具体实施方式

定义

本文所用术语“神经系统”包括中枢神经系统及外周神经系统两者。

术语“阿米洛利类似物”包括阿米洛利的结构类似物、阿米洛利的功能类似物或其组合。

术语“中枢神经系统”或“CNS”包括脊椎动物的脑及脊髓的所有细胞及组织。

术语“外周神经系统”是指神经系统除脑及脊髓之外的部分的所有细胞及组织，例如介导自主运动的运动神经元、调节非自主功能的自主神经系统(包括交感神经系统及副交感神经系统)以及控制胃肠系统的肠神经系统。因此，术语“神经系统”包括但不限于神经元细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、脑脊液(cerebrospinal fluid；CSF)中的细胞、间质中的细胞、脊髓的保护层(protective covering)中的细胞、硬膜外细胞(即，硬脑膜外的细胞)、邻近神经组织或与神经组织接触或受神经组织支配的非神经组织中的细胞、神经外膜、神经束膜、神经内膜、神经索、神经束等中的细胞。

本文所用术语“患者”涵盖所有哺乳动物物种。

本文所用术语“治疗(treating或treatment)”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病状态的治疗，并且包括：(a)抑制疾病状态，即阻止疾病发展；及/或(b)缓解疾病状态，即，导致疾病状态的消退。

本文所用“预防(prophylaxis或prevention)”涵盖对哺乳动物特别是人的亚临床疾病状态的预防性治疗，其目的在于降低临床疾病状态发生的概率。根据已知与普通人群相比会增加罹患临床疾病状态风险的因素，选择患者进行预防性治疗。“预防”疗法可分为(a)一级预防及(b)二级预防。一级预防的定义是对尚未表现出临床疾病状态的个体进行治疗，而二级预防的定义是防止相同或相似临床疾病状态的第二次发生。

本文所用术语“风险降低”涵盖降低临床疾病状态发展的发生率的疗法。因此，一级预防治疗及二级预防治疗是风险降低的例子。

本文所用短语“预防有效量”旨在包括本申请中所述可有效预防或降低TIA发病率的ASIC1a抑制剂及/或抗凝血剂的量。当应用于组合时，所述术语指产生预防作用的活性成分的组合量，无论是以组合形式施用、连续施用或同时施用。

本文所用短语“治疗有效量”旨在包括本申请中所述可有效治疗患有TIA的个体及/或可有效预防及/或降低中风的发病率的ASIC1a抑制剂及/或抗凝血剂的量。当应用于组合时，所述术语指产生预防或治疗效果的活性成分的组合量，无论是以组合形式施用、连续施用还是同时施用。

本文所用术语“血栓形成”是指血栓(thrombus，复数形式为thrombi)的形成或存在：血管内可引起由血管供血的组织的缺血或梗塞的凝血。

本文所用术语“栓塞”是指被血流带到其驻留位置的凝块或异物突然阻塞动脉。

本文所用的术语“血栓栓塞”是指被血流从起源部位携带的血栓形成物质堵塞另一血管而造成的血管阻塞。

术语“血栓栓塞性疾病”包括“血栓性”疾病及“栓塞性”疾病(如上定义)两者。

本文所用术语“血栓栓塞性疾病”包括动脉心血管血栓栓塞性疾病、静脉心血管或脑血管血栓栓塞性疾病以及心腔或外周循环中的血栓栓塞性疾病。本文所用术语“血栓栓塞性疾病”还包括选自但不限于下列的具体疾病：不稳定型心绞痛或其他急性冠脉综合征、房颤、首次或复发性心肌梗死、缺血性猝死、短暂性脑缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞性动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉血栓形成、大脑动脉血栓形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞、心脏瓣膜病、室颤以及由于血液暴露于促进血栓形成的人造表面的医学植入体、器械或手术所导致的血栓形成。

本申请提供了用于预防、治疗短暂性脑缺血发作(TIA)或缺血性中风及/或降低其风险的方法及组合物。

本申请的一个方面涉及一种用于在有发生TIA风险的个体中预防或降低TIA发病率的方法，所述方法包括向所述个体口服施用预防有效量的包括能够穿透血脑屏障的ASIC1a抑制剂的医药组合物。

ASIC抑制剂、阿米洛利及阿米洛利类似物

本文所用术语“ASIC1a”是指来自任何物种的ASIC1a蛋白或通道。表述“ASIC1a抑制剂”是指一种抑制酸敏感离子通道1a(acid sensing ion channel 1a；ASIC1a)的产品。例如，在沃尔德曼R.(Waldmann,R.)等人，1997，自然(Nature)386，第173至177页中所描述的示例性人ASIC1a蛋白/通道。

ASIC1a抑制剂在ASIC家族内可具有选择性。本文所用ASIC1a的选择性抑制是指在将ASIC1a及其他ASIC家族成员各自暴露于相同(亚最大)浓度的抑制剂后进行比较时(例如，在培养细胞中)，对ASIC1a的抑制比对其他ASIC家族成员实质上更强。相对于至少一个其他ASIC家族成员(ASIClb、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4等)及/或相对于每一个其他的ASIC家族成员，抑制剂可选择性地抑制ASIC1a。选择性抑制剂的抑制强度可用相对于不同的ASIC家族成员，发生抑制时的抑制剂浓度(例如，IC₅₀(产生最大抑制的50％时的抑制剂浓度)或K_i值(抑制常数或解离常数))来描述。相比于抑制至少一个其他ASIC家族成员或每一个其他ASIC家族成员，ASIC1a选择性抑制剂可在低至少约两倍、四倍或十倍的浓度(浓度的一半、四分之一或十分之一或更低)下抑制ASIC1a活性。因此，相比于抑制至少一个其他ASIC家族成员及/或抑制每一个其他ASIC家族成员，ASIC1a选择性抑制剂对ASIC1a抑制的IC₅₀及/或K_i可低至少约两倍、四倍、十倍或二十倍(浓度的一半、四分之一、十分之一、二十分之一或更低)。

因此，ASIC1a特异性抑制剂对ASIC1a的IC₅₀及/或K_i相对于ASIC家族的每一个其他成员可至少低约20倍(5％或更低)，使得例如对其他ASIC家族成员的抑制至少实质上(或完全)不可检测。在一些实施例中，与任何市售阿米洛利相关的ASIC1a抑制剂相比，ASIC1a选择性抑制剂对同源多聚(homomeric)ASIC1a通道的效力增加，且水溶解度增加。

在一个实施例中，ASIC1a抑制剂选自由阿米洛利、阿米洛利类似物及其医药上可接受的盐或溶剂化物所组成的群组。

在一个实施例中，ASIC1a抑制剂为阿米洛利或其医药上可接受的盐或溶剂化物。阿米洛利是一种含胍基的吡嗪衍生物，已用于治疗轻度高血压，报告的副作用很少。阿米洛利发挥作用的机制是直接阻断上皮钠通道(epithelial sodium channel；ENaC)，从而抑制肾脏中晚期远曲小管、连接小管及集合管中的钠重吸收。这促进了钠及水从身体的损耗，但没有消耗钾。本文所用术语“阿米洛利”指阿米洛利及阿米洛利的盐(如盐酸阿米洛利)两者。

在另一实施例中，ASIC1a抑制剂是阿米洛利类似物或其医药上可接受的盐或溶剂化物。本文所用阿米洛利类似物是指具有与阿米洛利相似的生物活性但化学结构略有改变的化合物。

在一些实施例中，阿米洛利类似物不阻断人Na⁺/Ca²⁺离子交换器。在其他实施例中，阿米洛利类似物是Na⁺/Ca²⁺离子交换器的弱抑制剂，有助于维持低水平的细胞内Ca²⁺。在其他实施例中，阿米洛利类似物是Na⁺/Ca²⁺离子交换器的非常弱的抑制剂，IC₅₀为1.1mM或更小。在其他实施例中，阿米洛利类似物不阻断ASIC2a及/或ASIC3通道。在一个实施例中，阿米洛利类似物对ASIC1a的选择性高于ASIC3通道及/或ASIC2通道。

用于本申请的示例性阿米洛利类似物包括但不限于苯扎米尔、苄普地尔、KB-R7943、非那米尔、5-(N-N-二甲基)阿米洛利(DMA)、5-(N,N-六亚甲基)阿米洛利(HMA)、5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利(EIPA)、5-(N-甲基-N-异戊基)阿米洛利(MIA)、其医药上可接受的盐或溶剂化物、其甲基化类似物及其组合。

在一些实施例中，阿米洛利类似物在C₅-NH₂位及/或胍基上具有疏水取代基，如图21所示。在其他实施例中，阿米洛利类似物选自由苯扎米尔的甲基化类似物、含有在胍基上形成的环的阿米洛利类似物、含有酰基胍基的阿米洛利类似物及含有在胍基上形成的水增溶基团的阿米洛利类似物所组成的群组，其中水增溶基团为N,N-二甲基氨基或糖基。

可使用任何合适的ASIC抑制剂或抑制剂的组合。例如，一个体可接受ASIC1a选择性抑制剂及非选择性ASIC抑制剂治疗，或者接受ASIC1a选择性抑制剂及非ASIC通道蛋白(例如非ASIC钙通道)的抑制剂治疗。在一些实施例中，一个体可接受ASIC1a选择性抑制剂及NMDA受体抑制剂(如谷氨酸拮抗剂)治疗。

在其他实施例中，ASIC1a抑制剂是肽。所述肽可具有任何合适数目的氨基酸残基，通常至少约十个，但少于一千个残基，更通常少于一百个残基。在一些实施例中，肽可具有胱氨酸结基序(cystine knot motif)。本文所用胱氨酸结通常包括六个或更多个半胱氨酸的排列。具有这些半胱氨酸的肽可产生“结”，包括(1)由两个二硫键及它们连接主链的片段形成的环，及(2)穿过所述环的第三个二硫键。在一些实施例中，所述肽可为来自蛛型纲及/或芋螺物种的芋螺毒素。例如，所述肽可为PcTxl(狼蛛毒素1(psalmotoxin 1))，一种来自狼蛛(里达老虎尾蜘蛛(Psalmopoeus Cambridgei)(Pc))的毒素。在其他实施例中，所述肽可为来自澳大利亚漏斗网蜘蛛(达令唐斯漏斗网蜘蛛(Hadronyche infensa))的四种富含二硫化物的蜘蛛毒液肽(即，Hi1a、Hi1b、Hi1c、Hi1d)之一，其包括由短连接子所连接的两个串联PcTxl样序列。

在一些实例中，所述肽可在结构上与PcTxl相关，所述肽与PcTxl在至少一删除、插入及/或一个或多个氨基酸的取代上不同。例如，所述肽可具有与PcTxl至少约25％或至少约50％的序列同一性，及/或至少约25％或至少约50％的序列相似性(见下文)。下文实例3中描述了可适合作为抑制剂的肽的其他方面。

用于比较以及产生同一性及相似性得分的氨基酸序列的比对方法在本领域中众所周知。可能适用的示例性比对方法包括史密斯及沃特曼(Smith and Waterman)的(最佳拟合(Best Fit))、尼德曼及温斯迟(Needleman and Wunsch)的同源性比对算法(homologyalignment algorithm；GAP)、皮尔森及里普曼(Pearson and Lipman)的相似性方法(Tfasta及Fasta)及/或类似方法。这些方法及其他可适用的方法的计算机算法包括但不限于：CLUSTAL、GAP、BESTFIT、BLASTP、FASTA及TFASTA。

