样根据混合液中可溶性固体的含量加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的质量分数为0.6％(每1g可溶性固体加入0.1g木瓜蛋白酶)，设定木瓜蛋白酶的酶解温度为60℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h；酶解结束后，得到酶解液加热至90℃持续20min灭活酶，然后通过冰浴快速冷却至室温，在4℃下，10000rpm离心30min，收集上清液进行抽滤，经抽滤后得到的溶液进行低温冷冻干燥，得到的产物即为鲟鱼软骨酶解产物；
(4)鲟鱼软骨酶解产物用去离子水复溶，浓度为20mg/mL，得到混合溶液A置于磁力搅拌器上，设置转速为500，至其完全溶解；随后加入无水乙醇，得到混合溶液B，使无水乙醇在混合溶液B中的体积分数为95％，在4℃中静置24h后，4℃、10000rpm离心30min，取上清液在液45℃下低压旋蒸以除去乙醇，收集剩余液体冻干得醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)，NO释放的抑制效果测定；
通过CCK-8法测定所得醇溶性鲟鱼软骨水解物对细胞活力的影响，包括：将RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，对照组为不含ESCH的培养基，同时调零组设置为不含细胞仅含培养基，每个浓度设3个复孔。培养24h后，每孔加入10μL CCK-8工作液。孵育1h后，轻轻晃动后于450nm下测定吸光值。Griess法测定NO释放量，包括：将RAW264.7细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，预处理2h后加入LPS(终浓度为2μg/mL)继续培养22h。收集上清，利用NO试剂盒(Bytime公司)测定NO释放量，使用酶标仪在540nm处检测OD值，根据标准曲线计算细胞上清中的NO含量。
(5)使用Sephadex G-15凝胶色谱柱对醇溶性鲟鱼软骨水解物进行分离；纯化时的溶剂为去离子水；将冻干粉加入溶剂中溶解得到样品；柱规格1.2cm×60cm，上样量为1.5mL(上样浓度为20mg/mL)，流速为1.2mL/min，去离子水洗脱，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，冻干，得到冻干的组分；对不同组分作用后的NO释放量进行测定；
(6)使用ODS疏水层析柱对(5)中冻干的组分进一步分离纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为10％乙醇水溶液，洗脱液B为纯乙醇溶液，线性梯度洗脱。将(5)中的冻干粉溶解在10％乙醇水溶液中得到样品，上样量为1mL(上样浓度为10mg/mL)，流速为0.8mL/min，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，45℃下低压旋蒸以除去乙醇后冻干备用，对NO释放量进行测定，活性最高的分离亚组分即为醇溶性鲟鱼软骨制剂，经LC-MS/MS鉴定可得到鲟鱼软骨醇溶性抗炎活性肽。
实施例5:
(1)鲟鱼废弃软骨沸水加热20min，剔除表面的肉、脂质和筋膜，用水冲洗后晾干，在4℃下利用低温斩拌机将软骨粉碎得到鲟鱼软骨颗粒；
(2)称取鲟鱼软骨颗粒100g(蛋白含量为9.44％)，按1:1(w/w)的比例加入去离子水，进行液化处理，液化温度为121℃，时间为90min，使软骨中的蛋白迁移到液体中，冷却后使用匀浆机进行均质，30s/次，共3次，得鲟鱼软骨热压提取物；
(3)用去离子水调整步骤(2)得到的鲟鱼软骨热压提取物的蛋白质含量，得到混合溶液，调整混合溶液中可溶性固体的质量分数为6％，并根据混合液中可溶性固体含量的含量加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的质量分数为0.78％(每1g可溶性固体含量加入0.13g胰蛋白酶)，设定胰蛋白酶的酶解温度为37℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h，酶解后得到混合液E；然后在混合溶液E中加入木瓜蛋白酶进行酶解，同样根据混合液中可溶性固体的含量加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的质量分数为0.6％(每1g可溶性固体加入0.1g木瓜蛋白酶)，设定木瓜蛋白酶的酶解温度为60℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h；酶解结束后，得到酶解液加热至90℃持续20min灭活酶，然后通过冰浴快速冷却至室温，在4℃下，10000rpm离心30min，收集上清液进行抽滤，经抽滤后得到的溶液进行低温冷冻干燥，得到的产物即为鲟鱼软骨酶解产物；
