具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施例，而不是为了限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求来限制。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如本文所使用的，术语“约”当用于指代特定的列举的数值时，意味着该值与所列举的值的变化不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101以及其间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用以其整体并入本文。

定义

如本文所用，表述“CD3”是指这样的抗原：其作为多分子T细胞受体(TCR)的一部分在T细胞上表达，并且由四条受体链(CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ和CD3-γ)中的两条结合形成的同型二聚体或异型二聚体组成。本文中对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有提及都是指相应的蛋白质、多肽或蛋白质片段的人类版本，除非明确指定来自非人物种。因此，表述“CD3”是指人CD3，除非指定来自非人物种，例如，“小鼠CD3”、“猴CD3”等。人CD3-ε包含如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；人CD3-δ包含如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；CD3-ζ包含如SEQID NO:61所示的氨基酸序列；并且CD3-γ包含如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。

如本文所用，“结合CD3的抗体”或“抗CD3抗体”包括特异性地识别单个CD3亚基(例如，ε、δ、γ或ζ)的抗体及其抗原结合片段，以及特异性地识别两个CD3亚基的二聚体复合物(例如，γ/ε、δ/ε和ζ/ζCD3二聚体)的抗体及其抗原结合片段。本发明的抗体和抗原结合片段可以结合可溶性CD3和/或细胞表面表达的CD3。可溶性CD3包括天然CD3蛋白以及重组CD3蛋白变体，诸如例如单体和二聚体CD3构建体，它们缺乏跨膜结构域或以其他方式与细胞膜无关联。

如本文所用，表述“细胞表面表达的CD3”是指一种或多种CD3蛋白，其在体外或体内在细胞的表面上表达，使得CD3蛋白的至少一部分暴露于细胞膜的细胞外侧并可被抗体的抗原结合部分接近。“细胞表面表达的CD3”包括在细胞膜中功能性T细胞受体的背景下包含的CD3蛋白。表述“细胞表面表达的CD3”包括在细胞的表面上作为同型二聚体或异型二聚体的一部分表达的CD3蛋白(例如，γ/ε、δ/ε和ζ/ζCD3二聚体)。表述“细胞表面表达的CD3”还包括CD3链(例如，CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)，其在没有其他CD3链类型的情况下自身在细胞的表面上表达。“细胞表面表达的CD3”可以包含或由在正常表达CD3蛋白的细胞表面上表达的CD3蛋白组成。可替代地，“细胞表面表达的CD3”可以包含或由在细胞的表面上表达的CD3蛋白组成，所述细胞通常不表达在其表面上的人CD3，但已被人工工程化以在其表面上表达CD3。

如本文所用，表述“FcεR1α”是指IgE的高亲和力Fc受体(FcεR1)的α链。FcεR1α负责IgE与FcεR1的结合。FcεR1α在肥大细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、mDC、pDC、朗格汉斯细胞、嗜酸性粒细胞和血小板中表达。人FcεR1α的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示。术语“FcεR1α”包括重组FcεR1α蛋白或其片段。该术语还包括与例如组氨酸标签、小鼠或人Fc偶联的FcεR1α蛋白或其片段，或信号序列诸如ROR1(例如，SEQ ID NO:57或58)。

如本文所用，“结合FcεR1α的抗体”或“抗FcεR1α抗体”包括特异性地识别FcεR1α的抗体及其抗原结合片段。

如本文所用，术语“与FcεR1α的表达相关的疾病或障碍”包括其中对FcεR1α的表达和/或活性(例如信号传导)的抑制和/或对表达FcεR1α的细胞的消融预期减轻障碍的症状和/或进展的任何疾病或障碍。例如，这样的疾病和障碍包括但不限于肥大细胞活化障碍、肥大细胞增多症和过敏，包括但不限于食物过敏、花粉过敏、宠物皮屑过敏等。

如本文所用，术语“过敏”是指由免疫系统对环境中的物质(过敏原)的超敏反应引起的病症。过敏包括但不限于过敏性哮喘、枯草热、特应性皮炎、慢性荨麻疹、食物过敏、宠物皮屑过敏和花粉过敏。过敏的症状可能包括但不限于荨麻疹(例如荨麻疹)、血管性水肿、鼻炎、哮喘、呕吐、打喷嚏、流涕、气促、鼻窦炎症、流泪、喘息、支气管痉挛、呼气峰流速(PEF)降低、胃肠不适、潮红、嘴唇肿胀、舌头肿胀、血压降低、过敏反应和器官功能障碍/衰竭。在一个实施例中，过敏是过敏性过敏，其是可以导致死亡的严重形式的过敏。过敏反应的症状可能包括但不限于皮疹、喉咙或舌头肿胀、气道肿胀、气促、呕吐、头晕、低血压等。

如本文所用，术语“过敏原”包括能够刺激易感个体中的过敏反应的任何物质、化学品、颗粒或组合物。过敏原可以包含在食物物品中或源自食物物品，诸如例如乳制品(例如牛奶)、鸡蛋、芹菜、芝麻、小麦、大豆、鱼、贝类、糖(例如存在于肉上的糖，诸如α-半乳糖)、花生、其他豆类(例如豆类、豌豆、大豆等)和树坚果。可替代地，过敏原可以包含在非食物物品中或源自非食物物品，诸如例如灰尘(例如，包含尘螨)、花粉、昆虫毒液(例如，蜜蜂、黄蜂、蚊子、火蚁的毒液等)、模具、动物毛皮、动物皮屑、羊毛、乳胶、金属(例如镍)、家用清洁剂、洗涤剂、药物、化妆品(例如香水等)、药品(例如青霉素、磺胺类、水杨酸盐等)、治疗性单克隆抗体(例如西妥昔单抗)、豚草、草和桦树。示例性的花粉过敏原包括例如树花粉，诸如桦树花粉、雪松花粉、橡树花粉、桤木花粉、角树花粉、七叶树花粉、柳树花粉、杨树花粉、车前草花粉、椴树花粉、油橄榄花粉、桧木花粉和灯心草花粉。

术语“抗原结合分子”包括抗体和抗体的抗原结合片段，包括例如双特异性抗体。

如本文所用，术语“抗体”是指任何抗原结合分子或分子复合物，其包含至少一个特异性地结合至特定抗原(例如，FcεR1α或CD3)或与其相互作用的互补决定区(CDR)。术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链、两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如IgM)。每个重链包含重链可变区(本文被缩写为HCVR或V_H)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，C_H1、C_H2和C_H3。每个轻链包括轻链可变区(本文被缩写为LCVR或V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(C_L1)。V_H和V_L区可以被进一步细分为高变区，被称为互补决定区(CDR)，其间散布有更保守的区域，被称为框架区(FR)。每个V_H和V_L由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的不同实施例中，抗FcεR1α抗体或抗CD3抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以被天然或人工修饰。氨基酸共有序列可以基于对两个或更多个CDR的并列分析来定义。

如本文所用，术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括任何天然存在的、酶促可获得的、合成的或遗传工程改造的多肽或糖蛋白，其特异性地结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以使用任何合适的标准技术(诸如涉及操纵和表达编码抗体可变和任选恒定结构域的DNA的蛋白水解消化或重组基因工程技术)从例如完整抗体分子衍生而来。这种DNA是已知的和/或容易从例如商业来源、DNA文库(包括，例如，噬菌体-抗体文库)获得，或可以被合成。DNA可以通过化学方法或通过使用分子生物学技术进行测序和操作，例如，以将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸等。

抗原结合片段的非限制性示例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)₂片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)诸如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成的最小识别单元。其他工程改造的分子，诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体、二抗体、三抗体、四抗体、小抗体、纳米体(例如单价纳米体、二价纳米体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变的IgNAR结构域也包括在如本文所用的表述“抗原结合片段”中。

抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以是任何大小或氨基酸组成，并且通常将包含至少一个与一个或多个框架序列相邻或在框架内的CDR。在具有与V_L结构域相关的V_H结构域的抗原结合片段中，V_H结构域和V_L结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体，并且包含V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可以包含单体V_H或V_L结构域。

在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以包含至少一个与至少一个恒定结构域共价连接的可变结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段中发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)V_H-C_H1；(ii)V_H-C_H2；(iii)V_H-C_H3；(iv)V_H-C_H1-C_H2；(v)V_H-C_H1-C_H2-C_H3；(vi)V_H-C_H2-C_H3；(vii)V_H-C_L；(viii)V_L-C_H1；(ix)V_L-C_H2；(x)V_L-C_H3；(xi)V_L-C_H1-C_H2；(xii)V_L-C_H1-C_H2-C_H3；(xiii)V_L-C_H2-C_H3；和(xiv)V_L-C_L。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包括上面列出的任何示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接，或者可以通过完全或部分铰链或接头区域连接。铰链区可以由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，其导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含上面列出的任何可变和恒定结构域构型的同型二聚体或异型二聚体(或其他多聚体)，其彼此非共价结合和/或与一个或多个单体V_H或V_L结构域非共价结合(例如通过二硫键)。

与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地结合至单独的抗原或同一抗原上的不同表位。任何多特异性抗体形式(包括本文公开的示例性双特异性抗体形式)可以使用本领域可获得的常规技术适用于本发明抗体的抗原结合片段的情况。

本发明的抗体可以通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)发挥作用。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是指在补体的存在下，本发明的抗体对抗原表达细胞的裂解。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，并且从而导致靶细胞的裂解。CDC和ADCC可以使用本领域熟知和可获得的测定来测量(参见，例如，美国专利第5,500,362和5,821,337号以及Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656)。抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力很重要。因此，可以基于抗体是否需要介导细胞毒性来选择抗体的同种型。

在本发明的某些实施例中，本发明的抗FcεR1α单特异性抗体或抗FcεR1α/抗CD3双特异性抗体是人抗体。如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括未被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，并且特别是在CDR3中。然而，如本文所用，术语“人抗体”并不旨在包括其中衍生自另一哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。

在一些实施例中，本发明的抗体可以是重组人抗体。如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)、从重组的组合人抗体文库中分离的抗体(下文进一步描述)、从针对人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如，Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施例中，对这种重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列是这样的序列：其虽然来源于人种系V_H和V_L序列并与之相关，但在体内可能不天然存在于人抗体种系全集中。

人抗体可以以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键结合在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接，并且形成约75-80kDa的分子，其由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成。即使在亲和纯化后，这些形式也极难分离。

第二种形式在各种完整IgG同种型中出现的频率是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可以将第二种形式的出现(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30:105)显著地降低到通常使用人IgG1铰链观察到的水平。本发明包括在铰链区、C_H2区或C_H3区中具有一个或多个突变的抗体，这些突变在例如生产中可能是期望的，以提高所需抗体形式的产量。

本发明的抗体可以是分离的抗体。如本文所用，“分离的抗体”是指已从其自然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，已从生物体的至少一种组分，或从其中天然存在或天然产生抗体的组织或细胞中分离或除去的抗体，对于本发明的目的是“分离的抗体”。分离的抗体还包括在重组细胞内原位的抗体。分离的抗体是已经经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施例，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学品。

本发明还包括结合FcεR1α的单臂抗体。如本文所用，“单臂抗体”是指包含单个抗体重链和单个抗体轻链的抗原结合分子。本发明的单臂抗体可以包含如表1中所列的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。

与衍生抗体的相应种系序列相比，本文公开的抗FcεR1α或抗FcεR1α/抗CD3抗体可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区域中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定这种突变。本发明包括衍生自本文公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或CDR区域内的一个或多个氨基酸被突变为衍生抗体的种系序列的相应残基，或被突变为另一人种系序列的相应残基，或被突变为相应种系残基的保守氨基酸取代(这种序列改变在本文中被统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地产生包含一个或多个单独种系突变或其组合的多个抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，V_H和/或V_L结构域内的所有框架和/或CDR残基被突变回到在衍生抗体的原始种系序列中发现的残基。在其他实施例中，仅某些残基被突变回到原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸或FR4的后8个氨基酸中发现突变的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3中发现突变的残基。在其他实施例中，框架和/或CDR残基中的一个或多个被突变为不同种系序列(即，与最初衍生抗体的种系序列不同的种系序列)的相应残基。此外，本发明的抗体可以在框架和/或CDR区域内包含两种或更多种种系突变的任何组合，例如，其中某些单独的残基被突变为特定种系序列的相应残基，而与原始种系序列不同的某些其他残基被保持或被突变为不同种系序列的相应残基。一旦获得，可以容易地测试含有一种或多种种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所需的性质，诸如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物学性质(可以视情况而定)、降低的免疫原性等。以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段包括在本发明中。

本发明还包括抗FcεR1α或抗FcεR1α/抗CD3抗体，其包含本文公开的具有一个或多个保守取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中任一个的变体。例如，本发明包括具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗FcεR1α或抗FcεR1α/抗CD3抗体，相对于本文表1和表3中列出的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，所述HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。