如本文所用，在两种肽语境中的“序列同一性”或“同一性”涉及当为了得到最大对应而进行比对时，相应肽序列中相同的残基的百分比。在一些实例中，不完全相同的肽残基位置可因保守的氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基所取代，因此预期对分子的功能性质产生较小的影响(或没有影响)。如果序列是在保守取代方面不同，可向上调整序列同一性百分比，以给出序列的“相似性”，该校正是为了取代的保守性性质。例如，可将每个保守性取代评分为部分不匹配，而非完全不匹配，从而校正百分比序列同一性以提供相似性评分。用以获得相似性评分的保守性取代的评分在本领域中是众所周知的，且可通过任何合适的方法来计算，例如，根据迈耶斯及米勒(Meyers and Miller)的算法，计算机应用生物科学(Computer Applic.BiolSci.)4：11-17(1988)，例如，如PC/GENE项目(智能基因公司(Intelligenetics)，山景城，加利福尼亚州，美国)中所实施。

抗凝血剂

另一方面，包括一种或多种ASIC1a抑制剂的医药组合物进一步包括一种或多种抗凝血剂。用于本申请的抗凝血剂包括抗血小板剂、抗凝剂、抗心律不齐药或其组合。这些抗凝血剂的使用可进一步联合地或协同地增加向有需要的个体施用的ASIC1a抑制剂的预防及/或治疗效果。

在一个实施例中，医药组合物进一步包括一种或多种抗血小板剂。示例性的抗血小板剂包括但不限于COX抑制剂、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate；ADP)受体抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、糖蛋白IIb/IIIa抑制剂、腺苷再摄取抑制剂、血栓烷抑制剂及其组合。一些抗血小板剂有多种作用模式，详见下文所罗列内容。

COX抑制剂包括乙酰水杨酸(例如，阿司匹林)及三氟柳(trifusal)(例如，地尔伦(Disgren)、格伦迪斯(Grendis)、阿弗伦(Aflen)及三氟拉克柳(Triflux))，其不可逆地抑制COX-1酶、前列腺素内过氧化物合成酶-1(即，COX-1或PTGS1)并修饰COX-2酶(即，COX-2或PTGS2)的酶活性，以及靶向COX-2/PTGS2的可逆COX-2抑制剂，例如塞来昔布(例如，西乐葆(Celebrex))。

用于本申请的腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂包括P2Y₁₂ ADP受体的可逆或不可逆的拮抗剂。示例性的ADP受体抑制剂包括噻吩并吡啶类，例如不可逆的P2Y₁₂抑制剂普拉格雷、氯吡格雷(例如，波立维(Plavix))及可逆的P2PY₁₂抑制剂，例如替卡格雷(例如，倍林达(Brilinta))。

用于本申请的磷酸二酯酶抑制剂包括但不限于双嘧达莫(例如潘生丁(Persantine))、西洛他唑(cilostazol)(例如，培达(Pletal))、三氟柳(例如，地尔伦(Disgren)、格伦迪斯(Grendis)、阿弗伦(Aflen)及三氟拉克(Triflux))以及沃拉帕沙(vorapaxar)(例如，赞提维替(Zontivity))。

用于本申请的糖蛋白IIb/IIIa抑制剂包括但不限于阿昔单抗(abciximab)(例如，ReoPro)、依替巴肽(eptifibatide)(例如，伊泰格林(Integrilin)、伊非曲班(ifetroban)、伊洛前列素(iloprost)、异卡巴环素甲酯(isocarbacyclin methyl ester)、伊他格雷(itazigrel)、拉米非班(lamifiban)、利法利嗪(lifarizine)、吗多明(molsidomine)、硝苯地平(nifedipine)、奥波非班(orbofiban)、氧格雷酯(oxagrelate)、罗昔非班(roxifiban)及替罗非班(tirofiban)(艾卡特(Aggrastat))。

在本申请中使用的腺苷再摄取抑制剂包括但不限于阿卡地新(acadesine)、乙酸盐、巴比妥类、苯并二氮卓类(benzodiazepines)、钙通道抑制剂、卡马西平(carbamazepine)、卡立普多(carisoprodol)、西洛他唑(培达)、环苯扎林(cyclobenzaprine)、地拉卓(dilazep)、雌二醇、乙醇、氟马西尼(flumazenil)、海索苯定(hexobendine)、羟嗪、吲哚美辛、肌苷、KF24345、甲丙氨酯、硝基苄基硫鸟苷、硝基苄基硫肌苷、罂粟碱、己酮可可碱、吩噻嗪类、苯妥英、黄体酮、丙戊茶碱、丙泊酚、嘌呤霉素、R75231、RE 102 BS、索罗拉嗪(soluflazine)、非加霉素、曲卡唑酯(tracazolate)及三环抗抑郁药。

用于本申请的血栓烷抑制剂抑制血栓烷的合成及/或抑制血栓烷的靶向作用。示例性血栓烷抑制剂包括但不限于乙酰水杨酸(例如，阿司匹林)、双嘧达莫、伊非曲班、萘普生(naproxen)、吡考他胺(picotamide)、利多格雷(ridogrel)、磺曲苯、特鲁曲班(terutroban)、噻氯匹定(ticlopidine)、曲匹地尔、曲克匹定(triclopidine)、三苯格雷、三氟柳(例如，地尔伦、格伦迪斯、阿弗伦及三氟拉克)及三亚麻油酸甘油酯。

在另一实施例中，医药组合物进一步包括一种或多种抗凝剂。在特定实施例中，抗凝剂为维生素K环氧化物还原酶抑制剂。在其他实施例中，抗凝剂为直接因子Xa抑制剂、间接因子Xa抑制剂、直接凝血酶抑制剂或间接凝血酶抑制剂(统称为直接口服抗凝剂(directoral anticoagulant；DOAC)或非维生素K拮抗剂(non-VKA)口服抗凝剂)。与本申请的ASIC1a抑制剂联合使用的维生素K环氧化物还原酶抑制剂包括4-羟基香豆素衍生物及1,3-茚满二酮衍生物。示例性维生素K环氧化物还原酶抑制剂包括但不限醋硝香豆醇(例如，新抗凝(Sintrom)及心得隆(Sinthrome))、茴茚二酮、氯茚二酮、香豆素、可迈丁(例如，华法林)、双香豆素(dicumarol)及其衍生物(例如，双-羟基香豆素(bis-hydroxycoumarin)、双羟基香豆素(bishydroxycoumarin)、双香豆素(dicoumarin)、双羟香豆素(dicoumarol))、双硫仑、双香豆素乙酯、N-乙基马来酰亚胺、氟茚二酮、苯茚二酮(例如，丁德万(Dindevan))、苯丙香豆素(例如，苯丙香豆素(Marcoumar)、类双香豆素(Marcumar)及法利斯(Falithrom))、1-N-甲基-5-硫代四唑、5,5’-二硫代双(l-甲基四唑)、其医药上可接受的盐及溶剂化物及其组合。

用于本申请的非维生素K拮抗剂口服抗凝剂(Non-VKA oral anticoagulant；NOAC)包括直接因子Xa抑制剂，如阿哌沙班(例如，艾乐妥(Eliquis))、依度沙班(例如，萨瓦萨(Savaysa)、李夏娜(Lixiana))、利伐沙班(例如，拜瑞妥(Xarelto))、贝曲西班(例如，贝维克萨(Bevyxxa))及YM466；直接凝血酶抑制剂(或因子IIa抑制剂)，如AZD-0837、达比加群(例如，泰毕全(Pradaxa)、百达生(Pradax)及普栓达(Prazaxa))、希美加群(如，艾云挞(Exanta))及美拉加群(希美加群的活性形式)；间接因子Xa抑制剂，例如磺达肝癸钠(fondaparinux)(例如，阿瑞莎(Arixtra))、超低分子量肝素(ultralow molecular weightheparin；ULMWH)；间接凝血酶抑制剂，例如肝素、抗凝血酶、肝素与抗凝血酶的组合、依诺肝素(enoxaparin)(例如，克赛(Lovenox))、低分子量肝素(low molecular weight heparin；LMWH)、达肝素钠(例如，法安明(Fragmin))、巴曲酶及吻蛭素(hementin)；包括其盐及溶剂化物及其组合。

在另一实施例中，用于本申请的医药组合物进一步包括一种或多种抗心律不齐药。示例性抗心律不齐药包括胺碘酮、AZD-1305、布碘酮、塞利瓦隆、多非利特、决奈达隆、伊布利特、氟卡尼、普罗帕酮、奎尼丁、索他洛尔、维那卡兰及其组合。

任何单一、多种抗凝剂、其盐、其溶剂化物及其衍生物或抗凝剂、其盐、其溶剂化物及其衍生物的组合可用于调节抗凝血功能，在不背离本申请的情况下包括本文未提及的其他抗凝剂。

抑制剂施用

ASIC1a抑制剂及/或其他抗凝血剂的施用可进行一次或多次，且可在相应于TIA诊断的任何合适时间进行，以减轻再一次发生TIA及/或中风的风险。因此，施药可在检测到TIA前(例如，预防性地)或检测到TIA之后、在轻微缺血发作之后、在慢性缺血期间、在全中风(full stroke)之后及/或类似情况下进行。

在优选实施例中，本申请的ASIC1a抑制剂及/或抗凝血剂是以预防有效量(或简称“有效量”)口服施用。本文所用的预防有效量或有效量的抑制剂或药剂是当对个体施药时，在显著数目的个体中降低个体的短暂性脑缺血发作(TIA)的程度、发病率及/或范围的任何量的抑制剂或药剂。因此，预防有效量可(例如)在将各种量的抑制剂施用予个体(且通常与对照组个体相比)的临床研究中确定。或者，一种或多种抗凝血剂可以治疗有效量施用及/或可以静脉内、肌内、鞘内或脑室内方式施用。

在一些实施例中，将ASIC1a抑制剂及/或抗凝血剂单独或组合配制成以下列范围内的一个或多个剂量以用于每日施用：0.01至30毫克/公斤体重、0.01至10毫克/公斤体重、0.01至3毫克/公斤体重、0.01至1毫克/公斤体重、0.01至0.3毫克/公斤体重、0.01至0.1毫克/公斤体重、0.01至0.03毫克/公斤体重、0.03至30毫克/公斤体重、0.03至10毫克/公斤体重、0.03至3毫克/公斤体重、0.03至1毫克/公斤体重、0.03至0.3毫克/公斤体重、0.03至0.1毫克/公斤体重、0.1至30毫克/公斤体重、0.1至10毫克/公斤体重、0.1至3毫克/公斤体重、0.1至1毫克/公斤体重、0.1至0.3毫克/公斤体重、0.3至30毫克/公斤体重、0.3至10毫克/公斤体重、0.3至3毫克/公斤体重、0.3至1毫克/公斤体重、1至30毫克/公斤体重、1至10毫克/公斤体重、1至3毫克/公斤体重、3至30毫克/公斤体重、3至10毫克/公斤体重或10至30毫克/公斤体重。

在其他实施例中，将ASIC1a抑制剂及/或其他抗凝血剂单独或组合以下列范围内的一种或多种剂量配制：0.1至1000毫克/剂、0.1至300毫克/剂、0.1至100毫克/剂、0.1至30毫克/剂、0.1至10毫克/剂、0.1至3毫克/剂、0.1至1毫克/剂、0.1至0.3毫克/剂、0.3至1000毫克/剂、0.3至300毫克/剂、0.3至100毫克/剂、0.3至30毫克/剂、0.3至10毫克/剂、0.3至3毫克/剂、0.3至1毫克/剂、1至1000毫克/剂、1至300毫克/剂、1至100毫克/剂、1至30毫克/剂、1至10毫克/剂、1至3毫克/剂、3至1000毫克/剂、3至300毫克/剂、3至100毫克/剂、3至30毫克/剂、3至10毫克/剂、10至1000毫克/剂、10至300毫克/剂、10至100毫克/剂、10至30毫克/剂、30至1000毫克/剂、30至300毫克/剂、30至100毫克/剂、100至1000毫克/剂、100至300毫克/剂、或300至1000毫克/剂。