(4)鲟鱼软骨酶解产物用去离子水复溶，浓度为100mg/mL，得到混合溶液A置于磁力搅拌器上，设置转速为500，至其完全溶解；随后加入无水乙醇，得到混合溶液B，使无水乙醇在混合溶液B中的体积分数为85％，在4℃中静置24h后，4℃、10000rpm离心30min，取上清液在45℃下低压旋蒸以除去乙醇，收集剩余液体冻干得醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)，经测定在得到的醇溶性鲟鱼软骨水解物中，94.71％肽组分的分子量MW＜1.0kDa；
NO释放的抑制效果测定；
通过CCK-8法测定所得醇溶性鲟鱼软骨水解物对细胞活力的影响，包括：将RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，对照组为不含ESCH的培养基，同时调零组设置为不含细胞仅含培养基，每个浓度设3个复孔。培养24h后，每孔加入10μL CCK-8工作液。孵育1h后，轻轻晃动后于450nm下测定吸光值。Griess法测定NO释放量，包括：将RAW264.7细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，预处理2h后加入LPS(终浓度为2μg/mL)继续培养22h。收集上清，利用NO试剂盒(Bytime公司)测定NO释放量，使用酶标仪在540nm处检测OD值，根据标准曲线计算细胞上清中的NO含量。
(5)使用Sephadex G-15凝胶色谱柱对醇溶性鲟鱼软骨水解物进行分离；纯化时的溶剂为去离子水；将冻干粉加入溶剂中溶解得到样品；柱规格1.2cm×70cm，上样量为1mL(上样浓度为20mg/mL)，流速为0.8mL/min，去离子水洗脱，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，冻干，得到冻干的组分；对不同组分作用后的NO释放量进行测定；
(6)使用ODS疏水层析柱对(5)中冻干的组分进一步分离纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为10％乙醇水溶液，洗脱液B为纯乙醇溶液，线性梯度洗脱。将(5)中的冻干粉溶解在10％乙醇水溶液中得到样品，上样量为2mL(上样浓度为10mg/mL)，流速为0.8mL/min，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，45℃下低压旋蒸以除去乙醇后冻干备用，对NO释放量进行测定，活性最高的分离亚组分即为醇溶性鲟鱼软骨制剂，经LC-MS/MS鉴定可得到鲟鱼软骨醇溶性抗炎活性肽。
实施例6:
(1)鲟鱼废弃软骨沸水加热20min，剔除表面的肉、脂质和筋膜，用水冲洗后晾干，在4℃下利用低温斩拌机将软骨粉碎，得到鲟鱼软骨颗粒；
(2)称取鲟鱼软骨颗粒100g(蛋白含量为9.44％)，按1:1.5(w/w)的比例加入去离子水，进行液化处理，液化温度为121℃，时间为90min，使软骨中的蛋白迁移到液体中，冷却后使用匀浆机进行均质，30s/次，共3次，得鲟鱼软骨热压提取物；
(3)用去离子水调整步骤(2)得到的鲟鱼软骨热压提取物的蛋白质含量，得到混合溶液，调整混合溶液中可溶性固体的质量分数为6％，并根据混合液中可溶性固体含量的含量加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的质量分数为0.78％(每1g可溶性固体含量加入0.13g胰蛋白酶)，设定胰蛋白酶的酶解温度为37℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h，酶解后得到混合液E；然后在混合溶液E中加入木瓜蛋白酶进行酶解，同样根据混合液中可溶性固体的含量加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的质量分数为0.6％(每1g可溶性固体加入0.1g木瓜蛋白酶)，设定木瓜蛋白酶的酶解温度为60℃，pH为7.0，200rpm各振荡酶解2h；酶解结束后，得到酶解液加热至90℃持续20min灭活酶，然后通过冰浴快速冷却至室温，在4℃下，10000rpm离心30min，收集上清液进行抽滤，经抽滤后得到的溶液进行低温冷冻干燥，得到的产物即为鲟鱼软骨酶解产物；