术语“表位”是指与被称为副表位的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以有多于一个表位。因此，不同的抗体可以与抗原上的不同区域结合，并且可以具有不同的生物学效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的空间并置氨基酸产生。线性表位是由多肽链中相邻的氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基基团或磺酰基基团的部分。

当提及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本上相同”表示，当与另一核酸(或其互补链)的适当核苷酸插入或缺失最佳地对齐时，在至少约95％，并且更优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，如通过任何众所周知的序列同一性算法诸如FASTA、BLAST或Gap测量的，如下所述。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本同一性的核酸分子可以编码具有与如由参考核酸分子编码的多肽相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。

当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上相似的”是指两个肽序列在最佳比对时(诸如通过使用默认间隙权重的程序GAP或BESTFIT)，共享至少95％的序列同一性，甚至更优选至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是指其中一个氨基酸残基被另一个具有有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基取代的保守氨基酸取代。一般来说，保守氨基酸取代不会显著地改变蛋白质的功能特性。在其中两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似度，以校正取代的保守性质。用于进行这种调整的手段是本领域技术人员熟知的。参见，例如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307-331，其通过引用并入本文。具有有类似化学性质的侧链的氨基酸基团的示例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445(其通过引用并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守”替代是指在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。

多肽的序列相似性(其也被称为序列同一性)通常使用序列分析软件测量。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量来匹配相似序列。例如，GCG软件包含诸如Gap和Bestfit的程序，这些程序可以与默认参数一起使用，以确定密切相关的多肽(诸如来自不同物种的生物体的同源多肽)之间的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG版本6.1。多肽序列也可以使用FASTA使用默认或推荐的参数进行比较，这是GCG版本6.1中的一个程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)，同上)。当将本发明的序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，其每一个通过引用并入本文。

种系突变

与衍生抗体的相应种系序列相比，本文公开的抗FcεR1α和/或抗CD3抗体在重链可变区的框架和/或CDR区域中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。

本发明还包括衍生自本文公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或CDR区域内的一个或多个氨基酸被突变为衍生抗体的种系序列的相应残基或被突变为另一人种系序列的相应残基，或被突变为对应种系残基的保守氨基酸取代(此类序列改变在本文中被统称为“种系突变”)，并且具有与FcεR1α或CD3抗原的所需结合特性，例如抗CD3抗体与CD3的弱结合或不可检测的结合。在表1中描述了几种识别FcεR1α的此类示例性抗体。在表3中描述了几种识别CD3的此类示例性抗体。

此外，本发明的抗体可以在框架和/或CDR区域内包含两种或更多种种系突变的任何组合，例如，其中某些单独的残基被突变为特定种系序列的相应残基，而与原始种系序列不同的某些其他残基被保持或突变为不同种系序列的相应残基。一旦获得，可以测试含有一种或多种种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所需性质，诸如改善的结合特异性、弱的或降低的结合亲和力、改善的或增强的药物动力学性质、降低的免疫原性等。给定本公开的指导，以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段包含在本发明中。

本发明还包括抗FcεR1α抗体，其包含本文公开的具有一个或多个保守取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中任一个的变体。例如，本发明包括具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗CD3抗体，相对于本文表1中所列的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，所述氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。与衍生单独的抗原结合结构域的相应种系序列相比，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子在重链可变结构域和轻链可变结构域的框架和/或CDR区域中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，同时维持或改善期望的与FcεR1α或CD3的结合，例如抗CD3抗体与CD3抗原的弱结合或不可检测的结合。“保守氨基酸取代”是指其中一个氨基酸残基被另一个具有有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基取代的保守氨基酸取代。一般来说，保守氨基酸取代不会显著地改变蛋白质的功能特性，即在抗FcεR1α和/或抗CD3结合分子的情况下，氨基酸取代保持或提高所需的结合亲和力，例如，抗CD3抗体与CD3抗原的弱至不可检测的结合。具有有类似化学性质的侧链的氨基酸基团的示例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守”替代是指在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。

本发明还包括抗原结合分子，其包含具有HCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合结构域，所述HCVR和/或CDR氨基酸序列与本文公开的任何HCVR和/或CDR氨基酸序列基本上相同，同时保持或改善对FcεR1α和/或CD3抗原的期望性质。当提及氨基酸序列时，术语“基本同一性”或“基本上相同”是指两个氨基酸序列在最佳比对时(诸如通过使用默认间隙权重的程序GAP或BESTFIT)，共享至少95％的序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似度，以校正取代的保守性质。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。

多肽的序列相似性(其也被称为序列同一性)通常使用序列分析软件测量。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量来匹配相似序列。例如，GCG软件包含诸如Gap和Bestfit的程序，这些程序可以与默认参数一起使用，以确定密切相关的多肽(诸如来自不同物种的生物体的同源多肽)之间的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG版本6.1。多肽序列也可以使用FASTA使用默认或推荐的参数进行比较，这是GCG版本6.1中的一个程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)，同上)。当将本发明的序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。

一旦获得，使用一种或多种体外测定法来测试包含一种或多种种系突变的抗原结合结构域的降低的结合亲和力。尽管通常通过测试对抗原的高(即强)结合亲和力来筛选识别特定抗原的抗体，但是本发明的抗体表现出弱结合或不可检测的结合。以这种一般方式获得的包含一个或多个抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子也包括在本发明中，并且发现其作为亲合力驱动的过敏疗法是有利的。

通过本文所述的方法可实现意想不到的益处，例如改善的药代动力学性质和对患者的低毒性。

抗体的结合特性

如本文所用，术语“结合”在抗体、免疫球蛋白、抗体结合片段或含Fc的蛋白与例如预定的抗原(诸如细胞表面蛋白)或其片段结合的背景下，通常指最少两个实体或分子结构之间的相互作用或结合，诸如抗体-抗原相互作用。

例如，当通过例如BIAcore 3000仪器中的表面等离子体共振(SPR)技术使用抗原作为配体和抗体、Ig、抗体结合片段或含Fc的蛋白质作为分析物(或抗配体)测定时，结合亲和力通常对应于约10^-6M或更小，诸如约10^-7M或更小，诸如约10^-8M或更小，诸如约10^-9M或更小的K_D值。也常规使用基于细胞的结合策略，诸如荧光激活细胞分选(FACS)结合测定，并且FACS数据与其他方法诸如放射性配体竞争结合和SPR很好地相关(Benedict,CA,J ImmunolMethods.1997,201(2):223-31；Geuijen,CA等人J Immunol Methods.2005,302(1-2):68-77)。

因此，本发明的抗体或抗原结合蛋白与预定的抗原或细胞表面分子(受体)结合，所述预定的抗原或细胞表面分子(受体)具有对应于K_D值的亲和力，所述K_D值比其与非特异性抗原(例如，BSA，酪蛋白)结合的亲和力低至少十倍。根据本发明，对应于K_D值等于或小于非特异性抗原的十倍的抗体的亲和力可以被认为是不可检测的结合，然而这种抗体可以与第二抗原结合臂配对以用于产生本发明的双特异性抗体。

术语“K_D”(M)指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，或与抗原结合的抗体或抗体结合片段的解离平衡常数。在K_D与结合亲和力之间存在反比关系，因此K_D值越小，亲和力越高，即越强。因此，术语“较高的亲和力”或“较强的亲和力”与形成相互作用的较大能力相关，并且因此K_D值较小，并且相反，术语“较低的亲和力”或“较弱的亲和力”与形成相互作用的较小能力相关，并且因此K_D值较大。在一些情况下，与分子(例如抗体)对另一个相互作用的分子伴侣(例如抗原Y)的结合亲和力相比，特定分子(例如抗体)对其相互作用的分子伴侣(例如抗原X)的较高的结合亲和力(或K_D)可以被表示为通过将较大的K_D值(较低或较弱的亲和力)除以较小的K_D(较高或较强的亲和力)确定的结合亲和比，例如被表示为较大的结合亲和力的5倍或10倍，可以视情况而定。

术语“K_d”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数，或抗体或抗体结合片段的解离速率常数。所述值也被称为k_off值。

术语“k_a”(M-1x sec-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数，或抗体或抗体结合片段的缔合速率常数。

术语“K_A”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数，或抗体或抗体结合片段的缔合平衡常数。缔合平衡常数通过用k_a除以k_d获得。

术语“EC50”或“EC₅₀”是指半最大有效浓度，其包括在规定的暴露时间后，在基线与最大值之间的中途诱导应答的抗体浓度。EC₅₀基本上代表其中观察到50％其最大效应的抗体的浓度。在某些实施例中，EC₅₀值等于本发明的抗体的浓度，其对表达CD3或过敏相关的抗原的细胞产生半最大结合，如通过例如FACS结合测定所确定的。因此，随着EC₅₀或半最大有效浓度值的增加，观察到减少的或较弱的结合。

在一个实施例中，减少的结合可以被定义为增加的EC₅₀抗体浓度，其使得能够结合至半最大量的靶细胞。

在另一个实施例中，EC₅₀值代表本发明的抗体的浓度，所述抗体通过T细胞细胞毒性活性引发靶细胞的半最大耗竭。因此，随着EC₅₀或半最大有效浓度值的降低，观察到增加的细胞毒性活性(例如T细胞介导的嗜碱性粒细胞杀伤)。

双特异性抗原结合分子

本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以包含对多于一种靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见，例如Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等人,2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。本发明的抗FcεR1α单特异性抗体或抗FcεR1α/抗CD3双特异性抗体可以与另一种功能分子例如另一种肽或蛋白质连接或共表达。例如，抗体或其片段可以被功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)到一个或多个其他分子实体上，诸如另一抗体或抗体片段，以产生具有第二或额外结合特异性的双特异性或多特异性抗体。

本文表述“抗CD3抗体”或“抗FcεR1α抗体”的使用旨在包括单特异性抗CD3或抗FcεR1α抗体以及包含CD3结合臂和FcεR1α结合臂的双特异性抗体两者。因此，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂结合人CD3，并且免疫球蛋白的另一个臂对人FcεR1α具有特异性。CD3结合臂可以包含如本文表3中所列的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。

在某些实施例中，CD3结合臂结合至人CD3并诱导人T细胞活化。在某些实施例中，CD3结合臂与人CD3弱结合并诱导人T细胞活化。在其他实施例中，在双特异性或多特异性抗体的情况下，CD3结合臂与人CD3弱结合并诱导肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞的消融。在其他实施例中，CD3结合臂与人CD3结合或弱缔合，但结合相互作用不能通过本领域已知的体外测定法检测到。FcεR1α结合臂可以包含如本文表1中所列的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。

根据某些示例性实施例，本发明包括特异性地结合CD3和FcεR1α的双特异性抗原结合分子。此类分子在本文中可以被称为，例如，“抗CD3/抗FcεR1α”，或“抗CD3xFcεR1α”，或“抗FcεR1α/抗CD3”，或“抗FcεR1αxCD3”，或“CD3xFcεR1α”双特异性分子，或“FcεR1αxCD3”双特异性分子，或其他类似术语(例如，抗FcεR1αx抗CD3)。

如本文所用，术语“FcεR1α”是指人FcεR1α蛋白，除非指定其来自非人物种(例如，“小鼠FcεR1α”、“猴FcεR1α”等)。人FcεR1α蛋白具有如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。

上述特异性地结合CD3和FcεR1α的双特异性抗原结合分子可以包含以弱结合亲和力结合至CD3的抗CD3抗原结合分子，诸如表现出如通过体外亲和力结合测定测得的大于约40nM的K_D。

如本文所用，表述“抗原结合分子”是指包含或由至少一个互补决定区(CDR)组成的蛋白质、多肽或分子复合物，所述至少一个互补决定区单独或与一个或多个另外的CDR和/或框架区(FR)组合，特异性地结合至特定抗原。在某些实施例中，抗原结合分子是抗体或抗体的片段，如这些术语在本文其他地方所定义。

如本文所用，表述“双特异性抗原结合分子”是指包含至少第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的蛋白质、多肽或分子复合物。双特异性抗原结合分子中的每个抗原结合结构域包含至少一个CDR，其单独或与一个或多个另外的CDR和/或FR组合，特异性地结合至特定抗原。在本发明的上下文中，第一抗原结合结构域特异性地结合第一抗原(例如CD3)，并且第二抗原结合结构域特异性地结合第二不同抗原(例如FcεR1α)。

在本发明的某些示例性实施例中，双特异性抗原结合分子是双特异性抗体。双特异性抗体的每个抗原结合结构域都包含重链可变结构域(HCVR)和轻链可变结构域(LCVR)。在包含第一和第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)的情况下，第一抗原结合结构域的CDR可以用前缀“A1”表示，并且第二抗原结合结构域的CDR可以用前缀“A2”表示。因此，第一抗原结合结构域的CDR在本文中可以被称为A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3；并且第二抗原结合结构域的CDR在本文中可以被称为A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3。