抑制剂可以任何合适的形式及在任何合适的组合物中施用于个体。在一些实施例中，抑制剂可配置为医药上可接受的盐或溶剂化物。组合物可配制成包括(例如)流体载体/溶剂(媒剂)、防腐剂、一种或多种赋形剂、着色剂、调味剂、盐、消泡剂及/或类似物。当施用于有发生TIA或中风风险的个体时，抑制剂可在媒剂中以提供预防或治疗有效量的用于预防或治疗TIA的抑制剂的浓度存在。

在一些实施例中，使用具有更高水溶性或脂溶性的阿米洛利类似物。例如，阿米洛利类似物可在胍基上含有水增溶基团，例如N,N-二甲基氨基或糖，以改善水溶性(图24的化学式13-16)。在一些实施例中，阿米洛利类似物的水溶性为5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM或更高。在其他实施例中，阿米洛利类似物的溶解度使得其能够以10毫克、25毫克、50毫克、100毫克、150毫克、200毫克、250毫克、300毫克、400毫克或500毫克的剂量口服施药。

通常，本申请的医药组合物包括一种或多种医药上可接受的载体。本文所用“医药上可接受的载体”包括任何及所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗及吸收延迟剂、甜味剂等。医药上可接受的载体可由多种材料制备，包括但不限于调味剂、甜味剂及制备特定治疗组合物可能需要的例如缓冲剂及吸收剂等各种材料。这类介质及试剂与医药活性物质一起使用在本领域中众所周知。任何传统介质或试剂在预防或治疗组合物中的使用也在考虑之列，但如与活性成分不相容则属例外。视需要地，阿米洛利及/或阿米洛利类似物可与其他活性成分联合用药，所述其他活性成分的使用不与ASIC1a抑制剂(包括阿米洛利及/或其类似物)有禁忌，且进一步增加ASIC1a抑制剂的预防及/或治疗疗效。

在优选实施例中，医药组合物是配制成适于口服施药。在特定实施例中，医药组合物是以干燥形式提供，并配制成片剂或胶囊形式。片剂可采用本领域熟知的固体载体按照传统方法配制。本发明中使用的硬胶囊及软胶囊可由任何医药上可接受的材料制成，例如明胶或纤维素衍生物。

在其他实施例中，将所述医药组合物配制成适于静脉注射、肌内注射、鞘内注射或脑室内注射。适于注射使用的医药组合物包括无菌水溶液(如果可溶于水)或分散液以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)^TM(巴斯夫(BASF)，帕西波尼(Parsippany)，新泽西)或磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline；PBS)。在所有情况下，可注射组合物都是无菌的，且其流动性达到易于注射的程度。可注射组合物优选在制造及储存条件下是稳定的，且其保存可抵抗微生物例如细菌及真菌的污染作用。

载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可例如通过使用卵磷脂等包衣、在为分散液的情况下通过保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持。通过各种抗细菌剂及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可防止微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇类(如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括例如单硬脂酸铝及明胶等延迟吸收的试剂来实现。

无菌注射液可通过将所需量的活性剂溶于适当溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒剂中来制备分散液，所述媒剂含有基本分散介质及来自以上所列举物质的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥及冷冻干燥，由先前无菌过滤的溶液得到由活性成分加上任何额外所需成分所构成的粉末。

在某些实施例中，医药组合物是配制成适于组合物中ASIC1a抑制剂及/或抗凝血剂的控释。控释制剂可设计为立即释放、缓释、延迟释放或其组合。缓释，也称为持续释放、长效释放或定时释放、控释(controlled-release；CR)、修饰释放(modified release；MR)或连续释放(continuous-release；CR，或Contin)，其提供了一种机制，使一种或多种活性剂可随时间缓慢释放(通常将一种或多种活性剂包括在片剂或胶囊的口服制剂中，从而随时间缓慢溶解并释放活性成分)。持续释放片剂或胶囊的优势在于，它们的服用频率通常比相同药物的速释制剂要低，且它们能使血流中的药物水平更稳定，从而延长药物作用的持续时间。

在一个实施例中，通过将活性成分包埋在不溶性物质如丙烯酸树脂类或壳多糖等基质中，将医药组合物配制成适于缓释。缓释剂型设计成通过在特定时期内保持恒定的药物水平以预定速率释放活性成分。

在另一实施例中，将医药组合物配制成适于延迟释放，使得活性成分在施用时不立即释放。延迟释放媒剂的非限制性实例是在肠而非胃中溶解的肠溶包衣口服药物。

在其他实施例中，将医药组合物配制成适于立即释放一部分活性成分，然后缓释剩余的活性成分。在一个实施例中，将医药组合物配制成可被摄入从而快速释放活性成分的粉末。在另一实施例中，将医药组合物配制成液体、凝胶、液体悬浮液或乳液形式。所述液体、凝胶、悬浮液或乳液可以裸露形式被个体摄取或包括在胶囊内。

在另一实施例中，医药组合物可以皮肤贴剂或透皮贴剂形式提供，用于受控及/或持续量的活性成分的局部施用。

预防或治疗疾病的方法

本申请的一个方面涉及一种用于预防或治疗个体的短暂性脑缺血发作(TIA)的方法。在一个实施例中，所述方法包括向个体口服施用治疗有效量的包括如上所述ASIC1a抑制剂的医药组合物。在其他实施例中，医药组合物通过静脉内、肌内、鞘内或脑室内方式施用。

本申请的方法及医药组合物可用于任何有发生TIA及/或中风风险的个体。

风险因素包括不可改变的因素(年龄、性别、种族及显著的家族史)；可改变的因素(体重、高血压、不健康的脂质分布、脑微出血、心血管疾病，包括冠状动脉疾病、心肌梗死、外周动脉疾病、瓣膜疾病、房颤、房扑；糖尿病；及生活方式选择(吸烟、饮酒、使用非法药物、不健康的饮食/营养不良及缺乏运动)。

在一个实施例中，个体有发生TIA或中风的风险。

在另一实施例中，个体近期进行过心脏手术或先前曾被诊断为患有TIA或中风。

在另一实施例中，个体患有选自房颤、房扑、室性心动过速及室颤的异常心律。

在另一实施例中，本申请的组合物可用于治疗血栓栓塞性疾病的方法中，所述血栓栓塞性疾病选自急性冠脉综合征、动脉栓塞、动脉粥样硬化、房颤、颈动脉疾病、大脑动脉血栓形成、脑栓塞、冠状动脉血栓形成、冠心病、深静脉血栓形成、肾栓塞、心肌梗死、外周动脉病、肺栓塞、中风、血栓性静脉炎、血栓形成、短暂性缺血性发作、不稳定型心绞痛、心脏瓣膜病、室颤及静脉血栓形成或其组合。

在另一实施例中，个体患有糖尿病或镰状细胞病。

个体可为动物个体或人个体。本文所用术语“动物”是指任何非人类的动物。合适的示例性动物包括具有血流的任何动物，例如啮齿动物(小鼠、大鼠等)、狗、猫、鸟、绵羊、山羊、非人灵长类动物等。动物可因自身原因而接受治疗，例如出于兽医目的(例如宠物治疗)。或者，动物可提供神经损伤(例如缺血)的动物模型，以帮助测试人类使用的候选药物，例如确定候选药物的效力、有效窗(window of effectiveness)、副作用等。

另一方面，本申请提供一种用于预防或治疗个体神经损伤的方法。在一个实施例中，所述方法包括向个体口服施用治疗有效量的包括上述ASIC1a抑制剂的医药组合物。在其他实施例中，医药组合物通过静脉内、肌内、鞘内或脑室内方式施用。

在一些实施例中，在预防性或治疗性治疗已经开始之后且在预防或治疗仍然有效的时间段内，个体患有缺血、缺血相关病症、缺血史及/或有发生缺血的显著可能性。

可根据任何合适的标准选择进行预防及/或治疗的个体。示例性标准可包括任何可检测到的缺血症状、缺血史、增加(或诱发)缺血风险的事件(例如外科手术、外伤、药物施用等)及/或类似事件。缺血史可涉及一次或多次既往缺血发作。在一些实例中，选择进行治疗的个体可在治疗开始前至少约1、2或3小时发生缺血发作，或在治疗开始前少于约1天、12小时或6小时发生多次缺血发作(如短暂性脑缺血发作)。

本文所用术语“神经损伤”是指对神经系统组织或细胞的急性或慢性损伤或神经系统组织或细胞的不良状况，所述神经系统组织或细胞的损伤或不良状况是由物理相互作用或外伤、挫伤或压迫或外科损伤、包括出血性或缺血性损伤的血管药理学损伤所引起，或是由神经退化或任何其他神经疾病、或引起神经系统组织或细胞损伤或不良状况的任何其他因素所引起。在一些实施例中，神经损伤是由认知障碍、精神障碍、神经递质介导的障碍或神经元障碍所引起。神经损伤包括对神经系统的损伤(即神经系统损伤)及脑损伤。

本文所用术语“认知障碍”是指并旨在包括被认为涉及神经元的结构及/或功能的进行性丧失、或被认为与神经元的结构及/或功能的进行性丧失有关、或确实涉及神经元的结构及/或功能的进行性丧失、或与神经元的结构及/或功能的进行性丧失有关的疾病及病症，所述神经元的结构及/或功能的进行性丧失包括神经元的死亡，且其中所述障碍的中心特征可为认知(例如，记忆、注意力、知觉及/或思维)受损。这些疾病包括病原体诱发的认知功能障碍，例如HIV相关认知功能障碍或莱姆病(Lyme disease)相关认知功能障碍。在一些实施例中，认知障碍是退化性认知障碍。退化性认知障碍的实例包括阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)、亨廷顿病(Huntington's Disease)、帕金森病(Parkinson'sDisease)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis；ALS)、自闭症、轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment；MCI)、中风、外伤性脑损伤(traumatic braininjury；TBI)、年龄相关记忆受损(age-associated memory impairment；AAMI)及癫痫。

本文所用术语“精神障碍”是指且旨在包括被认为引起或确实引起异常思维及知觉的精神疾病或病症。精神病的特征是现实感丧失，可伴有妄想、幻觉(在没有外部刺激的情况下，处于意识和清醒状态的具有真实知觉性质的知觉，因为它们是生动的、实质性的且位于外部客观空间)、人格改变及/或思维瓦解。其他常见症状包括异常或怪异行为，以及社交困难及开展日常生活活动的能力受损。典型的精神障碍是精神分裂症、双相障碍、精神病、焦虑、抑郁及慢性疼痛。

本文所用术语“神经递质介导的障碍”是指且旨在包括被认为涉及下列或与下列有关或确实涉及下列或确实与下列有关的疾病或病症：例如组织胺、谷氨酸、5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素等神经递质水平异常或胺能G蛋白偶联受体(aminergic G protein-coupled receptor)的功能受损。示例性神经递质介导的障碍包括脊髓损伤、糖尿病神经病变、过敏性疾病及涉及防老活动(geroprotective activity)的疾病，例如与年龄相关的毛发脱落(脱发)、与年龄相关的体重减轻及与年龄相关的视觉障碍(白内障)。神经递质水平异常与多种疾病及病症有关，包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、轻度认知障碍、精神分裂症、焦虑、多发性硬化、中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤、糖尿病神经病变、纤维肌痛、双相障碍、精神病、抑郁及多种过敏性疾病。