(4)鲟鱼软骨酶解产物用去离子水复溶，浓度为100mg/mL，得到混合溶液A置于磁力搅拌器上，设置转速为500，至其完全溶解；随后加入无水乙醇，得到混合溶液B，使无水乙醇在混合溶液B中的体积分数为85％，在4℃中静置24h后，4℃、10000rpm离心30min，取上清液在45℃下低压旋蒸以除去乙醇，收集剩余液体冻干得醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)，NO释放的抑制效果测定；
通过CCK-8法测定所得醇溶性鲟鱼软骨水解物对细胞活力的影响，包括：将RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，对照组为不含ESCH的培养基，同时调零组设置为不含细胞仅含培养基，每个浓度设3个复孔。培养24h后，每孔加入10μL CCK-8工作液。孵育1h后，轻轻晃动后于450nm下测定吸光值。Griess法测定NO释放量，包括：将RAW264.7细胞接种于96孔板，细胞密度调整为1×105个/孔，每孔体积为100μL，在5％CO2、37℃培养箱中过夜培养。将培养基换为含有浓度为12.5-800μg/mL醇溶性鲟鱼软骨水解物(ESCH)的培养基，预处理2h后加入LPS(终浓度为2μg/mL)继续培养22h。收集上清，利用NO试剂盒(Bytime公司)测定NO释放量，使用酶标仪在540nm处检测OD值，根据标准曲线计算细胞上清中的NO含量。
(5)使用Sephadex G-15凝胶色谱柱对醇溶性鲟鱼软骨水解物进行分离；纯化时的溶剂为去离子水；将冻干粉加入溶剂中溶解得到样品；柱规格1.2cm×60cm，上样量为1mL(上样浓度为30mg/mL)，流速为1.0mL/min，去离子水洗脱，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，冻干，得到冻干的组分；对不同组分作用后的NO释放量进行测定；
(6)使用ODS疏水层析柱对(5)中冻干的组分进一步分离纯化，柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为10％乙醇水溶液，洗脱液B为纯乙醇溶液，线性梯度洗脱。将(5)中的冻干粉溶解在10％乙醇水溶液中得到样品，上样量为1mL(上样浓度为10mg/mL)，流速为0.7mL/min，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集组分，45℃下低压旋蒸以除去乙醇后冻干备用，对NO释放量进行测定，活性最高的分离亚组分即为醇溶性鲟鱼软骨制剂，经LC-MS/MS鉴定可得到鲟鱼软骨醇溶性抗炎活性肽。
图1为实施例5中鲟鱼醇溶性水解产物(ESCH)的紫外、红外色谱图，结果表明ESCH具有典型的多肽结构。
图2为实施例5中鲟鱼醇溶性水解产物(ESCH)对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞活力及其处理LPS诱导RAW264.7细胞NO释放量测定结果。结果表明：当ESCH浓度为12.5-800μg/mL范围内无细胞毒害作用，且在50μg/mL浓度时能显著抑制经LPS诱导的小鼠巨噬细胞中NO的释放。
图3为ESCH经Sephadex G-15凝胶过滤层析后各组分处理LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量测定结果。与其他两个组分相比，F3显著降低了NO的释放量，可能是由于主要分子量较小的肽，其抗炎作用更强。
图4为图2中F3组分经ODS疏水层析分离后各组分对LPS诱导处理的RAW264.7细胞NO释放量的影响。其中，ODS-3(200μg/mL)较于同浓度下其他组分有更高的抑制率，表明其具有较好的潜在抗炎效果，即为本发明所述的含有抗炎活性肽的醇溶性鲟鱼软骨制剂。
表1为图2中鲟鱼醇溶性水解产物(ESCH)的分子量分布。
结果表明，ESCH中90％以上均小于1k Da。
表2为图4中ODS-3组分中两种抗炎肽序列。
以上实施例仅用以说明本发明，而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种功能性醇溶鲟鱼软骨制剂的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Thr Gly Pro
1
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro
1 5