第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以彼此直接或间接连接，以形成本发明的双特异性抗原结合分子。可替代地，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以各自连接到单独的多聚化结构域。一个多聚化结构域与另一个多聚化结构域的缔合促进了两个抗原结合结构域之间的缔合，从而形成双特异性抗原结合分子。如本文所用，“多聚化结构域”是任何大分子、蛋白质、多肽、肽或氨基酸，其具有与相同或相似结构或组成的第二多聚化结构域缔合的能力。例如，多聚化结构域可以是包含免疫球蛋白C_H3结构域的多肽。多聚化组分的非限制性示例是免疫球蛋白的Fc部分(包含C_H2-C_H3结构域)，例如选自同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG的Fc结构域，以及每个同种型组内的任何异型。

本发明的双特异性抗原结合分子通常将包含两个多聚化结构域，例如，两个Fc结构域，其各自独立地为单独的抗体重链的一部分。第一多聚化结构域和第二多聚化结构域可以是相同的IgG同种型，诸如例如IgG1/IgG1、IgG2/IgG2和IgG4/IgG4。可替代地，第一多聚化结构域和第二多聚化结构域可以是不同的IgG同种型，诸如例如IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。

在某些实施例中，多聚化结构域是Fc片段或长度为1至约200个氨基酸的氨基酸序列，其包含至少一个半胱氨酸残基。在其他实施例中，多聚化结构域是半胱氨酸残基，或短的含半胱氨酸的肽。其他多聚化结构域包括肽或多肽，其包含亮氨酸拉链、螺旋-环基序或螺旋-卷曲基序或由其组成。

任何双特异性抗体形式或技术可以用于制备本发明的双特异性抗原结合分子。例如，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可以在功能上连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)到一个或多个其他分子实体，诸如具有第二抗原结合特异性的另一抗体或抗体片段，以产生双特异性抗原结合分子。可以用于本发明上下文中的特定示例性双特异性形式包括但不限于，例如基于scFv的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合、双可变结构域(DVD)-Ig、Quadroma、旋钮入孔、共同轻链(例如，具有旋钮入孔的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab²双特异性形式(参见，例如，Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11和其中引用的参考文献，用于综述上述形式)。

在本发明的双特异性抗原结合分子的背景下，与野生型天然存在的Fc结构域版本相比，多聚化结构域例如Fc结构域可以包含一个或多个氨基酸改变(例如插入、缺失或取代)。例如，本发明包括双特异性抗原结合分子，其在Fc结构域中包含一个或多个修饰，这导致在Fc与FcRn之间具有修饰的结合相互作用(例如，增强的或减少的)的修饰的Fc结构域。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子包含C_H2或C_H3区域中的修饰，其中所述修饰增加了在酸性环境中(例如，在其中pH范围为约5.5至约6.0的内泌体中)Fc结构域对FcRn的亲和力。此类Fc修饰的非限制性示例包括，例如，位置250(例如，E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)处的修饰；或位置250和/或428处的修饰；或位置307或308(例如F或P)和434处的修饰。在一个实施例中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如，308F或308P)。

本发明还包括包含第一C_H3结构域和第二Ig C_H3结构域的双特异性抗原结合分子，其中第一和第二Ig C_H3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异降低了双特异性抗体与蛋白质A的结合。在一个实施例中，第一Ig C_H3结构域结合蛋白质A，并且第二Ig C_H3结构域含有减少或消除蛋白质A结合的突变，诸如H95R修饰(通过IMGT外显子编号；H435R(通过EU编号))。第二C_H3可以进一步包含Y96F修饰(通过IMGT；Y436F(通过EU))。参见，例如美国专利第8,586,713号。在第二C_H3中可能发现的进一步修饰包括：在IgG1抗体的情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(通过IMGT；D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I(通过EU))；在IgG2抗体的情况下的N44S、K52N和V82I(IMGT；N384S、K392N和V422I(通过EU))；以及在IgG4抗体的情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(通过IMGT；Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I(通过EU))。

在某些实施例中，Fc结构域可以是嵌合的，结合了衍生自多于一种免疫球蛋白同种型的Fc序列。例如，嵌合Fc结构域可以包含源自人IgG1、人IgG2或人IgG4 C_H2区域的部分或全部C_H2序列，以及源自人IgG1、人IgG2或人IgG4的部分或全部C_H3序列。嵌合Fc结构域也可以包含嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可以包含来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”序列，其与来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列组合。可以包括在本文所述的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的具体示例包含，从N末端至C末端：[IgG4 C_H1]-[IgG4上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4 CH2]-[IgG4 CH3]。可以包括在本文所述的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的另一个示例包含，从N末端至C末端：[IgG1 C_H1]-[IgG1上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4 CH2]-[IgG1CH3]。在2014年8月28日公布的美国公开2014/0243504(其以其整体并入本文)中描述了可以包括在本发明的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的这些和其他示例。具有这些一般结构排列的嵌合Fc结构域及其变体可以具有改变的Fc受体结合，这进而影响Fc效应子功能。

在某些实施例中，本发明提供了一种抗体重链，其中所述重链恒定区(CH)区域包含与SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:56中任一个至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，重链恒定区(CH)区域包含选自由SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:56组成的组的氨基酸序列。

序列变体

与衍生单独的抗原结合结构域的相应种系序列相比，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区域中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定这种突变。本发明的抗原结合分子可以包含衍生自本文公开的任何示例性氨基酸序列的抗原结合结构域，其中一个或多个框架和/或CDR区域内的一个或多个氨基酸被突变为衍生抗体的种系序列的相应残基，或被突变为另一人种系序列的相应残基，或被突变为相应种系残基的保守氨基酸取代(这种序列改变在本文中被统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地产生包含一个或多个单独种系突变或其组合的多个抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，V_H和/或V_L结构域内的所有框架和/或CDR残基被突变回到在最初衍生抗原结合结构域的原始种系序列中发现的残基。在其他实施例中，仅某些残基被突变回到原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸或FR4的后8个氨基酸中发现突变的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3中发现突变的残基。在其他实施例中，框架和/或CDR残基中的一个或多个被突变为不同种系序列(即，与最初衍生抗原结合结构域的种系序列不同的种系序列)的相应残基。此外，抗原结合结构域可以在框架和/或CDR区域内包含两种或更多种种系突变的任何组合，例如，其中某些单独的残基被突变为特定种系序列的相应残基，而与原始种系序列不同的某些其他残基被保持或突变为不同种系序列的相应残基。一旦获得，可以容易地测试包含一种或多种种系突变的抗原结合结构域的一种或多种所需的性质，诸如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善的或增强的拮抗或激动生物学性质(可以视情况而定)、降低的免疫原性等。以这种一般方式获得的包含一个或多个抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子包括在本发明中。

本发明还包括抗原结合分子，其中一个或两个抗原结合结构域包含本文公开的具有一个或多个保守取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中任一个的变体。例如，本发明包括抗原结合分子，其包含具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合结构域，相对于本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，所述HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指其中一个氨基酸残基被另一个具有有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基取代的保守氨基酸取代。一般来说，保守氨基酸取代不会显著地改变蛋白质的功能特性。具有有类似化学性质的侧链的氨基酸基团的示例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445(其通过引用并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守”替代是指在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。

本发明还包括抗原结合分子，其包含具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合结构域，所述氨基酸序列与本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列基本相同。当提及氨基酸序列时，术语“基本同一性”或“基本上相同”是指两个氨基酸序列在最佳比对时(诸如通过使用默认间隙权重的程序GAP或BESTFIT)共享至少95％的序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。在其中两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似度，以校正取代的保守性质。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，其通过引用并入本文。

多肽的序列相似性(其也被称为序列同一性)通常使用序列分析软件测量。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量来匹配相似序列。例如，GCG软件包含诸如Gap和Bestfit的程序，这些程序可以与默认参数一起使用，以确定密切相关的多肽(诸如来自不同物种的生物体的同源多肽)之间的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG版本6.1。多肽序列也可以使用FASTA使用默认或推荐的参数进行比较，这是GCG版本6.1中的一个程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)，同上)。当将本发明的序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，其每一个通过引用并入本文。

依赖于pH的结合

本发明包括具有依赖于pH的结合特性的抗FcεR1α抗体和抗CD3/抗FcεR1α双特异性抗原结合分子。例如，本发明的抗FcεR1α抗体可以表现出与中性pH相比在酸性pH下对FcεR1α减少的结合。可替代地，本发明的抗FcεR1α抗体可以表现出与中性pH相比在酸性pH下对FcεR1α增强的结合。表述“酸性pH”包括小于约6.2的pH值，例如约6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更小。如本文所用的，表述“中性pH”是指约7.0至约7.4的pH。表述“中性pH”包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4的pH值。

在某些情况下，“与中性pH相比在酸性pH下对……减少的结合”根据在酸性pH下与其抗原结合的抗体的K_D值与在中性pH下与其抗原结合的抗体的K_D值的比率(或者反之亦然)来表示。例如，就本发明而言，如果抗体或其抗原结合片段表现出约3.0或更大的酸性/中性K_D比，则可以认为抗体或其抗原结合片段表现出“与中性pH相比在酸性pH下与FcεR1α减少的结合”。在某些示例性实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性K_D比可以是约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更高。

可以获得具有依赖于pH的结合特性的抗体，例如，通过筛选与中性pH相比在酸性pH下与特定抗原减少(或增强)的结合的抗体群体。此外，在氨基酸水平修饰抗原结合结构域可以产生具有依赖于pH的特性的抗体。例如，通过用组氨酸残基取代抗原结合结构域的一个或多个氨基酸(例如，在CDR中)，可以获得相对于中性pH在酸性pH下具有减少的抗原结合的抗体。

包含Fc变体的抗体

根据本发明的某些实施例，提供了包含Fc结构域的抗FcεR1α抗体和抗CD3/抗FcεR1α双特异性抗原结合分子，所述Fc结构域包含一种或多种突变，所述突变例如在酸性pH下与中性pH相比增强或降低抗体与FcRn受体的结合。例如，本发明包括在Fc结构域的C_H2或C_H3区域中包含突变的抗体，其中所述突变增加了在酸性环境中(例如，在其中pH范围为约5.5至约6.0的内泌体中)Fc结构域对FcRn的亲和力。当施用于动物时，这种突变可能导致抗体的血清半衰期增加。此类Fc修饰的非限制性示例包括，例如，位置250(例如，E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或位置428和/或433(例如，H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如，H/F或Y)处的修饰；或位置250和/或428处的修饰；或位置307和/或308(例如，F或P)和434处的修饰。在一个实施例中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；307修饰和/或308修饰(例如308F或308P)。

例如，本发明包括抗FcεR1α抗体和抗CD3/抗FcεR1α双特异性抗原结合分子，其包含Fc结构域，所述Fc结构域包含选自由以下组成的组的一对或多对或一组或多组突变：250Q和248L(例如，T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；和433K和434F(例如H433K和N434F)。前述Fc结构域突变和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变的所有可能组合都预期在本发明的范围内。

抗体和双特异性抗原结合分子的生物学特性

根据某些实施例，本发明包括以小于约303nM的K_D结合人FcεR1α(例如，在25℃下)或以小于约467nM的K_D结合食蟹猴FcεR1α(例如，在25℃下)的抗体和抗体的抗原结合片段，如通过表面等离子体共振测量的，例如使用如本文实例3中定义的测定形式。在某些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段以小于约400nM、小于约500nM、小于约450nM、小于约400nM、小于约350nM、小于约300nM、小于约250nM、小于约200nM、小于约150nM或小于约100nM的K_D结合人或食蟹猴FcεR1α，如通过表面等离子体共振测量的，例如，使用本文如实例3中定义的测定形式(例如，mAb-捕获或抗原-捕获形式)，或基本上类似的测定。本发明包括双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体，其以小于约467nM的K_D结合人或食蟹猴FcεR1α，如通过表面等离子体共振测量的，例如，使用本文如实例3中定义的测定形式(例如，mAb-捕获或抗原-捕获形式)，或基本上类似的测定。

本发明还包括抗体及其抗原结合片段，其以大于约0.2分钟或大于约0.5分钟的解离半衰期(t1/2)结合人FcεR1α，或者以大于约0.3分钟或大于约0.6分钟的解离半衰期(t1/2)结合食蟹猴FcεR1α，如通过25℃下的表面等离子体共振测量的，例如使用如本文实例3中定义的测定形式，或基本类似的测定。本发明包括以大于约0.54分钟或大于约1.1分钟的K_D结合人或食蟹猴FcεR1α的双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)，如通过25℃下的表面等离子体共振测量的，例如，使用如本文实例3中定义的测定形式，或基本上类似的测定。