本文所用术语“神经元障碍”是指并旨在包括被认为涉及神经元细胞死亡及/或神经元功能受损或神经元功能降低、或与神经元细胞死亡及/或神经元功能受损或神经元功能降低有关、或确实涉及神经元细胞死亡及/或神经元功能受损或神经元功能降低、或确实与神经元细胞死亡及/或神经元功能受损或神经元功能降低有关的疾病或病症。示例性神经元适应症包括神经退化性疾病及病症，例如阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森病、犬认知功能障碍综合征(canine cognitive dysfunction syndrome；CCDS)、路易体病(Lewy body disease)、门克斯病(Menkes disease)、威尔逊病(Wilsondisease)、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)、法尔病(Fahr disease)、涉及脑循环的急性或慢性病症(例如缺血性或出血性中风或其他大脑出血性损伤)、年龄相关记忆受损(AAMI)、轻度认知受损(mild cognitive impairment；MCI)、损伤相关轻度认知受损(MCI)、脑震荡后综合征、创伤后应激障碍、辅助化学疗法、外伤性脑损伤(traumatic braininjury；TBI)、神经元死亡介导的眼病、黄斑部退化、年龄相关性黄斑部退化、自闭症(包括自闭症谱系障碍)、阿斯伯格综合征(Asperger syndrome)及雷特综合征、撕脱损伤、脊髓损伤、重症肌无力、格林巴利综合征、多发性硬化、糖尿病神经病变、纤维肌痛、与脊髓损伤相关的神经病、精神分裂症、双相障碍、精神病、焦虑或抑郁以及慢性疼痛。

在一些实施例中，神经损伤或神经系统损伤是由进入神经元或神经系统组织的离子流的变化所引起的。本文所用术语“神经系统组织”是指包括神经细胞、神经毡、神经胶质、神经炎性细胞及与“神经系统组织”接触的内皮细胞的动物组织。“神经细胞”可为本领域中的技术人员已知的任何类型的神经细胞，包括但不限于神经元。本文所用术语“神经元”表示来源于动物神经系统任何部分的外胚层胚胎来源的细胞。神经元表达特征明确的神经元特异性标记物，包括神经丝蛋白、NeuN(神经元核标记物)、MAP2及III类微管蛋白。作为神经元包括，例如，海马迴、皮质、中脑多巴胺能、脊髓运动、感觉、肠、交感、副交感、隔核胆碱能、中枢神经系统及小脑神经元。用于本发明的“神经胶质细胞”包括但不限于星形胶质细胞、许旺细胞(Schwan cell)及少突神经胶质细胞。用于本申请的“神经炎性细胞”包括但不限于髓源性细胞，包括巨噬细胞及小胶质细胞。

在一些实施例中，本申请的医药组合物及方法涉及减轻由缺血或缺血相关病症引起的神经损伤。本文所用的缺血是指流向器官及/或组织的血流减少。血流减少可由许多机制引起，包括但不限于向器官及/或组织供应血液的一个或多个血管的部分或完全堵塞(阻塞)、变窄(收缩)及/或泄漏/破裂。缺血可由血栓形成、栓塞、动脉粥样硬化、高血压、出血、动脉瘤、手术、外伤、用药等产生。因此，血流减少可为慢性的、短暂的、急性的或散发性的。

缺血相关疾病可是缺血的任何结果。所述结果可实质上与缺血发作同时发生(例如，缺血的直接影响)及/或可实质上在缺血发作之后及/或甚至在缺血结束之后发生(例如缺血的间接、下游效应，如缺血结束时的组织再灌注)。示例性缺血相关病症可包括前文所列症状(及/或病症)的任何组合。替代地，或另外地，症状可包括局部及/或全身性酸中毒(pH降低)、缺氧(氧减少)、自由基产生及/或类似症状。

在一些实施例中，缺血相关病症为中风。如本文所用，中风是因脑的一部分(或全部)的血液供应减少而产生的脑缺血。中风产生的症状可为突发性的(例如失去知觉)，也可在数小时或数天内逐渐发作。此外，中风尤其可为严重缺血发作(全中风)或更轻微的短暂性缺血发作等。中风产生的症状可包括，例如，偏瘫、半身不遂、单侧麻木、单侧无力、单侧瘫痪、暂时性肢体无力、肢体刺痛、意识模糊、说话困难、言语理解困难、单眼或双眼视力障碍、视力模糊、视力丧失、行走困难、头晕、跌倒倾向、协调能力丧失、突发性剧烈头痛、呼吸困难及/或意识丧失。替代地或另外地，症状可更容易地检测到或仅可通过检查及/或仪器检测到，例如缺血血液检查(例如，检测改变的白蛋白、特定的蛋白质异形体、受损蛋白质等)、心电图、脑电图、运动负荷试验、脑CT或MRI扫描及/或类似检测。

酸碱平衡对生物系统很重要。正常的脑功能依赖于葡萄糖的完全氧化，其能量需求为终产物CO₂及H₂O。缺血期间，由于供氧不足，无氧糖酵解增加，导致乳酸积累。乳酸的累积(伴随ATP水解释放的H⁺增加)会导致组织pH值降低。细胞外pH(pH₀)在缺血期间通常降至6.5，在严重缺血或高血糖条件下可能降至6.0以下。

任何器官或组织都可能出现血流量减少的情况，并需要进行缺血治疗。示例性器官及/或组织包括但不限于脑、动脉、心脏、肠及眼部(例如，视神经)。缺血诱发的损伤(即，由各种类型的缺血产生的疾病及/或损伤)尤其包括但不限于缺血性脊髓病、缺血性视神经病变、缺血性结肠炎、冠心病及/或心脏疾病(例如，心绞痛、心脏病发作等)。因此，缺血诱发的损伤可损伤及/或杀死细胞及/或组织，尤其是例如在体内受影响的部位产生坏死(梗塞)组织、炎症及/或组织重建等。根据本申请各方面的治疗可降低这种损伤的发病率、范围及/或严重程度。

在一些实施例中，阿米洛利、阿米洛利类似物或其药学上可接受的盐或溶剂化物以0.1毫克至10毫克/公斤体重的剂量范围施用。在其他实施例中，医药组合物在缺血性事件发作的1小时内、缺血性事件发作的5小时内或缺血性事件发作的1小时至5小时之间施用。

图1示出了具有示例性步骤22、24的流程图20，所述示例性步骤22、24可在减轻缺血个体的神经损伤的方法中执行。所述步骤可以任何合适的组合执行任何合适的次数。在所述方法中，可选择一名缺血个体(或多名个体)进行治疗，如22所示。然后可向缺血个体施用ASIC选择性抑制剂，如24所示。可向缺血个体施用治疗有效量的抑制剂，以减轻缺血对个体诱发的损伤，例如，减轻中风导致的脑损害的量。

对图1的缺血治疗的疗效的潜在解释可由本教示的数据提供(例如，见实例1)。特别是，缺血的损害效应可不等于酸中毒，即，因缺血而导致的组织/细胞酸化可能不足以产生缺血诱发的损伤。相反，在许多情况下，缺血诱发的损伤可能是由ASIC家族成员(尤其是ASIC1a)所介导的进入细胞的钙流引起的。因此，选择性抑制ASIC1a的通道活性可能会减少这种有害的钙流，从而减轻缺血诱发的损伤。

图2示出了具有示例性步骤32、34的流程图30，所述步骤可在鉴别用于治疗缺血的药物的方法中执行。所述步骤可以任何合适的组合执行任何合适的次数。在所述方法中，可获得一种或多种ASIC选择性抑制剂，如32所示。然后可在缺血个体中测试抑制剂对缺血诱发的损伤的作用，如34所示。

实例

以下实例描述了本教示选定的方面及实施例，特别是描述ASIC抑制的体外及体内效应的数据。这些实例旨在用于说明的目的，而不应被解释为限制本教示的范围。

实例1：阻断钙通透性酸敏感离子通道对缺血的神经保护作用

本实例描述了显示ASIC1a在介导缺血性损伤中的作用及ASIC1a抑制剂减轻缺血性损伤的能力的实验；参见图2至图10。Ca²⁺毒性可能在缺血性脑损伤中起到核心作用。细胞的毒性Ca²⁺负荷在缺血的脑中发生的机制变得不太清楚，因为谷氨酸拮抗剂的多项人体试验未能显示出对中风的有效神经保护作用。酸中毒是缺血的常见特征，在脑损伤中起到关键作用。本实例表明，酸中毒会激活Ca²⁺通透性酸敏感离子通道(ASIC)，这可诱发Ca²⁺依赖性(而非谷氨酸受体依赖性)神经元损伤。因此，缺乏内源性ASIC的细胞可抵抗酸损伤，而Ca²⁺通透性ASIC1a的转染可建立敏感性。在局灶性脑缺血情况下，脑室内注射ASIC1a抑制剂或剔除ASIC1a基因可保护大脑免受缺血性损伤，且比谷氨酸拮抗作用更有效。

正常大脑需要葡萄糖的完全氧化来满足其能量需求。在缺血期间，氧耗竭迫使大脑转向无氧糖酵解。糖酵解副产物乳酸及ATP水解产生的质子的积累导致缺血脑中pH值下降，加重缺血性脑损伤。

酸敏感离子通道(ASIC)是一类在哺乳动物中枢及外周神经系统的神经元中表达的配体门控通道。到目前为止，已经克隆出六个ASIC亚单位(subunit)。其中四个亚单位形成功能性同源多聚通道，被酸性pH激活，传导钠选择性、阿米洛利敏感的阳离子电流。其中两个ASIC亚单位，ASIC1a亚单位及ASIC2a亚单位已被证明在大脑中含量丰富。

实验程序

神经元培养

使用氟烷麻醉后，从E16瑞士小鼠或P1 ASIC1^+/+及ASIC1^-/-小鼠中解剖取出大脑皮质，并用0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃孵育10分钟。然后用经火焰抛光的玻璃移液管研磨组织，并以2.5×10⁵个细胞/孔或10⁶个细胞/盖玻片的密度铺在涂有聚-L-鸟苷酸的24孔平板或25×25毫米玻璃盖玻片上。用补充有10％马血清的MEM培养基(用于E16培养)或补充了B27的神经基(Neurobasal)培养基(用于P1培养)培养神经元，并在12天后用于电生理学研究及毒性研究。通过添加5-氟-2-脱氧尿苷及尿苷抑制了神经胶质生长，产生具有90％神经元的培养细胞(通过NeuN及GFAP染色测定)(数据未显示)。

电生理学

采用全细胞膜片钳(whole-cell patch-clamp)及快速灌注技术记录ASIC电流。正常细胞外液(extracellular solution；ECF)含有(单位：mM)140NaCl、5.4KCl、25HEPES、20葡萄糖、1.3CaCl₂、1.0MgCl₂、0.0005TTX(pH 7.4)、320至335mOsm。对于低pH值溶液，添加不同量的HCl。对于pH<6.0的溶液，使用MES代替HEPES进行更可靠的pH缓冲。膜片电极(patchelectrode)含有(单位：mM)140CsF、2.0MgCl₂、1.0CaC₂、10HEPES、11EGTA、4MgATP(pH 7.3)、300mOsm。无Na⁺溶液由10mM CaCl₂、25mM HEPES组成，用等渗NMDG或蔗糖代替NaCl(楚(Chu)等人，2002)。使用多管灌注系统(SF-77B，华纳仪器公司(Warner Instrument Co.)进行快速溶液交换。

细胞损伤试验-LDH测定

细胞用ECF洗3次，随机分到各治疗组中。在所有组中均添加MK801(10μM)、CNQX(20μM)及尼莫地平(nimodipine)(5μM)，以消除谷氨酸受体及电压门控Ca²⁺通道的潜在二级激活。酸孵育后，清洗神经元，并在37℃的神经基(Neurobasal)培养基中孵育。使用LDH检测试剂盒(罗氏分子生物化学公司(Roche Molecular Biochemicals))测定培养基中LDH释放量。培养基(100微升)从培养孔转移到96孔板上并与试剂盒提供的100微升反应液混合。30分钟后，使用微孔板读取器(Spectra Max Plus，美谷分子仪器公司(Molecular Devices))在492纳米下测量光密度。减去620处的背景吸光度。在每个实验结束时，通过与1％曲拉通X-100(Triton X-100)孵育15分钟，获得每个孔中的最大可释放LDH。