本发明还包括抗体及其抗原结合片段，其特异性地结合至表达人或食蟹猴FcεR1α的人细胞系(例如，经工程改造以表达人或食蟹猴FcεR1α的HEK293细胞)，如通过如实例4中所述的基于流式细胞术的检测测定或基本上类似的测定所确定的。

本发明还包括抗CD3/抗FcεR1α双特异性抗原结合分子，其表现出一种或多种选自由以下组成的组的特性：(a)在存在或不存在IgE的情况下与在细胞表面上表达的FcεR1α结合(参见，例如实例4)；(b)在存在表达FcεR1α的细胞的情况下激活人CD3信号传导(参见，例如实例5)；(c)体外诱导表达FcεR1α的细胞的T细胞介导的凋亡(参见，例如实例6)；(d)体外诱导外周血单核细胞(PBMC)群体中嗜碱性粒细胞的T细胞介导的杀伤(参见，例如实例6)；(e)阻断表达人FcεR1α的小鼠中过敏原诱导的肥大细胞脱颗粒(例如，过敏反应)(参见，例如实例7)；和(f)在表达人FcεR1α的小鼠中消耗脾嗜碱性细胞(参见，例如实例7)。

本发明包括以高亲和力结合人CD3的抗体及其抗原结合片段。本发明还包括以中等或低亲和力结合人CD3的抗体及其抗原结合片段，这取决于治疗背景和所需的特定靶向性质。本发明还包括以不可测量的亲和力结合人CD3的抗体及其抗原结合片段。例如，在双特异性抗原结合分子的背景下，其中一个臂结合CD3，并且另一个臂结合靶抗原(例如，FcεR1α)，可能期望靶抗原结合臂以高亲和力结合靶抗原，而抗CD3臂仅以中等或低亲和力或无亲和力结合CD3。以这种方式，可以实现抗原结合分子对表达靶抗原的细胞的优先靶向，同时避免一般的/未靶向的CD3结合和随后与之相关的不利副作用。

本发明包括能够同时结合至人CD3和人FcεR1α的双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)。与表达CD3的细胞相互作用的结合臂可能具有弱至不可检测的结合，如在合适的体外结合测定中所测量的。双特异性抗原结合分子结合表达CD3和/或FcεR1α的细胞的程度可以通过荧光活化细胞分选(FACS)来评估，如本文实例4所示。

例如，本发明包括特异性地结合表达CD3但不表达FcεR1α的人T细胞系、灵长类T细胞(例如食蟹猴外周血单核细胞[PBMC])和/或表达FcεR1α的细胞的抗体、抗原结合片段及其双特异性抗体。

本发明包括以弱(即低)或甚至不可检测的亲和力结合人CD3的抗体、抗原结合片段及其双特异性抗体。

本发明包括以弱(即低)或甚至不可检测的亲和力结合猴(食蟹猴)CD3的抗体、抗原结合片段及其双特异性抗体。

本发明包括结合人CD3并诱导T细胞活化的抗体、抗原结合片段及其双特异性抗体。

本发明包括抗CD3/抗FcεR1α双特异性抗原结合分子，其能够抑制受试者中的过敏反应和/或耗竭表达FcεR1α的细胞(参见例如实例7，在被动皮肤过敏反应(PCA)或基于流式细胞术的测定中，或基本上类似的测定)。例如，根据某些实施例，提供了抗CD3/抗FcεR1α双特异性抗原结合分子，其中对受试者单次施用25mg/kg的双特异性抗原结合分子导致受试者中表达FcεR1α的细胞的数量减少(例如，脾嗜碱性细胞的数量显著减少)。

表位映射及相关技术

本发明的抗原结合分子结合到的CD3和/或FcεR1α上的表位可以由CD3或FcεR1α蛋白的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单个连续序列组成。可替代地，表位可以由CD3或FcεR1α的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。本发明的抗体可以与包含在单个CD3链中的氨基酸(例如，CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)相互作用，或者可以与两个或更多个不同CD3链上的氨基酸相互作用。如本文所用，术语“表位”是指与被称为副表位的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有多于一个的表位。因此，不同的抗体可以与抗原上的不同区域结合，并可以具有不同的生物学效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中相邻的氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖部分、磷酰基基团或磺酰基基团。

本领域普通技术人员已知的各种技术可以用于确定抗体的抗原结合结构域是否与多肽或蛋白质中的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性的技术包括，例如，常规交叉阻断测定，诸如所述的抗体，Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,NY)、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)和肽切割分析。此外，还可以采用诸如抗原的表位切除、抗原的表位提取和化学修饰等方法(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。另一种可以用于鉴定多肽中与抗体的抗原结合结构域相互作用的氨基酸的方法是通过质谱检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法包括对目标蛋白进行氘标记，然后将抗体与氘标记的蛋白结合。接下来，将蛋白质/抗体复合物转移至水中，以允许除了被抗体保护的残基(其保持氘标记)之外的所有残基发生氢-氘交换。在抗体解离后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示与抗体相互作用的特定氨基酸对应的氘标记的残基。参见，例如Ehring(1999)AnalyticalBiochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。抗原/抗体复合物的X射线晶体学也可以用于表位映射目的。

本发明进一步包括抗FcεR1α抗体，其与本文所述的任何特定示例性抗体(例如，包含如本文表1中所列的任何氨基酸序列的抗体)结合至相同的表位。同样，本发明还包括抗FcεR1α抗体，其与本文所述的任何特定示例性抗体(例如，包含如本文表1中所列的任何氨基酸序列的抗体)竞争结合至FcεR1α。

本发明还包括双特异性抗原结合分子，其包含以低的或可检测的结合亲和力特异性地结合人CD3和/或食蟹猴CD3的第一抗原结合结构域，和特异性地结合人或食蟹猴FcεR1α的第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域与本文所述的任何特定示例性CD3特异性抗原结合结构域结合至CD3上的相同的表位，和/或其中所述第二抗原结合结构域与本文所述的任何特定示例性FcεR1α特异性抗原结合结构域结合至FcεR1α上的相同的表位。

同样，本发明还包括双特异性抗原结合分子，其包含特异性地结合人CD3的第一抗原结合结构域和特异性地结合人FcεR1α的第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域与本文所述的任何特定示例性CD3特异性抗原结合结构域竞争结合至CD3，和/或其中所述第二抗原结合结构域与本文所述的任何特定示例性FcεR1α特异性抗原结合结构域竞争结合至FcεR1α。

通过使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定特定的抗原结合分子(例如抗体)或其抗原结合结构域是否与本发明的参考抗原结合分子结合至相同的表位或与本发明的参考抗原结合分子竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参考双特异性抗原结合分子结合至FcεR1α(或CD3)上的相同的表位，首先允许参考双特异性分子与FcεR1α蛋白(或CD3蛋白)结合。接下来，评估测试抗体与FcεR1α(或CD3)分子结合的能力。如果在与参考双特异性抗原结合分子饱和结合后，测试抗体能够与FcεR1α(或CD3)结合，则可以得出结论：测试抗体与参考双特异性抗原结合分子结合至FcεR1α(或CD3)上的不同的表位。另一方面，如果在与参考双特异性抗原结合分子饱和结合后，测试抗体不能与FcεR1α(或CD3)分子结合，那么测试抗体可能结合至FcεR1α(或CD3)上的被本发明的参考双特异性抗原结合分子结合的相同的表位。然后可以进行另外的常规实验(例如肽突变和结合分析)，以确认观察到的测试抗体结合的缺乏是否实际上是由于与参考双特异性抗原结合分子结合至相同的表位，或者空间阻断(或另一种现象)是否是观察到的结合缺乏的原因。这类实验可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域可获得的任何其他定量或定性抗体结合测定法进行。根据本发明的某些实施例，如果例如1、5、10、20或100倍过量的一种抗原结合蛋白以至少50％，但优选地75％、90％或甚至99％抑制另一种抗原结合蛋白的结合，如在竞争性结合测定中测量的(参见，例如Junghans等人,Cancer Res.1990:50:1495-1502)，则两种抗原结合蛋白结合至相同的(或重叠的)表位。可替代地，如果抗原中减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗原结合蛋白的结合，则认为两种抗原结合蛋白结合至相同的表位。如果只有减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的氨基酸突变子集减少或消除另一种抗原结合蛋白的结合，则认为两种抗原结合蛋白具有“重叠的表位”。

为了确定抗体或其抗原结合结构域是否与参考抗原结合分子竞争结合，在两个方向上进行上述结合方法：在第一方向上，允许参考抗原结合分子在饱和条件下与FcεR1α蛋白(或CD3蛋白)结合，然后评估测试抗体与FcεR1α(或CD3)分子的结合。在第二方向上，允许测试抗体在饱和条件下与FcεR1α(或CD3)分子结合，然后评估参考抗原结合分子与FcεR1α(或CD3)分子的结合。如果在两个方向上，只有第一(饱和)抗原结合分子能够与FcεR1α(或CD3)分子结合，则可以得出结论：测试抗体和参考抗原结合分子竞争结合至FcεR1α(或CD3)。如本领域普通技术人员将理解的，与参考抗原结合分子竞争结合的抗体不一定与参考抗体结合至相同的表位，而是可以通过结合重叠或相邻的表位在空间上阻断参考抗体的结合。

抗原结合结构域的制备及双特异性分子的构建

可以通过本领域中已知的任何抗体产生技术来制备对特定抗原具有特异性的抗原结合结构域。一旦获得，可以使用常规方法将对两种不同抗原(例如，CD3和FcεR1α)具有特异性的两种不同的抗原结合结构域相对于彼此进行适当排列以产生本发明的双特异性抗原结合分子。(本文其他地方提供了可以用于构建本发明的双特异性抗原结合分子的示例性双特异性抗体形式的讨论)。在某些实施例中，本发明的多特异性抗原结合分子的一种或多种单独组分(例如重链和轻链)来源于嵌合的抗体、人源化的抗体或完全人源化的抗体。用于制备这种抗体的方法是本领域熟知的。例如，本发明的双特异性抗原结合分子的一个或多个重链和/或轻链可以使用VELOCIMMUNE^TM技术制备。使用VELOCIMMUNE^TM技术(或任何其他人抗体产生技术)，针对特定抗原(例如CD3或FcεR1α)的高亲和力嵌合抗体最初被分离出来，其具有人可变区和小鼠恒定区。对抗体进行表征，并针对所需的特性(包括亲和力、选择性、表位等)进行选择。用所需的人恒定区替换小鼠恒定区以产生可以掺入到本发明的双特异性抗原结合分子中的完全人重链和/或轻链。

基因工程改造的动物可以用于制备人双特异性抗原结合分子。例如，可以使用不能重排和表达内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列的经遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠仅表达一个或两个由人免疫球蛋白序列编码的人轻链可变结构域，所述人免疫球蛋白序列在内源性小鼠κ基因座与小鼠κ恒定基因可操作地连接。这种经遗传修饰的小鼠可以用于产生完全人双特异性抗原结合分子，所述分子包含与相同轻链缔合的两种不同重链，所述相同轻链包含衍生自两种不同人轻链可变区基因区段之一的可变结构域。(参见，例如US 2011/0195454)。完全人序列是指抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域，其包含在抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域的每个多肽的全长上由源自人序列的DNA编码的氨基酸序列。在一些情况下，完全人序列来自于对人内源性的蛋白质。在其他情况下，完全人蛋白质或蛋白质序列包含嵌合序列，其中每种组分序列源自人类序列。尽管不受任何一种理论的约束，但嵌合蛋白或嵌合序列通常被设计成例如与任何野生型人免疫球蛋白区域或结构域相比，使在组分序列的连接处产生免疫原性表位最小化。

生物等效性

本发明包括具有氨基酸序列的抗原结合分子，所述氨基酸序列与本文公开的示例性分子的氨基酸序列不同，但保留结合CD3和/或FcεR1α的能力。当与亲本序列相比时，此类变体分子可以包含氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但是表现出基本上等同于所述双特异性抗原结合分子的生物活性。

本发明包括与本文所述的任何示例性抗原结合分子生物等效的抗原结合分子。如果两种抗原结合蛋白或抗体(例如，它们是药物等效物或替代药物)在相似实验条件下(单剂量或多剂量)以相同摩尔剂量施用时，其吸收速率和程度未显示出显著差异，则认为它们是生物等效的。如果一些抗原结合蛋白的吸收程度相同但吸收速率不同，则它们将被视为等同物或药物替代品，但仍可被视为生物等效的，因为吸收速率的此类差异是有意的，并且反映在标签中，对于在例如慢性使用中达到有效的体内药物浓度不是必需的，且对于所研究的特定药物产品而言被视为医学上无关紧要的。

在一个实施例中，如果两种抗原结合蛋白的安全性、纯度和效力没有临床意义上的差异，则它们是生物等效的。

在一个实施例中，如果患者可以在参考产品与生物产品之间切换一次或多次，而与没有此类切换的持续疗法相比没有不良作用的风险的预期的增加(包括免疫原性的临床显著变化或降低的有效性)，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。

在一个实施例中，如果两种抗原结合蛋白都通过一种或多种共同的作用机制对一种或多种使用条件起作用，则这两种抗原结合蛋白是生物等效的，只要这种机制是已知的。

可以通过体内和体外方法来证明生物等效性。生物等效性测量包括，例如，(a)在人或其他哺乳动物中进行的体内测试，其中测量了在血液、血浆、血清或其他生物液体中抗体或其代谢物的浓度随时间的变化；(b)与人体内生物利用度数据相关并可合理预测的体外测试；(c)在人或其他哺乳动物中进行的体内测试，其中测量抗体(或其靶)的适当急性药理学作用随时间的变化；和(d)确定抗原结合蛋白的安全性、功效或生物利用度或生物等效性的良好控制的临床试验。

本文所述的示例性双特异性抗原结合分子的生物等效变体可以通过例如进行残基或序列的各种取代或删除生物活性不需要的末端或内部残基或序列来构建。例如，对生物活性不是必需的半胱氨酸残基可以被删除或用其他氨基酸替换，以防止复性时形成不必要或不正确的分子内二硫键。在其他背景下，生物等效的抗原结合蛋白可以包括本文所述的示例性双特异性抗原结合分子的变体，其包含修饰分子的糖基化特性的氨基酸改变，例如消除或去除糖基化的突变。

物种选择性和物种交叉反应性

根据本发明的某些实施例，提供了与人CD3结合的抗原结合分子。还提供了与人FcεR1α结合的抗原结合分子。本发明还包括结合至人CD3或结合至来自一种或多种非人物种的CD3的抗原结合分子；和/或结合至人FcεR1α或和结合至来自一种或多种非人物种例如食蟹猴的FcεR1α的抗原结合分子。

根据本发明的某些示例性实施例，提供了抗原结合分子，其结合至人CD3和/或人FcεR1α并且可以结合至或可以不结合至(可以视情况而定)小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、食蟹猴、狨猴、恒河猴、食蟹猴或黑猩猩CD3和/或FcεR1α中的一种或多种。例如，在本发明的特定示例性实施例中，提供了双特异性抗原结合分子，其包含结合人CD3的第一抗原结合结构域和结合人或食蟹猴FcεR1α的第二抗原结合结构域。

治疗性制剂和施用

本发明提供了包含本发明的抗原结合分子的药物组合物。本发明的药物组合物与合适的载体、赋形剂和提供改进的转移、递送、耐受性等的其他药剂一起配制。多种合适的制剂可以在所有药物化学家都熟知的处方集中找到：Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括，例如，粉末、糊剂、软膏、胶冻、蜡、油、脂质、含囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(诸如LIPOFECTIN^TM,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、碳蜡乳液(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm SciTechnol52:238-311。

施用给患者的抗原结合分子的剂量可以根据患者的年龄和体型、目标疾病、条件、施用途径等而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积计算。当本发明的双特异性抗原结合分子用于成年患者中的治疗目的时，通常以约0.01至约50mg/kg体重、更优选地约0.1至约25mg/kg体重、约1至约25mg/kg体重或约5至约25mg/kg体重的单剂量静脉内施用本发明的双特异性抗原结合分子可能是有利的。根据病症的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。用于施用双特异性抗原结合分子的有效剂量和时间表可以根据经验确定；例如，可以通过定期评估来监测患者进展，并相应地调整剂量。此外，可以使用本领域中公知的方法进行剂量的种间缩放(例如，Mordenti等人,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。

各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本发明的药物组合物，例如，包封在脂质体、微粒、微囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用中(参见，例如Wu等人,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。该组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注、通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。

本发明的药物组合物可以用标准针和注射器皮下或静脉内递送。此外，关于皮下递送，笔递送装置容易在递送本发明的药物组合物中具有应用。这种笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常利用容纳药物组合物的可更换药筒。一旦药筒内的所有药物组合物已经施用并且药筒是空的，空的药筒可以容易地被丢弃并且用包含药物组合物的新药筒替换。然后，可以重复使用笔递送装置。在一次性笔递送装置中，没有可更换的药筒。相反，一次性笔递送装置预填充有保持在装置内的储器中的药物组合物。一旦储器中的药物组合物被排空，则整个装置被丢弃。

多种可重复使用的笔和自动注射器递送装置在皮下递送本发明的药物组合物中具有应用。示例包括但不限于AUTOPEN^TM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONIC^TM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX75/25^TM笔、HUMALOG^TM笔、HUMALIN 70/30^TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPEN^TMI、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIOR^TM(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)、BD^TM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPEN^TM、OPTIPEN PRO^TM、OPTIPEN STARLET^TM和OPTICLIK^TM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，仅举几个例子。在皮下递送本发明的药物组合物中具有应用的一次性笔递送装置的示例包括但不限于SOLOSTAR^TM笔(sanofi-aventis)、FLEXPEN^TM(Novo Nordisk)和KWIKPEN^TM(Eli Lilly)、SURECLICK^TM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLET^TM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRA^TM笔(Abbott Labs,AbbottPark IL)，仅举几个例子。

在某些情况下，药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施例中，可以使用泵(参见Langer，同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施例中，可以使用聚合物材料；参见，Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编辑),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在另一个实施例中，可以将控释系统置于组合物的靶附近，因此仅需要部分系统剂量(参见，例如，Goodson,1984,in MedicalApplications of Controlled Release,同上,vol.2,pp.115-138)。在Langer,1990,Science249:1527-1533的综述中讨论了其他控释系统。

可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公知的方法制备。例如，可以通过例如将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备可注射制剂。作为用于注射的水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，其可以与合适的增溶剂诸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性介质，可以使用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂诸如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。如此制备的注射剂优选地被填充在合适的安瓿中。

有利地，将上述用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备成适于活性成分剂量的单位剂量的剂型。单位剂量的此类剂型包括，例如，片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所包含的上述抗体的量通常为单位剂量中每剂型约5至约500mg；特别是在注射形式中，优选的是上述抗体以约5至约100mg被包含，并且对于其他剂型以约10至约250mg被包含。

抗原结合分子的治疗用途

本发明包括包含向需要其的受试者施用治疗组合物的方法，所述治疗组合物包含抗FcεR1α抗体或其抗原结合片段，或特异性地结合CD3和FcεR1α的双特异性抗原结合分子。治疗组合物可以包含如本文公开的任何抗体或双特异性抗原结合分子以及药学上可接受的载体或稀释剂。如本文所用，表述“需要其的受试者”是指表现出一种或多种与FcεR1α相关的疾病或障碍(诸如肥大细胞活化障碍、肥大细胞增多症或过敏(例如，受试者患有任何类型的过敏或表现出任何过敏反应))的症状或体征的人或非人动物，或否则将受益于FcεR1α活性的抑制或降低或FcεR1α+细胞的耗竭(例如，过敏反应)的人或非人动物。

本发明的抗体和双特异性抗原结合分子(以及包含它们的治疗组合物)尤其可用于治疗其中刺激、活化和/或靶向免疫应答将是有益的任何疾病或障碍。特别地，本发明的抗FcεR1α抗体或抗CD3/抗FcεR1α双特异性抗原结合分子可以用于治疗、预防和/或改善与FcεR1α表达或活性或FcεR1α+细胞的增殖相关或由其介导的任何疾病或障碍。实现本发明的治疗方法的作用机制包括在效应细胞的存在下杀伤表达FcεR1α的细胞，例如通过CDC、凋亡、ADCC、吞噬作用，或通过这些机制中的两种或更多种的组合。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子抑制或杀伤的表达FcεR1α的细胞包括例如肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞。

本发明的抗原结合分子可以用于治疗与IgE或FcεR1α表达相关的疾病或障碍，包括例如肥大细胞活化障碍(诸如肥大细胞活化综合征)、肥大细胞增多症或过敏，包括过敏性哮喘、枯草热、过敏反应、特应性皮炎、慢性荨麻疹、食物过敏和花粉过敏。如本文其他部分所列出的，过敏可能是由于暴露于一种或多种过敏原引起的。根据本发明的某些实施例，抗FcεR1α抗体或抗FcεR1α/抗CD3双特异性抗体可用于治疗患有严重过敏(包括过敏反应)的患者。根据本发明的其他相关实施例，提供了包含向患有过敏反应的患者施用如本文公开的抗FcεR1α抗体或抗CD3/抗FcεR1α双特异性抗原结合分子的方法。本领域已知的分析/诊断方法(诸如过敏反应测试等)可以用于确定患者是否患有过敏反应。

根据某些方面，本发明提供用于治疗与FcεR1α表达相关的疾病或障碍(例如，过敏反应)的方法，所述方法包含在已确定受试者具有过敏之后向所述受试者施用本文其他地方所述的抗FcεR1α或双特异性抗原结合分子中的一种或多种。例如，本发明包括用于治疗过敏的方法，包含在受试者已经接受其他疗法(例如，抗组胺疗法)后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间向所述患者施用抗FcεR1α抗体或抗CD3/抗FcεR1α双特异性抗原结合分子。

联合疗法和制剂

本发明提供了方法，所述方法包含将包含本文所述的任何示例性抗体和双特异性抗原结合分子的药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用。可以与本发明的抗原结合分子组合或联合施用的示例性另外的治疗剂包括例如IgE拮抗剂(例如，抗IgE抗体，诸如奥马珠单抗)或IgE的小分子抑制剂(例如，darpin，诸如darpin E2_76)、IL-25抑制剂、IL-4抑制剂、IL-4受体抑制剂(例如，抗IL-4R抗体，例如度匹鲁单抗)、IL-33抑制剂(例如，抗IL-33抗体)、浆细胞消融剂(例如，BCMA x CD3双特异性抗体)和TSLP抑制剂。在某些实施例中，浆细胞消融剂选自由B细胞成熟抗原(BCMA)靶向剂、蛋白酶体抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、B细胞活化因子(BAFF)抑制剂和A增殖诱导配体的抑制剂(APRIL；CD256)组成的组。在一个实施例中，BCMA靶向剂选自由抗BCMA/抗CD3双特异性抗体、抗BCMA的嵌合抗原受体和与细胞毒性药物缀合的抗BCMA抗体组成的组。

可以有利地与本发明的抗原结合分子联合施用的其他药剂包括过敏治疗药物，包括抗组胺药、抗炎剂、皮质激素、肾上腺素、支气管扩张剂、减充血剂、白三烯拮抗剂或肥大细胞抑制剂(例如，色甘酸钠)。

本发明还包括包含本文提及的任何抗原结合分子和IgE或FcεR1α的抑制剂的治疗组合物，其中所述抑制剂是适体、反义分子、核酶、siRNA、蛋白胨体、纳米体或抗体片段(例如，Fab片段；F(ab')₂片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他工程改造的分子，诸如二体、三体、四体、微体和最小识别单元)。本发明的抗原结合分子也可以与抗病毒剂、抗生素、止痛剂、皮质类固醇和/或NSAID联合施用和/或共同配制。

另外的治疗活性组分可以刚好在施用本发明的抗原结合分子之前、同时或之后不久施用；(为了本公开的目的，此类施用方案被认为是“与另外的治疗活性组分结合”的抗原结合分子的施用)。

本发明包括药物组合物，其中本发明的抗原结合分子与一种或多种如本文其他地方所述的另外的治疗活性组分共同配制。

施用方案

根据本发明的某些实施例，可以在限定的时间过程内向受试者施用多剂量的抗原结合分子(例如，抗FcεR1α抗体或特异性地结合FcεR1α和CD3的双特异性抗原结合分子)。根据本发明该方面的方法包含向需要其的受试者顺序施用多剂量的本发明的抗原结合分子。如本文所用，“顺序施用”是指在不同的时间点(例如在以预定的间隔(例如小时、天、周或月)隔开的不同日期)，将每剂量的抗原结合分子施用给受试者。本发明包括这样的方法：该方法包含顺序向患者施用单个初始剂量的抗原结合分子，随后是一个或多个第二剂量的抗原结合分子，并且任选地随后是一个或多个第三剂量的抗原结合分子。

术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指本发明的抗原结合分子施用的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也被称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；并且“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量可能都含有相同量的抗原结合分子，但通常在施用频率方面可能彼此不同。然而，在某些实施例中，在治疗过程期间，包含在初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中的抗原结合分子的量彼此不同(例如，适当地上调或下调)。在某些实施例中，在治疗方案开始时以“加载剂量”形式施用两个或更多个(例如，2、3、4或5个)剂量，随后以较不频繁的基础施用后续剂量(例如，“维持剂量”)。