Ca²⁺成像

生长在25×25毫米玻璃盖玻片上的皮质神经元用ECF洗涤三次，用5μM fura-2-乙酰氧基甲基酯在22℃下孵育40分钟，洗涤3次，然后在正常ECF中孵育30分钟。将盖玻片转移至倒置显微镜(尼康(Nikon)TE300)上的灌注室(perfusion chamber)。使用氙灯照射细胞，用40x紫外荧光(fluor)油浸物镜观察，并使用冷却CCD摄像机(先思(Sensys)KAF 1401，光度测定公司(Photometries))获得视频影像。在由阿克森成像工作台(Axon ImagingWorkbench)软件(阿克森仪器公司(Axon Instruments))控制的PC上采集并分析数字化影像。快门及滤光轮(兰布达(Lambda)10-2)由软件控制，以允许在340或380纳米激发波长下对细胞进行定时照明。在510纳米发射波长检测到Fura-2荧光。通过对视野中细胞的外切区域中的像素比率值取平均值来分析比率影像(340/380)。这些值被导出到西格玛绘图(SigmaPlot)进行进一步分析。

二醋酸荧光素染色及碘化丙啶摄取

在含有二醋酸荧光素(FDA)(5μM)及碘化丙啶(PI)(2μM)的ECF中培养细胞30分钟，然后用无染料ECF洗涤。观察存活(FDA阳性)及死亡(PI阳性)细胞，并在配备580/630纳米激发/发射(PI)及500/550纳米激发/发射(FDA)落射荧光的显微镜(蔡司公司(Zeiss))上计数。使用配有BQ 8000sVGA帧捕获器的光电子(Optronics)DEI-730相机采集影像，并使用计算机软件(生物定量(Bioquant)，TN)进行分析。

COS-7细胞的转染

在含10％HS及1％青链霉素(PenStrep)(GIBCO)的MEM中培养COS-7细胞。在约50％细胞覆盖时，使用FuGENE6转染试剂(罗氏分子生物化学)，在pc^DNA3载体中用ASIC及GFP的cDNA共转染细胞。各35毫米培养皿使用0.75微克ASIC的DNA及0.25微克GFP的DNA。转染48小时后，选择GFP阳性细胞进行膜片钳记录。为了稳定转染ASIC1a，转染后一周向培养基中加入500μg/mL的G418。将存活的G418抗性细胞进一步铺板，在G418存在下传代>5次。然后用膜片钳及免疫荧光染色检查细胞中ASIC1a的表达。

氧糖剥夺

将神经元洗涤3次，并在pH 7.4或6.0下在无氧室(1025型，福马科学公司(FormaScientific))中在35℃、85％N₂、10％H₂及5％CO₂的气氛下用无葡萄糖ECF培养，1小时后通过用神经基(Neurobasal)培养基替换不含葡萄糖的ECF培养基并在正常细胞培养物培养箱中培养而终止氧糖剥夺(OGD)。使用HEPES缓冲的ECF时，1小时OGD将pH值从7.38略微降低至7.28(n＝3)，以及从6.0略微降低至5.96(n＝4)。

局灶性脑缺血

在使用1.5％异氟醚、70％N₂O及28.5％O₂进行插管及通气麻醉的雄性大鼠(SD，250至300克)及小鼠(具有同基因型C57B16背景，约25克)中，通过大脑中动脉的缝合闭塞(MCAO)诱发短暂性局灶性脑缺血。用恒温控制的加热垫及灯将直肠及颞肌温度维持在37℃±0.5℃。采用经颅LASER(激光)多普勒监测脑血流。剔除血流未降低至20％以下的动物。

缺血24小时后，用水合氯醛处死动物。迅速取出大脑，以1毫米(小鼠)或2毫米(大鼠)的间隔行冠状切片，并通过浸入活体染料(2％)2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride；TTC)中进行染色。梗死面积的计算方法是从非缺血半球的面积中减去缺血半球被TTC染色的正剖面。梗死体积的计算方法是将所有切片的梗死面积相加，乘以切片厚度。大鼠脑室内注射采用立体定向技术使用微量注射泵进行，插管立体定向插入前囟后0.8毫米、中线旁1.5毫米、硬脑膜腹侧3.8毫米处。所有操作及分析均由对治疗组保持盲态的个体进行。

结果

(a)酸中毒激活小鼠皮质神经元中的ASIC

图3及图4显示了与培养的小鼠皮质神经元中ASIC的电生理学及药理学相关的示例性数据。图3A及图3B的图显示了由pH值从7.4降至所示pH值而激活的ASIC电流的pH依赖性。剂量反应曲线符合希尔方程(Hill equation)，平均pH_0.5为6.18±0.06(n＝10)。图3C及图3D的图示出ASIC的电流-电压关系(n＝5)。将各种电压下的ASIC电流幅值归一化至-60mV时记录的幅值。图4A及图4B的图示出阿米洛利对ASIC电流的剂量依赖性阻断。IC₅₀＝16.4±4.1μM，N＝8。图4C及图4D的图示出PcTX毒液对ASIC电流的阻断。**p<0.01。

记录培养的小鼠皮质神经元中的ASIC电流(见图3)。在-60mV的保持电位下，细胞外pH(pH_e)迅速降低至7.0以下，在大多数神经元中诱发具有小的稳态成分的大的瞬时内向电流(图3A)。随着pH_e的减小，向内电流的幅值以S形方式增加，产生为6.18±0.06的pH_0.5(n＝10，图3B)。获得了线性I-V关系及接近Na⁺平衡电位的反转(n＝6，图3C及图3D)。这些数据表明，降低pH_e可激活小鼠皮质神经元中的典型ASIC。

试验了阿米洛利(ASIC的非特异性抑制剂)对酸激活电流的影响(见图4)。如图4所示，阿米洛利剂量依赖性阻断皮质神经元的ASIC电流，IC₅₀为16.4±4.1μM(n＝8，图4A及图4B)。PcTX毒液对皮质神经元酸激活电流的影响如图4C及图4D所示。在100纳克/毫升浓度下，PcTX毒液可逆地阻断ASIC电流峰值幅值达47％±7％(n＝15，图4C及图4D)，表明同源多聚ASIC1a对总酸激活电流有显著贡献。在大多数皮质神经元中，增加PcTX浓度并未引起ASIC电流幅值的进一步降低(n＝8，数据未显示)，表明在这些神经元中共存有PcTX不敏感的ASIC(例如，异聚ASIC1a/2a)。

(b)通过模形化的缺血(modeled ischemia)增强ASIC反应

图5显示了表明模形化的缺血可增强ASIC活性的示例性数据。图5A是示出在1小时OGD之后ASIC电流的幅值增加及脱敏降低的一系列示例性迹线。图5B是示出OGD神经元中ASIC电流幅值增加的汇总数据图。N＝40及44，*p<0.05。图5C是显示OGD神经元中ASIC电流脱敏降低的一系列示例性迹线及汇总数据。N＝6，**p<0.01。图5D是一对示例性迹线，显示在对照条件下及1小时OGD后，ASICl^-/-神经元在pH 6.0缺乏酸激活电流(n＝12及13)。

因为酸中毒可为脑缺血的一个中心特征，所以决定检测ASIC是否可在缺血条件下被激活，以及缺血是否可改变这些通道的特性；参见图5。记录1小时氧糖剥夺(OGD)后神经元中的ASIC电流。简而言之，一组培养物用不含葡萄糖的细胞外液(ECF)洗涤三次并进行OGD处理，而对照培养物用含葡萄糖的ECF洗涤并在常规细胞培养物培养箱中孵育。1小时后通过用神经基(Neurobasal)培养基替换不含葡萄糖的ECF培养基并在常规培养箱中孵育而终止OGD。然后在OGD后1小时记录ASIC电流，此时神经元无形态改变。OGD处理引起ASIC电流幅值的中度增加(对照组中1520±138pA，N＝44；1小时OGD后神经元中1886±185pA，N＝40，p<0.05，图5A及图5B)。更重要的是，OGD引起ASIC脱敏的显著降低，如电流衰减的时间常数的增加所证明(对照组神经元中814.7±58.9ms，N＝6；OGD后神经元中1928.9±315.7ms，N＝6，p<0.01，图5A及图5C)。在从ASICl^-/-小鼠培养的皮质神经元中，pH值从7.4降至6.0并未激活任何内向电流(n＝52)，与之前在海马迴神经元中的研究(维米尔(Wemmie)等人，2002)相似。在这些神经元中，1小时OGD未激活或增强酸诱发的反应(图5D，n＝12及13)。

(c)酸中毒通过ASIC1a诱发非谷氨酸依赖性Ca²⁺进入

图6及图7显示的示例性数据表明，皮质神经元中的ASIC可具有Ca²⁺通透性，且Ca²⁺通透率可为ASIC1a依赖性的。图6A显示了使用含有10mM Ca²⁺作为唯一电荷载体的无Na⁺的ECF获得的示例性迹线。在pH 6.0下记录内向电流。校正液界电位(liquid junctionpotential)后，平均反转电位为约-17mV(n＝5)。图6B示出的代表性迹线及汇总数据示出阿米洛利及PcTX毒液对Ca²⁺介导的电流的阻断。100μM阿米洛利使Ca²⁺介导的电流峰值幅值降至对照值的26％±2％(n＝6，p<0.01)，100纳克/毫升PcTX毒液使其降至对照值的22％±0.9％(n＝5，p<0.01)。图7A显示了随pH变化的示例性340/380纳米比率，说明了pH值降至6.0使得[Ca2⁺]_i增加。将神经元浸泡在含有1.3mM CaCl₂及电压门控Ca²⁺通道抑制剂(5μM尼莫地平及1μMω-芋螺毒素MVIIC)以及谷氨酸受体抑制剂(10μM MK801及20μM CNQX)的普通ECF中。图7A的插图显示了100μM阿米洛利对酸诱发的[Ca²⁺]_i增加的示例性抑制作用。图7B显示了阿米洛利及PcTX毒液抑制酸诱发的[Ca²⁺]_i升高的示例性汇总数据。N＝6至8，**p<0.01，与pH 6.0组相比。图7C显示了随pH及NMDA存在/不存在而变化的示例性340/380纳米比率，表明在ASIC1^-/-神经元中没有酸诱发的[Ca²⁺]_i增加；神经元对NMDA反应正常(n＝8)。图7D显示了示出ASIC1^-/-神经元中在pH 6.0时缺乏酸激活电流的示例性迹线。