在本发明的一个示例性实施例中，每个第二剂量和/或第三剂量紧接在前一剂量之后1至26周施用(例如，1、1¹/₂、2、2¹/₂、3、3¹/₂、4、4¹/₂、5、5¹/₂、6、6¹/₂、7、7¹/₂、8、8¹/₂、9、9¹/₂、10、10¹/₂、11、11¹/₂、12、12¹/₂、13、13¹/₂、14、14¹/₂、15、15¹/₂、16、16¹/₂、17、17¹/₂、18、18¹/₂、19、19¹/₂、20、20¹/₂、21、21¹/₂、22、22¹/₂、23、23¹/₂、24、24¹/₂、25、25¹/₂、26、26¹/₂或更多)。如本文所用，短语“紧接前一剂量”是指在多次施用的序列中，在没有中间剂量的情况下，在施用序列中的下一个剂量之前，向患者施用的抗原结合分子的剂量。

根据本发明该方面的方法可以包含向患者施用任何数量的第二剂量和/或第三剂量的抗原结合分子(例如，抗FcεR1α抗体或特异性地结合FcεR1α和CD3的双特异性抗原结合分子)。例如，在某些实施例中，仅向患者施用单个第二剂量。在其他实施例中，向患者施用两此或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多个)第二剂量。同样，在某些实施例中，仅向患者施用单个第三剂量。在其他实施例中，向患者施用两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多个)第三剂量。

在涉及多个第二剂量的实施例中，每个第二剂量可以以与其他第二剂量相同的频率施用。例如，可以在紧接前一剂量后1至2周向患者施用每个第二剂量。类似地，在涉及多个第三剂量的实施例中，每个第三剂量可以以与其他第三剂量相同的频率施用。例如，可以在紧接前一剂量后2至4周向患者施用每个第三剂量。可替代地，向患者施用第二剂量和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中变化。在治疗过程期间，医生也可以根据临床检查后个体患者的需要调整施用的频率。

在一个实施例中，将抗原结合分子(例如，抗FcεR1α抗体或特异性地结合FcεR1α和CD3的双特异性抗原结合分子)以基于体重的剂量施用给受试者。“基于体重的剂量”(例如，以mg/kg计的剂量)是抗体或其抗原结合片段或双特异性抗原结合分子的剂量，其将根据受试者的体重而变化。

在另一个实施例中，将抗体或其抗原结合片段或双特异性抗原结合分子以固定的剂量施用给受试者。“固定的剂量”(例如，以mg计的剂量)是指将一剂抗体或其抗原结合片段或双特异性抗原结合分子用于所有受试者，而不考虑任何特定的受试者相关因素，诸如体重。在一个特定的实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段或双特异性抗原结合分子的固定剂量基于预定的体量或年龄。

一般而言，本发明的抗原结合分子的合适剂量可以在接受者每千克体重约0.001至约200.0mg的范围内，通常在每千克体重约1至50mg的范围内。例如，抗体或其抗原结合片段或双特异性抗原结合分子可以以每单剂量约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg施用。介于所述值之间的值和范围也旨在是本发明的一部分。

在一些实施例中，本发明的抗原结合分子以约1mg至约2500mg之间的固定剂量施用。在一些实施例中，本发明的抗原结合分子以约1mg、2mg、3mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、约30mg、约50mg、约75mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、200mg、约225mg、约250mg、约275mg、约300mg、约325mg、约350mg、约375mg、约400mg、约425mg、约450mg、约475mg、约500mg、约525mg、约550mg、约575mg、约600mg、约625mg、约650mg、约675mg、约700mg、约725mg、约750mg、约775mg、约800mg、约825mg、约850mg、约875mg、约900mg、约925mg、约950mg、约975mg、约1000mg、约1500mg、约2000mg或约2500mg的固定剂量施用。介于所述值之间的值和范围也旨在是本发明的一部分。

抗体的诊断用途

本发明的抗FcεR1α抗体也可以用于检测和/或测量样品中的FcεR1α或表达FcεR1α的细胞，例如用于诊断目的。例如，抗FcεR1α抗体或其片段可以用于诊断以FcεR1α的异常表达(例如，过度表达、表达不足、缺乏表达等)为特征的病症或疾病。针对FcεR1α的示例性诊断测定可以包含，例如，将从患者获得的样品与本发明的抗FcεR1α抗体接触，其中所述抗FcεR1α抗体用可检测标记或报告分子标记。可替代地，未标记的抗FcεR1α抗体可以与本身可检测标记的二抗联合用于诊断应用。可检测的标记或报告分子可以是放射性同位素，诸如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I；荧光或化学发光部分，诸如异硫氰酸荧光素或若丹明；或酶诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。本发明的抗FcεR1α抗体的另一个示例性诊断用途包括⁸⁹Zr标记的抗体，诸如⁸⁹Zr-去铁氧胺标记的抗体，用于无创鉴定和追踪受试者中的肥大细胞、嗜碱性粒细胞或其他表达FcεR1α的细胞(例如正电子发射断层扫描(PET)成像)。(参见，例如Tavare,R.等人Cancer Res.2016Jan 1；76(1):73-82；和Azad,BB.等人Oncotarget.2016Mar 15；7(11):12344-58)。可以用于检测或测量样品中的FcεR1α的具体示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。

可以用于根据本发明的FcεR1α诊断测定的样品包括在正常或病理条件下可从患者获得的含有可检测量的FcεR1α蛋白或其片段的任何组织或流体样品。一般而言，从健康患者(例如未患有与异常FcεR1α水平或活性相关的疾病或病症的患者)获得的特定样品中的FcεR1α水平将被测量，以初步建立FcεR1α的基线或标准水平。然后，可以将FcεR1α的该基线水平与在从疑似患有FcεR1α相关疾病(例如，患有过敏的受试者)或病症的个体获得的样品中测得的FcεR1α水平进行比较。

实例

提出以下实例以便向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是他们的发明的范围。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，并且压力为大气压或接近大气压。

实例1：抗体的产生

抗FcεR1α抗体的产生

通过用人FcεR1α抗原(例如，hFcεR1α、SEQ ID NO:63)免疫遗传修饰的小鼠，或通过用人FcεR1α抗原免疫包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的工程改造的小鼠，来获得抗FcεR1α抗体。

在免疫后，从每只小鼠中收获脾细胞，并且(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其活力并形成杂交瘤细胞并筛选FcεR1α特异性，或(2)使用人FcεR1α片段作为结合和鉴定反应性抗体(抗原阳性B细胞)的分选试剂分选B细胞(如US 2007/0280945A1中所述)。

最初分离出具有人可变区和小鼠恒定区的针对FcεR1α的嵌合抗体。对抗体进行表征，并针对所需的特性(包括亲和力、选择性等)进行选择。如有必要，用所需的人恒定区替换小鼠恒定区，例如野生型或修饰的IgG1或IgG4恒定区，以产生完全人抗FcεR1α抗体。虽然所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶特异性特征存在于可变区中。

根据本实例的方法产生的示例性抗FcεR1α抗体的某些生物学特性在以下所述的实例中详细地描述。

抗CD3抗体的产生

如WO 2017/053856(其通过引用并入本文)中所述产生抗CD3抗体。选择示例性的抗CD3抗体用于生产根据本发明的双特异性抗CD3/抗FcεR1α抗体。用于制备本发明的双特异性抗体的其他抗CD3抗体可以在例如WO 2014/047231中找到。

在本文的实例中详细地描述了根据本实例的方法产生的示例性抗CD3抗体的某些生物学特性。

结合FcεR1α和CD3的双特异性抗体的产生

本发明提供了结合CD3和FcεR1α的双特异性抗原结合分子；此类双特异性抗原结合分子在本文中也被称为“抗FcεR1α/抗CD3或抗FcεR1αxCD3双特异性分子”。抗FcεR1α/抗CD3双特异性分子的抗FcεR1α部分可用于靶向表达fcεR1α的细胞，而双特异性分子的抗CD3部分可用于活化T细胞。细胞上的FcεR1α和T细胞上的CD3的同时结合有助于活化的T细胞定向杀伤(细胞裂解)表达FcεR1α的靶细胞。

使用标准方法构建包含抗FcεR1α特异性结合结构域和抗CD3特异性结合结构域的双特异性抗体，其中抗FcεR1α抗原结合结构域和抗CD3抗原结合结构域各自包含与共同LCVR配对的不同的、有区别的HCVR。在例举的双特异性抗体中，利用来自抗CD3抗体的重链、来自抗FcεR1α抗体的重链和来自抗CD3抗体的共同轻链构建分子(WO2017/053856)。在其他情况下，可以利用来自抗CD3抗体的重链、来自抗FcεR1α抗体的重链和来自抗CD3抗体的轻链或来自抗FcεR1α抗体轻链或已知与多种重链臂混杂或有效配对的任何其他轻链构建双特异性抗体。抗FcεR1α抗体和抗CD3抗体(双特异性抗体的任何组分均源自这些抗体)有时被称为亲本抗体。

在以下实例中描述的双特异性抗体包含抗CD3结合臂和抗FcεR1α结合臂。制备了具有IgG4 Fc结构域的示例性双特异性抗体(bsAb24919D、bsAb24920D和bsAb24921D)。

在表5中列出了所构建的各种抗FcεR1αxCD3双特异性抗体的抗原结合结构域的组成部分的汇总。

实例2：重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列

表1列出了所选的本发明的抗FcεR1α抗体的重链和轻链可变区(HCVR和LCVR)、CDR以及重链和轻链(HC和LC)的氨基酸序列标识符。在表2中列出了相应的核酸序列标识符。

表1：氨基酸序列标识符

表2：核酸序列标识符

表3列出了本发明的示例性抗CD3抗体的重链和轻链可变区(HCVR和LCVR)、CDR以及重链和轻链(HC和LC)的氨基酸序列标识符。在表4中列出了相应的核酸序列标识符。

表3：氨基酸序列标识符

表4：核酸序列标识符

在表5中列出了所构建的各种抗FcεR1αxCD3双特异性抗体的组成部分的汇总。表6、表7和表8列出了双特异性抗体的HCVR、LCVR、CDR以及重链和轻链序列标识符。

表5：抗FcεR1α16xCD3双特异性抗体的组成部分的汇总

表6:双特异性抗体的可变区和CDR的氨基酸序列

表7:双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列标识符

表8:双特异性抗体的重链和轻链核酸序列标识符

实例3:人单克隆抗FcεR1α单特异性和抗FcεR1α16xCD3双特异性抗体的表面等离子体共振衍生的结合亲和力和动力学常数

使用实时表面等离子体共振生物传感器(SPR-Biacore),Biacore 8k测定人或食蟹猴FcεR1α外域与纯化的抗FcεR1α单克隆抗体(mAb)和CD3 x FcεR1α双特异性抗体(bsAb)结合的平衡解离常数(K_D)。所有结合研究均在25℃和37℃下在10mM的HEPES、150mM的NaCl、3mM的EDTA和0.05％v/v表面活性剂Tween-20，pH 7.4(HBS-ET)的运行缓冲液中进行。

Biacore CM4传感器表面首先通过与单克隆小鼠抗人Fc抗体的胺偶联进行衍生化，以捕获约500-900RU的抗FcεR1α单克隆抗体或抗CD3 x FcεR1α双特异性单克隆抗体。1RU(应答单位)代表1pg蛋白质/mm²，如由制造商所定义的。人和食蟹猴FcεR1α试剂的外域用C-术语myc-myc-6xHis tag–hFcεR1α.MMH(SEQ ID NO:57)和mfFcεR1α.MMH(SEQ ID NO:58)表示。在HBS-ET运行缓冲液(600nm-7.4nm；连续稀释3倍)中制备了不同浓度的FcεR1α试剂，并以30μL/分钟的流速注射到抗人Fc捕获的抗FcεR1α单克隆抗体或抗CD3 x FcεR1α双特异性单克隆抗体表面1分钟。在HBS-ET运行缓冲液中监测结合的FcεR1α试剂的解离4分钟。通过使用Biacore 8k评估软件将实时结合传感图拟合至具有质量转运限制的1:1结合模型，来测定缔合(K_a)和解离(K_d)速率常数。结合解离平衡常数(K_D)和解离半衰期(t1/2)由以下动力学速率常数计算：

和

在表9至表12中示出了在25℃和37℃下hFcεR1α.MMH和mfFcεR1α.MMH与本发明的不同示例性抗FcεR1α单克隆抗体或抗CD3 x FcεR1α双特异性单克隆抗体结合的结合动力学参数。