使用标准离子取代方案(贾(Jia)等人，神经元(Neuron)，1996，17：945-956)及Fura-2荧光Ca²⁺成像技术(楚(Chu)等人，2002，神经生理学杂志(J.Neurophysiol.)87：2555-2561)测定皮质神经元中ASIC的Ca²⁺通透性。使用含有10mM Ca²⁺作为唯一的电荷载体的浴液(不含Na⁺及K⁺)，在-60mV的保持电位下，我们在18个神经元中的15个中记录到大于50pA的内向电流，表明大多数皮质神经元中ASIC的Ca²⁺通透性显著(图6A)。与同源ASIC1a通道的激活一致，10mM Ca²⁺携带的电流在很大程度上被非特异性ASIC抑制剂阿米洛利及ASIC1a特异性抑制剂PcTX毒液阻断(图6B)。100μM阿米洛利使Ca²⁺介导的电流的峰值幅值降至对照的26％±2％(n＝6，p<0.01)，而100纳克/毫升PcTX毒液使其降至对照的22％±0.9％(n＝5，p<0.01)。存在其他主要Ca²⁺进入途径抑制剂(针对谷氨酸受体的MK801 10μM及CNQX 20μM；针对电压门控Ca²⁺通道的尼莫地平5μM及ω-芋螺毒素MVIIC 1μM)时的Ca²⁺成像表明20个神经元中有18个对pH值下降有反应，可检测到细胞内Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_i)增加(图7A)。一般而言，在低pH值溶液的长时间灌注过程中，[Ca²⁺]_i保持升高。在某些细胞中，[Ca^{2 +}]_i的升高持续的时间甚至比酸灌注的持续时间还要长(图7A)。持久的Ca²⁺反应表明，完整神经元中的ASIC反应的脱敏程度可比全细胞记录中低，或者通过ASIC进入的Ca²⁺可诱发Ca^{2 +}随后从细胞内库(introcellular store)中释放。用1μM毒胡萝卜素预培养神经元部分抑制了Ca²⁺增加的持续性，表明细胞内库中的Ca²⁺释放也可有助于酸诱发的细胞内Ca²⁺累积(n＝6，数据未显示)。与Ca²⁺离子携带的电流相似(图6B)，阿米洛利及PcTX毒液在很大程度上抑制了[Ca²⁺]_i的峰值及持续升高(图7A及图7B，n＝6至8)，这与同源ASIC1a参与酸诱发的[Ca²⁺]_i升高一致。剔除ASIC1基因消除了所有神经元中酸诱发的[Ca²⁺]_i增加，而不影响NMDA受体介导的Ca²⁺反应(图7C，n＝8)。膜片钳记录显示，52个ASIC1^-/-神经元中的52个在pH 6.0时缺乏酸激活电流，这与不存在ASIC1a亚单位一致。然而，pH值降至5.0或4.0时，在52个ASIC1^-/-神经元中的24个中激活了可检测电流，表明这些神经元中存在ASIC2a亚单位(图7D)。进一步的电生理研究表明，ASIC1^-/-神经元对各种电压门控通道及NMDA、GABA受体门控通道的反应正常(数据未显示)。

(d)ASIC阻断保护酸中毒诱发的非谷氨酸依赖性神经元损伤

图8显示的示例性数据表明酸孵育可诱发由ASIC阻断所保护的非谷氨酸受体依赖性神经元损伤。图8A及图8B显示的图示出在pH 7.4ECF(实心条)或pH 6.0ECF(空心条)中皮质神经元孵育1小时(图8A)或孵育24小时(图8B)诱发的时间依赖性LDH释放的示例性数据。N＝20至25孔，在相同时间点与pH 7.4组相比，*p<0.05，及**p<0.01(还通过活神经元细胞体二醋酸荧光素(FDA)染色及死神经元细胞核碘化丙啶(PI)染色分析了酸诱发的神经元损伤)。图8C所示图示出100μM阿米洛利或100纳克/毫升PcTX毒液对酸诱发的LDH释放的抑制(n＝20至27，*p<0.05，及**p<0.01)。在所有实验中，ECF中均存在MK801、CNQX及尼莫地平(图8A至图8C)。

在含有MK801、CNQX及尼莫地平的pH 7.4或6.0ECF培养基中孵育的在24孔板上生长的神经元上研究了酸诱发的损伤；参见图8。通过在不同的时间点(图8A及图8B)测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase；LDH)释放(高(Koh)及崔(Choi)，神经科学杂志(J.Neurosci.)，1987，20：83-90)以及通过活细胞/死细胞的荧光染色测定细胞损伤。与在pH 7.4下处理的神经元相比，1小时酸孵育(pH 6.0)诱发了LDH释放的时间依赖性增加(图8A)。24小时后，诱发了45.7％±5.4％的最大LDH释放(n＝25孔)。在pH 6.0下持续处理诱发了更大的细胞损伤(图8B，n＝20)。与LDH分析一致，用二醋酸荧光素及碘化丙啶进行的活染色/死染色在1小时酸处理后，在细胞死亡方面显示了相似的增加(数据未显示)。pH 6.5的ECF孵育1小时也诱发了显著的LDH释放，但较pH 6.0的ECF所诱发的LDH释放低(n＝8孔，数据未显示)。

检测阿米洛利及PcTX毒液对酸诱发的LDH释放的影响，以确定ASIC的激活是否参与酸诱发的非谷氨酸受体依赖性神经元损伤。在1小时酸孵育前10分钟及孵育期间，添加100μM阿米洛利或100纳克/毫升PcTX毒液显著减少了LDH释放(图8C)。24小时时，阿米洛利使LDH释放从45.3％±3.8％下降至31.1％±2.5％，PcTX毒液使其下降至27.9％±2.6％(n＝20至27，p<0.01)。在pH 7.4ECF中加入阿米洛利或PcTX毒液1小时未影响基线LDH释放，尽管延长了孵育时间(例如，5小时)，单独使用阿米洛利增加了LDH释放(n＝8，数据未显示)。

(e)同源ASIC1a的激活是酸中毒诱发的损伤的原因

图9的一系列图给出表明ASIC1a可能参与体外酸诱发损伤的示例性数据。图9A显示了说明通过减少[Ca²⁺]_e抑制酸诱发的LDH释放的示例性数据(n＝11至12，**p<0.01，与pH6.0相比，1.3Ca²⁺)。图9B显示的示例性数据说明在ASIC1a转染的COS-7细胞中，酸孵育诱发LDH释放增加，在未转染的COS-7细胞则没有增加(n＝8至20)。阿米洛利(100μM)抑制ASIC1a转染细胞中酸诱发的LDH释放。*p<0.05，对于7.4vs.6.0及6.0vs.6.0+阿米洛利。图9C显示的示例性数据说明在ASIC1^-/-神经元中缺乏酸诱发损伤、以及阿米洛利及PcTX毒液所提供的保护(每组n＝8，p>0.05)。图9D显示的示例性数据说明在OGD下培养的皮质神经元中，酸诱发的LDH释放增加(n＝5)。1小时OGD/酸中毒联合诱发的LDH释放未受到奎诺二甲基丙烯酸酯(trolox)及L-NAME的抑制(n＝8至11)。OGD没有增强ASICl^-/-神经元中酸诱发的LDH释放。**p<0.01，对于pH 7.4vs.pH 6.0，及*p<0.05对于pH 6.0vs.pH 6.0+PcTX毒液。在所有实验中，ECF中均含MK801、CNQX及尼莫地平(图9A至图9D)。

在正常或减少的[Ca²⁺]_e的存在下，用pH 6.0ECF处理神经元，以确定Ca²⁺进入是否在酸诱发的损伤中起作用(见图9)。将Ca²⁺浓度从1.3mM降低至0.2mM抑制了酸诱发的LDH释放(从40.0％±4.1％降至21.9％±2.5％)，使用PcTX毒液阻断ASIC1a也是如此(n＝11至12，p<0.01；图9A)。未测试无Ca²⁺溶液，因为完全去除[Ca²⁺]_e可激活通过Ca²⁺敏感阳离子通道的大内向电流，如果这样的话，可使数据解释更为复杂。阿米洛利及PcTX(非特异性及特异性ASIC1a抑制剂)以及通过减少[Ca²⁺]_e对酸损伤的抑制作用表明，Ca²⁺通透性ASIC1a的激活可参与酸诱发的神经元损伤。

对未转染的COS-7细胞及ASIC1a转染的COS-7细胞的酸损伤进行了研究，以提供ASIC1a活化参与酸损伤的额外证据。COS-7是一种常用于表达ASIC的细胞系，因为其缺乏内源性通道。细胞覆盖后(铺板后36至48小时)，用pH 7.4或6.0ECF处理细胞1小时。酸孵育24小时后测定LDH释放量。与pH 7.4处理的细胞相比，用pH 6.0ECF处理的未转染的COS-7细胞并未诱发LDH释放增加(pH 7.4时为10.3％±0.8％，pH 6.0时为9.4％±0.7％，N＝19及20孔；p>0.05，图9B)。然而，在用ASIC1a稳定转染的COS-7细胞中，在pH 6.0下孵育1小时显著增加了LDH释放，从15.5％±2.4％增加至24.0％±2.9％(n＝8孔，p<0.05)。添加阿米洛利(100μM)抑制了这些细胞中酸诱发的LDH释放(图9B)。

还研究了用单独编码GFP或编码GFP+ASIC1a的cDNAs瞬时转染的CHO细胞的酸损伤。转染后(24至36小时)，用酸性溶液(pH 6.0)孵育细胞1小时，并在酸孵育24小时后检测细胞损伤。在GFP/ASIC1a组中，1小时的酸孵育极大地减少了存活的GFP阳性细胞，但在单独转染GFP的组中没有出现这种情况(数据未显示)。

对从ASIC^+/+及ASIC1^-/-小鼠培养的皮质神经元进行了细胞毒性实验，以进一步证明ASIC1a参与酸中毒诱发的神经元损伤。同样，在6.0下对ASIC^+/+神经元进行1小时酸孵育诱发了显著的LDH释放，所述LDH释放被阿米洛利及PcTX毒液减少(n＝8至12)。然而，对ASIC1^-/-神经元的1小时酸处理在24小时时未诱发LDH释放显著增加(pH 7.4时为13.8％±0.9％，pH 6.0时为14.2％±1.3％，N＝8，p>0.05)，表明这些神经元对酸损伤具有抵抗性(图9C)。此外，剔除ASIC1基因也消除了阿米洛利及PcTX毒液对酸诱发的LDH释放的影响(图9C，各自n＝8)，进一步表明阿米洛利及PcTX毒液对酸诱发的皮质神经元损伤的抑制作用(图8C)是由于对ASIC1亚单位的阻断。与酸孵育相反，用1mM NMDA+10μM甘氨酸(在不含Mg²⁺的[pH 7.4]ECF中)对ASIC1^-/-神经元进行1小时处理在24小时时诱发了84.8％±1.4％的最大LDH释放(n＝4，图9C)，表明对其他细胞损伤过程的反应正常。

(f)模形化的缺血通过ASIC增强酸中毒诱发的非谷氨酸依赖性神经元损伤

由于ASIC电流的幅值可被脑缺血的细胞及神经化学因素(细胞肿胀、花生四烯酸及乳酸盐)增强，且更重要的是，ASIC电流的脱敏可被模形化的缺血显著降低(参见图5A及图5C)，在缺血条件下ASIC的激活预计会产生更大的神经元损伤。为了检验这一假设，在氧糖剥夺(OGD)下对神经元进行1小时酸处理。向所有溶液中加入MK801、CNQX及尼莫地平，以抑制与OGD相关的电压门控Ca²⁺通道及谷氨酸受体介导的细胞损伤。在OGD条件下用pH7.4ECF孵育1小时仅在24小时时诱发27.1％±3.5％的最大LDH释放(n＝5，图9D)。这一发现与之前的报告一致，即阻断谷氨酸受体及电压门控Ca²⁺通道的情况下，1小时OGD不会诱发实质性细胞损伤(阿特斯(Aarts)等人，2003)。然而，1小时OGD联合酸中毒(pH 6.0)诱发了73.9％±4.3％的最大LDH释放(n＝5，图9D，p<0.01)，显著大于无OGD时酸诱发的LDH释放(见图8A，p<0.05)。加入ASIC1a抑制剂PcTX毒液(100纳克/毫升)后，酸/OGD诱发的LDH释放显著降低至44.3％±5.3％(n＝5，p<0.05，图9D)。