表9：在25℃下hFcεR1α.MMH与抗FcεR1α单克隆抗体或抗CD3 x FcεR1α双特异性单克隆抗体结合的结合动力学参数。

NB*表示在当前实验条件下未观察到结合。

表10：在37℃下hFcεR1α.MMH与抗FcεR1α单克隆抗体或抗CD3 x FcεR1α双特异性单克隆抗体结合的结合动力学参数。

NB*表示在当前实验条件下未观察到结合。

表11：在25℃下mfFcεR1α.MMH与抗FcεR1α单克隆抗体或抗CD3 x FcεR1α双特异性单克隆抗体结合的结合动力学参数。

NB*表示在当前实验条件下未观察到结合。

表12：在37℃下mfFcεR1α.MMH与抗FcεR1α单克隆抗体或抗CD3 x FcεR1α双特异性单克隆抗体结合的结合动力学参数。

NB*表示在当前实验条件下未观察到结合。

在25℃下，本发明的示例性抗FcεR1α单克隆抗体或抗CD3 x FcεR1α双特异性单克隆抗体以127nM至303nM范围内的K_D值与hFcεR1α.MMH结合，如表9所示。在37℃下，本发明的示例性抗FcεR1α单克隆抗体或抗CD3 x FcεR1α双特异性单克隆抗体以444nM至1.55uM范围内的K_D值与hFcεR1α.MMH结合，如表10所示。

在25℃下，本发明的示例性抗FcεR1α单克隆抗体或抗CD3 x FcεR1α双特异性单克隆抗体以195nM至467nM范围内的K_D值与mfFcεR1α.MMH结合，如表11所示。在37℃下，本发明的示例性抗FcεR1α单克隆抗体或抗CD3 x FcεR1α双特异性单克隆抗体以330nM至3.35uM范围内的K_D值与mfFcεR1α.MMH结合，如表12所示。

实例4：抗FcεR1αx CD3双特异性抗体与Jurkat和HEK293细胞上表达的FcεR1α特异性结合

为了评估抗FcεR1α单克隆抗体和抗FcεR1αx CD3双特异性抗体与细胞上表达的抗原的结合，使用Jurkat/NFAT-Luc和HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞进行了流式细胞术实验。Jurkat/NFAT-Luc细胞是被工程改造以在活化T细胞(NFAT)应答元件的核因子的转录控制下稳定地表达荧光素酶报告子的Jurkat细胞。HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞是被工程改造以稳定地表达人FcεR1α、FcεR1β和FcεR1γ的HEK293细胞。为了测试与猴(食蟹猴，mf)FcεR1α(在81位处带有丙氨酸的登录号#XP_005541370.1的氨基酸4-260被改变为色氨酸)的结合，mfFcεR1α与人FcεR1β和FcεR1γ一起在HEK293中稳定表达。分离所得到的细胞系(以下被称为HEK293/mf FcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ)，并维持在补充有10％FBS、1X NEAA、1X青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺、1μg/mL的嘌呤霉素、100μg/mL的潮霉素B和500μg/mL的G418硫酸盐的DMEM培养基中。试剂信息如下：DMEM培养基，Irvine Scientific,Cat#CRL-1573；胎牛血清(FBS)，Seradigm,Cat#1500-500；100X青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(Pen/Strep/Glut)，Invitrogen,Cat#10378-016；100X非必需氨基酸(NEAA)，IrvineScientific,Cat#9034；Geneticin^TM选择性抗生素(G418硫酸盐)，Invitrogen,Cat#11811-098；潮霉素B，Calbiochem,Cat#400049；嘌呤霉素，Sigma,Cat#P-8833。

对于流式细胞术分析，在使用无酶解离缓冲液(Millipore Cat#S-004)解离后，收集HEK293,HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ和HEK293/mf FcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞，并将细胞与或不与70nM人IgE在冰上在FACS缓冲液(PBS，不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺，(IrvineScientific,Cat#9240)含2％FBS)中预培养30分钟。还收集了Jurkat/NFAT-luc细胞。然后在4℃下在30分钟内将浓度为70nM的抗体加入到每种细胞类型的1x 10⁶个细胞/孔中。在与一级抗体孵育后，细胞在冰上用1.3μg/ml的别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗人IgG二级抗体(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-136-170)染色30分钟。使用BD CytoFix^TM(BectonDickinson,Cat.#554655)固定细胞，并在Accuri^TMC6(BD)或CytoFLEX流式细胞仪(BeckmanCoulter)上进行分析。还对所有细胞系测试了未染色的和单独的二抗对照，并且根据制造商的方案，使用Far Red Fluo活力染料(Thermo Fisher,Cat#L10120)评估了样品的活力。使用FlowJo软件(版本10.0.8，FlowJo)分析结果，以确定活细胞的荧光几何平均值，并使用通过未染色的相应细胞的MFI归一化的实验条件的平均荧光强度(MFI)来计算结合比率。在表13和14中汇总了结果。

表13：70nM的抗FcεR1α抗体和抗FcεR1αx CD3抗体与HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ和Jurkat/NFAT-luc细胞的结合

表14：70nM的抗FcεR1α抗体和抗FcεR1αx CD3ε抗体与HEK293/mf FcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞的结合

如表13所示，示例性的抗FcεR1αx CD3双特异性抗体bsAb24919D、bsAb24920D和bsAb24921D显示出与在不含和含70nM的人IgE的HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞中表达的人FcεR1α以201–295的结合比率结合和与Jurkat细胞中表达的人CD3以48–94的结合比率结合。本发明的示例性双特异性抗体显示出与不含FcεR1受体的HEK293以2-11的结合比率的最小结合。抗FcεR1α抗体显示出与不含和含70nM的人IgE的HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞以136–396的结合比率结合，和与HEK293或Jurkat细胞以1–8的结合比率结合。同种型对照抗体未显示出与任何细胞结合，并且仅次要对照显示出1的结合比率。

如表14所示，示例性的抗FcεR1αx CD3ε双特异性抗体bsAb24919D、bsAb24920D和bsAb24921D显示出与在不含和含有70nM的人IgE的HEK293/mfFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞中表达的猴(食蟹猴)FcεR1α以142–284结合。本发明的示例性双特异性抗体显示出与不含FcεR1受体的HEK293细胞以1-2的结合比率的最小结合。本发明的示例性抗FcεR1α抗体显示出与不含和含有70nM的人IgE的HEK293/mfFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞以101–279的结合比率结合，但不与HEK293结合。同种型对照抗体未显示出与任何细胞结合并且仅次要对照显示出1的结合比率。

实例5：通过抗FcεR1αx CD3双特异性抗体激活人CD3信号传导

为了评估在存在表达FcεR1α的细胞的情况下，抗FcεR1αx CD3ε双特异性抗体对人CD3信号传导的激活，使用Jurkat/NFAT-luc和HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞进行了生物测定。开发了稳定的细胞系。Jurkat细胞系(一种人T淋巴细胞系)已经被用于证明CD3介导的T细胞受体信号传导(Abraham和Weiss,Jurkat T cells and development ofthe T-cell receptor signaling paradigm.Nat Rev Immunol.2004Apr；4(4):301-8)。对Jurkat细胞进行工程改造，以在活化T细胞(NFAT)应答元件的核因子的转录控制下稳定地表达荧光素酶报告基因。分离所得到的细胞系(以下被称为Jurkat/NFAT-Luc)并维持在补充有10％的FBS、1X青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺和1μg/mL嘌呤霉素的RPMI1640培养基(Irvine Scientific,Cat.#9160)中。此外，转染HEK293细胞以稳定地表达人FcεR1α(Uniprot#P12319-1的氨基酸1-257)、FcεR1β(Uniprot#Q01362-1的氨基酸1-244)和FcεR1γ(Uniprot#P30273-1的氨基酸1-86)。分离所得到的细胞系(以下被称为HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ)并维持在补充有10％FBS、1X NEAA、1X青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺、1μg/mL的嘌呤霉素、100μg/mL的潮霉素B和500μg/ml的G418硫酸盐的DMEM培养基(IrvineScience,Cat.#9033)中。

进行生物测定以通过本发明的示例性抗FcεR1αx CD3ε双特异性抗体测量CD3信号传导。对于生物测定，在37℃下在5％CO₂中，将HEK293或HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞在96孔平板中以每孔10,000个细胞铺板于在测定缓冲液中含有或不含10nM的人IgE的测定缓冲液(RPMI1640(Irvine Scientific，Cat#9160)中的10％FBS，含pen/strep/glut)中，持续30分钟。在孵育后，将Jurkat/NFAT-luc细胞连同本发明的连续稀释的示例性抗FcεR1αx CD3双特异性抗体、本发明的示例性抗FcεR1α或浓度范围为100nM至2pM的同种型对照抗体加上单独含有缓冲液的样品(没有抗体)一起以50,000铺板。在37℃下在5％CO₂中5.5小时后，使用OneGlo^TM试剂(Promega,#E6031)和Victor^TM X多标记板读取器(PerkinElmer)测定荧光素酶活性。使用Prism^TM 6软件(GraphPad)使用非线性回归(4参数物流)来分析结果，以获得EC₅₀值。用在没有抗体时的平均RLU归一化的最高抗体浓度下的平均RLU(相对光单位)来计算倍数激活。结果汇总在表15中。

表15：通过抗FcεR1αx CD3抗体激活人CD3

如表15所示，本发明的示例性抗FcεR1αx CD3双特异性抗体bsAb24919D、bsAb24920D和bsAb24921D，在不含人IgE的HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞和含10nM的人IgE的1.1nM至4.9nM存在下，在EC₅₀值为230pM至680pM的Jurkat/NFAT-luc细胞中显示出CD3信号传导的激活。在不含IgE和含10nM的IgE的情况下通过bsAb24919D以32的倍数激活实现了最高的激活。本发明的示例性双特异性抗体在不含FcεR1α受体的HEK293存在下显示出最小程度的激活，其倍数激活范围为1-3。在所测试的任何条件下，抗FcεR1α和同种型对照抗体均未显示出1的倍数激活。

实例6：抗FcεR1αx抗CD3双特异性抗体在体外杀伤测定中的作用

为了确定本发明的示例性抗FcεR1αx抗CD3双特异性抗体(bsAb24919D、bsAb24920D和bsAb24921D)在体外诱导T细胞介导的对表达FcεR1α的细胞的杀伤的功效，使用了两个单独的实验。在一个实验中，工程改造的HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ细胞被用作靶，而在第二个实验中，总外周血单核细胞(PBMC)群体中的原代人嗜碱性粒细胞被用作靶。在这两种情况下，在进行杀伤测定前使用类似的方案来激活T细胞：首先使用RossetteSep^TM人CD8+ T细胞富集鸡尾酒试剂盒(STEMCELL Technologies,Cat.#15063)从人白细胞包(NY Blood Center)中分离CD8+ T细胞，并置于具有CD3/CD28包被的(Invitrogen,Cat.#11132D)的培养物中，以诱导T细胞的活化。在培养第2-3天，使用磁分离法去除珠，并将T细胞置于培养物中。在一个实例中(与HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ靶细胞一起使用)，将T细胞维持在培养物中5天，此时以300U/ml添加IL-2以促进生存力和生长，并且在添加IL-2后2天使用T细胞。在第二实例中(与PBMC靶细胞一起使用)，在除去珠后将细胞在培养物中维持一天，并且然后用于杀伤测定。在这两种情况下，活化的T细胞都用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE,Thermo Fischer Scientific,Cat.#C34554)标记，然后进行杀伤测定，以使得在分析结果期间能够排除细胞。

为了确定本发明的示例性抗FcεR1αx抗CD3双特异性抗体在诱导T细胞介导的杀伤HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ靶细胞中的功效，使用了使用凋亡级联的两种介质的检测作为读出(裂解的胱天蛋白酶3和裂解的PARP)的杀伤测定法。为了建立杀伤测定，将活化的T细胞与靶细胞以每T细胞10个靶细胞的比率混合，并且然后置于96孔板中。向孔中加入最终浓度范围为100nM至10.24fM的系列五倍抗体稀释液，并将细胞在37℃下孵育过夜，以允许T细胞介导的杀伤发生。抗体包括本发明的示例性抗FcεR1α/CD3双特异性抗体和同种型对照抗体。在孵育后，收获细胞并在37℃下重新悬浮在预热的BD cytofix(Cat.#554655)中，持续10分钟。然后在MACS缓冲液(Miltenyi,Cat.#130-091-221)中洗涤细胞两次，并通过重新悬浮在冰冷的甲醇中并在-20℃下孵育至少30分钟或过夜使其可透过。在透化后，向细胞中加入MACS缓冲液，持续10分钟，以允许细胞再水合，然后用MACS缓冲液洗涤2次。然后将细胞与Fc阻断抗体(Ebioscience,Cat.#14-9161-73)一起孵育，然后用含有Alexa-647缀合的抗裂解胱天蛋白酶3(Cell Signaling Technology,Cat.#9602S)和PE缀合的抗裂解PARP抗体(BD Biosciences,Cat.#552933)的抗体混合物染色。胱天蛋白酶3和PARP的裂解是凋亡级联反应激活中的强制性步骤，凋亡级联反应是在将细胞毒性裂解颗粒从CD8+ T细胞递送至靶细胞后启动的。因此，对这些裂解蛋白的特异性检测用作杀伤的读数。在染色后，洗涤细胞，重新悬浮在MACS缓冲液中，并使用LSRFortessa仪器(BDBiosciences)采集。死亡细胞被鉴定为CFSE-，并且该群体中的凋亡细胞被鉴定为裂解的胱天蛋白酶3+和裂解的PARP+。使用Graphpad Prism软件进行数据分析。使用方程X＝Log(X)对所获得的数据点进行变换，并且对变换后的数据进行线性回归分析，并拟合成s形剂量应答曲线。EC₈₀(最大有效浓度的百分之八十(80％)，其包括在规定的暴露时间后在基线和最大值之间引起百分之八十(80％)应答的抗体浓度)和顶级应答均由此分析得出。