使用来自ASIC1^-/-小鼠的经培养神经元进行相同实验。然而，与含ASICl的神经元不同，1小时OGD及酸联合处理仅略微增加了ASIC1^-/-神经元中的LDH释放(从26.1％±2.7％增加至30.4％±3.5％，N＝10至12，图9D)。这一发现表明，OGD增强酸诱发的损伤可能主要是由于OGD增强ASICl介导的毒性。

已经证明，由活性氧/氮物质激活的Ca²⁺通透性非选择性阳离子电导的激活会导致非谷氨酸受体依赖性神经元损伤(阿特斯等人，细胞(Cell)，2003，115：863-877)。延长的OGD诱发的细胞损伤可通过直接清除自由基的试剂(例如，奎诺二甲基丙烯酸酯)或减少自由基产生的试剂(例如，L-NAME)显著地减轻。为了确定短时OGD与酸中毒联合诱发的神经元损伤是否可能涉及类似的机制，检测了奎诺二甲基丙烯酸酯及L-NAME对OGD/酸诱发的LDH释放的影响。如图9D所示，奎诺二甲基丙烯酸酯(500μM)或L-NAME(300μM)均未对1小时OGD/酸中毒联合诱发的神经元损伤有显著影响(n＝8至11)。其他实验也表明，ASIC抑制剂阿米洛利及PcTX毒液对TRPM7通道的电导没有影响(阿特斯等人，上述)。总之，这些发现强烈表明，在我们的研究中，ASIC(而非TRPM7)通道的激活可能是1小时OGD/酸中毒联合诱发的神经元损伤的主要原因。

(g)体内缺血性脑损伤中ASIC1a的激活

图10显示了说明体内脑缺血中通过ASICl阻断及ASICl基因剔除进行神经保护的数据。图10A显示了从TTC染色的脑切片获得的示例性数据的图，其示出了来自注射了aCSF(n＝7)、阿米洛利(n＝11)或PcTX毒液(n＝5)的大鼠的脑中的染色体积(“梗死体积”)。与注射了aCSF的组相比，*p<0.05及**p<0.01。图10B显示了说明来自ASIC1^-/-小鼠的大脑中梗死体积减少的示例性数据的图(每组n＝6)。与+/+组相比，*p<0.05及**p<0.01。图10C显示了说明来自腹膜内注射10毫克/公斤美金刚(Mem)或腹膜内注射美金刚伴脑室内注射PcTX毒液(500纳克/毫升)小鼠脑中梗死体积减少的示例性数据的图。**p<0.01，与aCSF注射液相比，以及美金刚与美金刚+PcTX毒液之间(每组n＝5)。图10D显示了说明来自腹膜内注射美金刚的ASIC1^+/+(wt)或ASIC1^-/-小鼠的脑中梗死体积减少的示例性数据的图(每组n＝5)。*p<0.05及**p<0.01。

对阿米洛利及PcTX毒液对大鼠短暂性局部脑缺血模型的保护作用(隆加(Longa)等人，中风(Stroke)，1989，20：84-91)进行检测，以确定ASIC1a的激活是否与体内缺血性脑损伤有关。通过短暂性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion；MCAO)诱发缺血(100分钟)。缺血前后30分钟，脑室内注射共6微升的单独的人工CSF(artificial CSF；aCSF)、含aCSF的阿米洛利(1mM)或PcTX毒液(500纳克/毫升)。估计4周龄大鼠的脑室及脊髓液体积约为60微升。假设输注的阿米洛利及PcTX在CSF中均匀分布，预计阿米洛利的浓度为约100μM，PcTX的浓度为约50纳克/毫升，这是在细胞培养实验中发现有效的浓度。缺血后24小时，通过TTC染色(贝德森(Bederson)等人，中风(Stroke)，1986，17：1304-1308)测定梗死体积。缺血(100分钟)产生的梗死体积在注射aCSF的大鼠中为329.5±25.6mm³(n＝7)，而在注射阿米洛利的大鼠中仅为229.7±41.1mm³(n＝11，p<0.05)，在注射PcTX毒液的大鼠中为130.4±55.0mm³(降低约60％)(n＝5，p<0.01)(图10A)。

使用ASIC1^-/-小鼠进一步证明ASIC1a在体内参与缺血性脑损伤。雄性ASIC1^+/+、ASICl^+/-及ASIC1^-/-小鼠(约25克，具有同基因型C57B16背景)接受如前所述60分钟大脑中动脉闭塞(斯坦泽-普尔(Stenzel-Poore)等人，柳叶刀(Lancet)，2003，362：1028-1037)。与通过药理学阻断ASIC1a的保护一致(如上)，相比^+/+小鼠(84.6±10.6mm³，N＝6，p<0.01)，-/-小鼠表现出明显更小的(减少约61％)梗死体积(32.9±4.7mm³，N＝6)。+/-小鼠也显示减少的梗死体积(56.9±6.7mm³，N＝6，p<0.05)(图10B)。

为了确定在谷氨酸受体阻断的设置中，阻断ASIC1a通道或剔除ASICl基因是否会在体内提供额外的保护，在60分钟MCAO后立即将美金刚(10毫克/公斤)腹膜内(ip)注射入C57B16小鼠，同时在缺血前15分钟及缺血后15分钟脑室内注射(i.c.v)总体积为0.4微升的aCSF单药或含PcTX毒液(500纳克/毫升)的aCSF。在腹膜内注射盐水及脑室内注射aCSF的对照组小鼠中，60分钟MCAO诱发的梗死体积为123.6±5.3mm³(n＝5，图10C)。在腹腔注射美金刚及脑室内注射aCSF的小鼠中，相同持续时间的缺血诱发的梗死体积为73.8±6.9mm³(n＝5，p<0.01)。然而，在注射美金刚及PcTX毒液的小鼠中，梗死体积仅为47.0±1.1mm³(n＝5，p<0.01，与对照组及美金刚组两者比较，图10C)。这些数据表明，在NMDA受体阻断的设置中，阻断同源ASIC1a可在体内缺血中提供额外的保护。在接受药理学NMDA阻断治疗的ASICl^-/-小鼠中也观察到了额外的保护作用(图10D)。在腹膜内注射盐水或10毫克/公斤美金刚的ASIC1^+/+小鼠中，60分钟MCAO分别诱发101.4±9.4mm³或61.6±12.7mm³的梗死体积(各组n＝5，图10D)。然而，在注射美金刚的ASICl^-/-小鼠中，相同的缺血持续时间诱发了27.7±1.6mm³的梗死体积(n＝5)，明显小于注射美金刚的ASIC1^+/+小鼠的梗死体积(p<0.05)。

综合起来看，这些数据表明Ca2⁺通透性ASIC1a的激活是一种新的导致缺血性脑损伤的非谷氨酸依赖性生物学机制。

实例2：PcTX神经保护的时间窗(Time Window)

本实例描述了在啮齿动物中风发作后的不同时间测量PcTX毒液的神经保护作用的示例性实验；参见图11。简言之，通过大脑中动脉闭塞(MCAO)在啮齿动物中诱发了脑缺血(中风)。在诱发后的指定时间，将人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid；aCSF)、PcTX毒液(0.5微升，500纳克/毫升总蛋白)或灭活(煮沸)的毒液注入每只啮齿动物的侧脑室内。如图11所示，在中风发作后1小时及3小时施用PcTX毒液均使中风体积减少60％。此外，如果在MCAO发作后中止治疗5小时，仍可使中风体积显著减少。因此，由于ASIC抑制而提供的神经保护在中风发作后可具有延长的治疗时间窗，从而使中风个体受益于在中风开始后数小时内所进行的治疗。ASIC阻断对中风神经保护的这种效应远比使用谷氨酸拮抗剂阻断NMDA受体(实验性中风治疗的主要靶点)的钙通道更为稳健。到目前为止，尚无谷氨酸拮抗剂具有此处所示的针对ASIC1a选择性抑制的有利特征。

实例3：示例性胱氨酸结肽

本实例描述了示例性胱氨酸结肽，包括全长PcTxl及PcTx的缺失衍生物，其可在培养的细胞中筛选，在缺血动物(例如，小鼠或大鼠等啮齿动物)中测试，及/或施用予缺血的人类个体。

图12显示了示例性胱氨酸结肽PcTxl(以50表示)的以一个单字母编码的一级氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，其中相对于氨基酸位置1至40显示了各种示例性肽特征。肽50可包括六个半胱氨酸残基，其形成胱氨酸键52、54、56以产生胱氨酸结基序58。所述肽还可包括一个或多个β折叠区60及带正电区62。N-端区域64及C-端区域66可位于胱氨酸结基序的侧面。

图13显示了图12的PcTxl肽50与所述肽的各种示例性缺失衍生物比对的比较。这些衍生物可包括N-端缺失70(SEQ ID NO:2)、部分C-端缺失72(SEQ ID NO:3)、完全C-端缺失74(SEQ ID NO:4)及N/C端缺失76(SEQ ID NO:5)。PcTxl的其他衍生物可例如包括一个或多个氨基酸的任何缺失、插入或取代，同时保持与原始PcTxl序列至少约25％或约50％的序列相似性或同一性。

可测试每种PcTxl衍生物选择性抑制ASIC蛋白的能力及/或对缺血的影响(如有)。可使用任何合适的测试系统来执行此测试，包括本教示中其他地方描述的任何基于细胞的分析系统及/或动物模型系统。PcTxl衍生物也可或替代性地在缺血人类个体中进行试验。

实例4：PcTX毒液对ASIC1a的选择性

本实例描述了相对于在培养细胞中表达的其他ASIC蛋白或ASIC蛋白的组合，测量PcTX毒液(从而测量PcTxl毒素)对单独ASIC1a的选择性的实验。用PcTX毒液(对于ASIC1a表达细胞，25纳克/毫升，而对于ASIC2a、ASIC3或ASIC1a+2a表达细胞，500纳克/毫升)处理表达所述ASIC蛋白的COS-7细胞。在半数最大通道激活的pH值(pH 0.5)下测量通道电流。如图14所示，在蛋白浓度为25纳克/毫升时，PcTX毒液在很大程度上阻断了由ASIC1a同源通道介导的电流，而在500纳克/毫升时，对由同源ASIC2a、ASIC3或异聚ASIC1a/ASIC2a所介导的电流没有影响(n＝3至6)。在500纳克/毫升时，PcTX毒液也不影响由其他配体门控通道(例如，NMDA及GABA受体门控通道)及电压门控通道(例如，Na⁺、Ca²⁺及K⁺通道)所介导的电流(n＝4至5)。这些实验表明，PcTX毒液(且因此PcTxl肽)是同源ASIC1a的特异性抑制剂。使用这种基于细胞的分析系统，可测量各种合成肽或其他候选抑制剂的ASIC抑制的效力及选择性(例如，见实例3)。

实例5：鼻腔施用PcTX毒液具有神经保护作用

本实例描述了说明在中风动物模型系统中经鼻施用PcTX毒液对于减轻缺血诱发的损伤的疗效的示例性数据。采用大脑中动脉闭塞诱发雄性小鼠脑缺血。开始闭塞后1小时，将动物作为对照处理或使用PcTX毒液(50微升的5纳克/毫升(总蛋白)PcTx毒液，鼻内引入)进行治疗。如图15所示，与对照处理相比，按梗死体积定义，鼻腔施用PcTX毒液导致缺血诱发的损伤(缺血性脑伤)减轻55％。鼻腔施药可通过基本上沉积在鼻道中而不是吸入到肺中的喷雾，及/或可通过至少部分吸入到肺中的气雾剂。在一些实例中，鼻腔施药可具有优于其他施药途径的许多优点，例如更有效地递送至脑及/或适于缺血个体自我施用。