为了确定本发明的示例性抗FcεR1αx抗CD3双特异性抗体在诱导外周血单核细胞(PBMC)群体内的原代嗜碱性粒细胞的T细胞介导的杀伤中的功效，使用了基于这些细胞相对于其余PBMC群体的定量的测定法。新鲜PBMC通过Ficoll(GE Healthcare,Cat.#17-1440-03)纯化从供体血液中获得，并且与活化的T细胞和抗体稀释液以与上述工程改造的HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ靶细胞类似的形式混合。在孵育过夜后，收获细胞，用活/死细胞标记物(Invitrogen Cat.#L34962)孵育，然后用Fc阻断抗体孵育，并用含有APC缀合的抗HLA-DR(BD Biosciences,Cat.#559866)和BUV 395-缀合的抗CD123(BDBiosciences,Cat.#564195)抗体的抗体混合物染色。然后用MACS缓冲液洗涤细胞两次，并固定在含有在PBS中以1:4稀释的BD Cytofix的溶液中15分钟。将细胞重新悬浮在MACS缓冲液中，并在LSRFortessa仪器中采集。与先前已经用CFSE标记的外源性活化T细胞一样，使用活/死细胞标记物将死细胞排除在分析之外。剩余活PBMC群体中的嗜碱性粒细胞被鉴定为CD123+HLA-DR-。

使用Graphpad Prism软件进行数据分析。使用方程X＝Log(X)对获得的数据点进行变换，并且对变换后的数据进行线性回归分析，并拟合成s形剂量应答曲线。EC₅₀来自该分析。使用以下公式计算嗜碱性粒细胞减少的最大百分比：

100–(100x具有最高抗体剂量的样品中嗜碱性粒细胞百分比)/(所有同种型对照样品中嗜碱性粒细胞的平均百分比)。

表16总结了在存在本发明的每种示例性双特异性抗体(bsAb24919D、bsAb24920D和bsAb24921D)的情况下，裂解的胱天蛋白酶3和裂解的PARP双阳性HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ靶细胞的剂量依赖性增加，其中EC₈₀分别为3.456x10^-11M、1.264x10^-10M和6.128x10^-11M。因为该测定是基于捕获凋亡的早期阶段，所以在细胞被完全杀伤之前停止测定，并且对于与bsAb24919D、bsAb24920D和bsAb24921D一起孵育的细胞，对凋亡标记物呈染色阳性的最大细胞百分比分别为56.04、56.48和55.83。值得注意的是，与单独孵育的靶细胞相比，当T细胞与靶细胞在没有抗体的情况下一起孵育时，没有观察到对两种凋亡标记物呈阳性的靶细胞百分比增加。换句话说，当T细胞与靶细胞在仅存在同种型对照抗体的情况下一起孵育时，未观察到凋亡的诱导。

表16：在与T细胞和FcεR1αx CD3双特异性抗体一起孵育后，来自HEK293/hFcεR1α/hFcεR1β/hFcεR1γ靶细胞的剂量应答杀伤曲线的凋亡细胞的EC80和最大百分比

表17总结了在存在本发明的示例性双特异性抗体(bsAb24919D、bsAb24920D和bsAb24921D)的情况下，总PBMC靶群体中嗜碱性粒细胞的剂量依赖性减少，其中EC₅₀分别为3.748x 10^-9M、2.003x 10^-8M和4.003x 10^-9M。在使用最高剂量的bsAb24919D、bsAb24920D和bsAb24921D的情况下，相对于所有同种型处理样品中PBMC内嗜碱性粒细胞的平均百分比，嗜碱性粒细胞分别减少90.57％、80.1％和90.92％。

表17：在与T细胞和FcεR1αx CD3双特异性抗体一起孵育后，来自PBMC靶细胞内嗜碱性粒细胞的剂量应答杀伤曲线的EC50和最大嗜碱性粒细胞百分比降低

实例7：抗FcεR1αx CD3双特异性抗体的体内效力

研究了抗FcεR1αx抗CD3双特异性抗体在被动皮肤过敏反应(PCA)体内模型和脾嗜碱性粒细胞耗竭中的作用。

为了确定本发明的抗FcεR1αx CD3双特异性抗体用于阻断过敏原诱导的肥大细胞脱颗粒的功效，使用被动皮肤过敏反应(PCA)体内模型。PCA模型评估1型超敏反应并测量耳组织中局部肥大细胞活化诱导的血管通透性(Gilfillan,A.M.&Tkaczyk,C.Integratedsignaling pathways for mast-cell activation.Nat.Rev.Immunol.6,218–230(2006))。该模型包括将来自过敏性患者的过敏原特异性血清皮内注射到表达人高亲和力IgE受体FcεR1α的小鼠皮肤上的局部区域，随后与染料一起静脉注射过敏原。过敏反应导致致敏部位处毛细血管扩张和增加的血管通透性，从而导致染料在该部位优先聚集。可以从组织中提取染料，并用分光光度法进行定量。

对于PCA测定，首先用同种型对照抗体或本发明的三种示例性FcεR1αx CD3双特异性抗体之一以25mg/kg的剂量皮下注射针对FcεR1α和CD3人源化的小鼠组(每个实验n≥5)。抗体施用5天后，向小鼠耳中注射来自猫过敏个体的血清(IgE滴度585，在PBS中以1:5稀释)。第二天，向小鼠静脉施用(每只小鼠100μL)溶解在1X PBS(含0.5％(w/v)Evan蓝色染料(Sigma Aldrich，#E2129))中的1μg/mL Fel D1(Indoor biotech LTN-FD1-1)溶液。抗原施用后1小时，处死小鼠，并且切除并收集耳和脾。

将耳朵置于1mL的甲酰胺中，并且随后在50℃下孵育3天，以提取Evan蓝色染料。然后从甲酰胺中取出耳组织，吸干以去除多余的液体并称重。将200微升等分的每种甲酰胺提取物以一式两份转移到96孔板中。在620nm下测量所得上清液的吸光度。使用标准曲线将测得的光密度转换为Evan蓝色染料浓度，并且表示为每mg耳组织中Evan蓝色染料的纳克数。表18示出了各组的平均值±标准偏差。

为了评估嗜碱性粒细胞频率，使用了基于流式细胞术的测定。从红细胞裂解后采集的脾脏制备单细胞悬浮液(Sigma,Cat#R7757)。然后用活/死细胞标记物对细胞进行染色，然后用含有BUV 395缀合的抗B220(BD，Cat#563793)、FITC缀合的抗CD4(BD，Cat#553031)、FITC缀合的抗CD8(BD，Cat#557667)和PECy7缀合的CD49b(EBIOSCIENCE，Cat#25-5971-82)的抗体混合物进行抗体染色。在染色后，用MACS缓冲液(Miltenyi Biotech Cat#130-091-221)洗涤细胞两次，用在PBS中以1:4稀释的BD Cytofix(Cat#554655)固定15分钟，然后重新悬浮在MACS缓冲液中并在4度下储存。在采集当天，细胞在BD Perm/洗涤缓冲液(Cat#554723)中洗涤两次，并用eFluor450缀合的抗FcεR1α(EBIOSCIENCE，Cat#48-5899-42)对细胞内FcεR1α染色。然后在LSRFortessa仪器中采集细胞，并使用FlowJo软件进行分析。嗜碱性粒细胞被鉴定为B220-CD4-CD8-CD49+FcεR1α+。使用以下公式计算单个抗体施用小鼠中嗜碱性粒细胞减少百分比：100–(脾嗜碱性粒细胞百分比/同种型组中脾嗜碱性粒细胞的平均百分比)，其中脾嗜碱性粒细胞百分比是相对于脾中的总活细胞计算的。结果在表19中示出。

在未施用抗体的小鼠或施用同种型对照抗体的小鼠耳中观察到Evan蓝色染料外渗，其中平均染料定量分别为84.06和82.05ng/mg(ng/mg指每mg组织中的Evan蓝色染料纳克数)。表18证明了本发明的示例性抗FcεR1αx CD3双特异性抗体(bsAb24919D和bsAb24921D)在PCA模型中的功效，如通过在用这些抗体处理的组中与同种型对照相比时染料外渗的显著减少所指示的。与同种型对照组相比，在用bsAb24920D治疗的组中观察到了减少染料外渗的非统计学显著趋势。如所示，与同种型对照相比，bsAb24919D和bsAb24921D在被动皮肤体内模型中阻断了针对致敏和随后的Fel D1攻击的肥大细胞脱颗粒，表明染料外渗的显著减少，分别为74.64ng/mg和75.26ng/mg，而在bsAb24920D的情况下观察到48.56ng/mg的更适中的减少。统计显著性被确定如下：首先用Shapiro-Wilk正态性检验对所有组的正态性进行检验。由于所有组中的数据均呈正态分布，因此采用了单向ANOVA分析，并通过Brown-Forsythe检验来确定各组之间的标准偏差的差异。观察到显著不同的标准偏差；因此，运行非参数Kruskal-Wallis检验代替Dunn的多重比较检验，以确定各组之间的统计学显著性。

发现来自未施用抗体的小鼠的脾相对于总活细胞平均含有0.91％的嗜碱性粒细胞，而来自施用同种型对照抗体的小鼠的脾平均含有0.71％的嗜碱性粒细胞。表19证明了本发明的示例性FcεR1αx CD3双特异性抗体(bsAb24919D、bsAb24920D和bsAb24921D)在来自上述PCA实验的相同小鼠中消耗脾嗜碱性粒细胞的功效。如所示，用三种抗体中的任何一种治疗的小鼠显示出脾嗜碱性粒细胞的减少。虽然与未施用抗体的小鼠相比，所有三种抗体的这种减少是显著的，但当与施用同种型对照抗体的组相比时，仅用bsAb24919D处理的小鼠的这种减少具有统计学意义。用bsAb24919D、bsAb24920D和bsAb24921D处理的小鼠显示出嗜碱性粒细胞相对于同种型组分别减少96％、93％和92％。统计学显著性被确定如下：首先运行Shapiro-Wilk正态性检验，并且我们发现所有数据组均呈正态分布；因此，采用了单向ANOVA分析，并使用Brown-Forsythe检验来检验各组之间的标准偏差的差异。在本测试中观察到显著不同的标准偏差，因此运行非参数Kruskal-Wallis检验代替Dunn的多重比较检验，以确定各组之间的统计显著性。

表18：被动皮肤过敏反应(PCA)体内模型中抗FcεR1αx CD3双特异性抗体的作用

25mg/kg总抗体浓度，用于所有施用抗体的组

*P≤.05,***P≤.001,***P≤.0001

n＝每组小鼠的数量

表19：抗FcεR1αx CD3双特异性抗体在脾嗜碱性粒细胞减少中的作用

25mg/kg总抗体浓度，用于所有施用抗体的组

*P≤.05,***P≤.001,***P≤.0001

n＝每组小鼠的数量

对于PCA和嗜碱性粒细胞耗竭测定，使用较低剂量的本发明的示例性抗FcεR1αxCD3双特异性抗体实现了对表达FcεR1α的细胞的消融。在以1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的较低剂量重复的实验中，bsAb24919D和bsAb24921D显示出对PCA应答的统计学上显著的抑制作用和显著的嗜碱性粒细胞损失(数据未显示)。在PCA和嗜碱性粒细胞耗竭测定中，bsAb24919D和bsAb24921D在5mg/kg至25mg/kg的剂量下疗效是相似的(数据未示出)。

本发明的范围不受本文描述的特定实施例的限制。实际上，除了本文描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说从前面的描述中将变得显而易见。这种修改旨在落入所附权利要求的范围内。