实例6：阿米洛利及阿米洛利类似物对ASIC1a通道的抑制

如图16所示，阿米洛利以及阿米洛利类似物苯扎米尔、非那米尔及EIPA以剂量依赖性方式阻断ASIC1a电流。同样，阿米洛利以及阿米洛利类似物苯扎米尔及EIPA以剂量依赖性方式阻断ASIC2a电流(图17)。表1总结了阿米洛利及阿米洛利类似物对ASIC1a通道的抑制作用。阿米洛利是此通道的有效抑制剂，IC₅₀为7.7μM。

表1.阿米洛利及阿米洛利类似物对ASIC1a通道的抑制。

实例7：通过脑室内注射阿米洛利及阿米洛利类似物减少小鼠的梗死体积

对小鼠进行60分钟的大脑中动脉闭塞(MCAO)，如上所述。阿米洛利或阿米洛利类似物苯扎米尔、苄普地尔、EIPA或KB-R7943在MCAO后1小时通过脑室内注射施用。在缺血诱发后一天对动物进行评估。如图18所示，脑室内注射阿米洛利或阿米洛利类似物苯扎米尔、苄普地尔、EIPA或KB-R7943可有效减少梗死体积。

实例8：通过静脉注射阿米洛利减少小鼠的梗死体积

对小鼠进行60分钟的大脑中动脉闭塞(MCAO)，如上所述。阿米洛利在大脑中动脉闭塞后1、3或5小时通过静脉注射给药。在缺血诱发后一天对动物进行评估。如图19所示，静脉注射阿米洛利有效减少梗死体积。阿米洛利的中枢神经系统有效渗透，可通过脑缺血/再灌注后血脑屏障受损这一点来解释。图20显示静脉注射阿米洛利具有5小时的延长治疗窗。

实例9：疏水性阿米洛利类似物在各种通道上的构效关系

如表1所示，用烷基取代阿米洛利中的C-5氨基导致对ASIC1a通道的效力下降。相同的取代增加了对ASIC3通道的效力(库都克(Kuduk)等人，生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)，2009，19：2514-2518)。当疏水基团取代所述结构的胍基部分时，得到了相反的结果。确实，经苄基取代的胍基类似物苯扎米尔是所测试的化合物中最强效的ASIC1a阻断化合物(IC₅₀＝4.9μM)。总之，这些结果表明阿米洛利是ASUC1a的有效抑制剂，IC₅₀为7.7μM。它们还为设计可抑制ASIC1a通道的阿米洛利类似物提供了构效关系(见图21)。因此，在一些实施例中，通过在阿米洛利结构的胍部分中引入改变来产生阿米洛利类似物。因为阿米洛利只是Na⁺/Ca²⁺离子交换器的非常弱的抑制剂(IC₅₀＝1.1mM)，阿米洛利类似物也可能是一种非常弱的Na⁺/Ca²⁺离子交换器抑制剂。在一些实施例中，阿米洛利类似物被设计为相对于ASIC3通道具有增加的ASIC1a选择性。在其他实施例中，环结构如环状胍基被引入阿米洛利结构以增加ASIC1a电流的抑制效力。阿米洛利的一个或多个N-H基团也可能将与内部的3-氨基或与离子通道形成H键。

小鼠体内结果显示，血浆浓度32.5μM(静脉注射剂量50μl x 1mM)且总脑浓度为12.5μM(脑室内剂量为1μl x 500μM)可达成疗效。因此，据估计，仅需要将效力增加10倍，即可达到适用于人类中风急性治疗的有效浓度。因此，筛选ASIC1a IC₅₀效力增加的新颖类似物(对于阿米洛利从4至8μM以及对于苯扎米尔至<1μM)。

在一些实施例中，阿米洛利类似物包括苯扎米尔的甲基化类似物(图21的化学式1-5)及苯扎米尔的脒基类似物(图21的化学式6)。在其他实施例中，阿米洛利类似物含有在胍基上形成的环。在其他实施例中，阿米洛利类似物含有酰基胍基，以增加对ASIC1a电流的抑制效力。

阿米洛利可以1mM溶于水，在每次注射50微升的剂量下可有效治疗小鼠模型中的缺血。在65公斤体重的人体内，按毫克/公斤计的等效剂量将接近40毫克，且需要的注射体积超过160毫升。同样，据报告苯扎米尔在0.9％盐水中的溶解度为0.4毫克/毫升(1.7mM)，因此在10毫升注射液中仅可施用5毫克苯扎米尔二盐酸盐。因此，需要具有更高水溶性的阿米洛利类似物。在一些实施例中，阿米洛利类似物在胍基上含有水增溶基团，例如N,N-二甲基氨基或糖，以提高水溶性。在一些实施例中，阿米洛利类似物的水溶性为5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM或更高。在其他实施例中，阿米洛利类似物的溶解度使得能够以单次10毫升注射向人静脉内施用10毫克、25毫克、50毫克、100毫克、150毫克、200毫克、250毫克、300毫克、400毫克或500毫克剂量。在其他实施例中，阿米洛利类似物的溶解度使得能够以单次2毫升注射向人脑室内施用10毫克、25毫克、50毫克、100毫克、150毫克、200毫克、250毫克、300毫克、400毫克或500毫克剂量。

实例10：阿米洛利及阿米洛利类似物在短暂性脑缺血发作模型中的应用

为了评估阿米洛利及其类似物的神经保护潜力，采用小鼠短暂性局灶性脑缺血模型(李(Li)等人，脑研究(Brain Research)，1055：180-185，2005；佩德罗诺(Pedrono)等人，神经病理学与实验神经学杂志(J.Neuropathol Exp.Neurol.)69(2)：188-195，2010)或大鼠短暂性局灶性脑缺血模型(托尔瓦宁(Tolvanen)等人，脑研究(Brain Research)，1663：166-173，2017)，其与或不与本文所述的抗凝血剂一起使用。在诱发短暂性局灶性脑缺血之前，通过管饲或腹膜内注射用阿米洛利、阿米洛利类似物及/或抗凝血剂(例如，各自1至60毫克/公斤/天)对动物进行预处理。使用管腔内单丝诱发大脑中动脉闭塞(MCAO)。将手术缝合线(6-0尼龙单丝，爱惜康公司(Ethicon)，英国)的尖端通过加热变钝或变圆，引入颈总动脉(common carotid artery；CCA)，然后颅内推进至大脑中动脉(middle cerebralartery；MCA)的起点，以阻断进入此动脉的血流。插入单丝后(从而开始MCA闭塞)，将单丝固定到位5至10分钟的时间。在MCAO期后，取出单丝，使得在MCA内再灌注24小时。在这些条件下，预计不会出现可检测到的脑梗死。

评估了活性剂对％半球病变体积、脑水肿、旋转棒表现(rotarod performance)、自发运动活动及死亡率的影响。NMDA通道阻滞剂及金标准NMDA拮抗剂MK-801可用作对照。

使用激光多普勒血流计(laser Doppler flowmetry；LDF)在动物中测量局部脑血流量(cerebral blood flow；CBF)，方法是将柔性光纤探头施加于接受MCA供血的区域的完整及裸露颅面上(前囟点后方1毫米，前囟点侧方3毫米)。记录基线、闭塞及再灌注(再灌注后立即以及再灌注后10、20、30及24小时)时的脑血流量值。

再灌注期结束时(即，在第24小时)，如下使用神经状态(或感觉运动技能)的5分量表评估短暂性脑缺血损伤的功能后果：0，无缺陷；1，左爪或右爪未能完全伸出；2，向左侧或右侧绕圈；3，抗侧推能力下降；4，不能自发行走。

再灌注及评估神经状态后，处死动物，收获其大脑，固定在甲醛中，并包埋在石蜡块中。用切片机切割成4至6微米厚的切片，并用苏木精及曙红染色(H&E)、免疫组织化学染色(例如，纤维蛋白原、糖蛋白1β(glycoprotein 1 beta；GPlb)，用于检测血栓形成)及/或细胞凋亡染色(例如，末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TUNEL)试剂盒；(原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州))。上述分析法用于展示缺血性改变的程度，并将这些改变与ASIC1a抑制(使用或不使用本公开中所述的抗凝血剂)所赋予的预防益处相关联。

上面的描述是为了教示本领域中普通技术人员如何实施本发明，而不是为了详细描述本发明的所有那些显而易见的修改及变化，这些修改及变化对于阅读了本说明书的技术人员来说是显而易见的。然而，所有这些明显的修改及变化均旨在包括在本发明的范围内，本发明的范围由下面的权利要求书限定。权利要求书旨在涵盖可有效地满足所旨在保护的目的的按任何顺序的所主张组分及步骤，除非上下文特别指出相反的情况。

<110> 莫尔豪斯医学院（Morehouse School of Medicine）

熊志刚（Xiong, Zhi-Gang）

西蒙·罗杰（Simon, Roger）P.

<120> 用于预防或降低短暂性脑缺血发作发病率的组合物及方法

<130> 1013-315 CIP

<150> 15/445,833

<151> 2017-02-08

<150> 13/972,558

<151> 2013-08-21

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> PRT

<213> 千里达老虎尾蜘蛛（Psalmopoeus cambridgei）

<300>

<301> 埃斯古巴P.（Escoubas P.），韦尔J.R.（de Weille J.R.），勒科克A.（LecoqA.），戴克霍特S.（Diochot S.），沃尔德曼R.（Waldmann R.），

尚皮尼G.（Champigny G.），莫尼耶D.（Moinier D.），梅内兹A.（Menez A.），拉兹敦斯基M.（Lazdunski M.）

<302> 对一类质子门控钠离子通道具有特异性的狼蛛毒素的分离（Isolation of atarantula toxin specific for a class of

proton-gated Na+ channels）

<303> 生物化学杂志（J. Biol. Chem.）

<304> 275

<306> 25116-25121

<307> 2000-08-18

<313> (1)..(40)

<300>

<308> SWISSPROT / P60514

<309> 2004-03-29

<313> (1)..(40)

<400> 1

Glu Asp Cys Ile Pro Lys Trp Lys Gly Cys Val Asn Arg His Gly Asp

1 5 10 15

Cys Cys Glu Gly Leu Glu Cys Trp Lys Arg Arg Arg Ser Phe Glu Val

20 25 30

Cys Val Pro Lys Thr Pro Lys Thr

35 40

<210> 2

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PcTx1（SEQ ID NO:1）的缺失衍生物

<400> 2

Cys Ile Pro Lys Trp Lys Gly Cys Val Asn Arg His Gly Asp Cys Cys

1 5 10 15

Glu Gly Leu Glu Cys Trp Lys Arg Arg Arg Ser Phe Glu Val Cys Val

20 25 30

Pro Lys Thr Pro Lys Thr

35

<210> 3

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PcTx1（SEQ ID NO:1）的缺失衍生物

<400> 3

Glu Asp Cys Ile Pro Lys Trp Lys Gly Cys Val Asn Arg His Gly Asp

1 5 10 15

Cys Cys Glu Gly Leu Glu Cys Trp Lys Arg Arg Arg Ser Phe Glu Val

20 25 30

Cys Val Pro Lys Thr

35

<210> 4

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PcTx1（SEQ ID NO:1）的缺失衍生物

<400> 4

Glu Asp Cys Ile Pro Lys Trp Lys Gly Cys Val Asn Arg His Gly Asp

1 5 10 15

Cys Cys Glu Gly Leu Glu Cys Trp Lys Arg Arg Arg Ser Phe Glu Val

20 25 30

Cys

<210> 5

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PcTx1（SEQ ID NO:1）的缺失衍生物

<400> 5

Cys Ile Pro Lys Trp Lys Gly Cys Val Asn Arg His Gly Asp Cys Cys

1 5 10 15

Glu Gly Leu Glu Cys Trp Lys Arg Arg Arg Ser Phe Glu Val Cys

20 25 30