用于稳定活性生物材料的组合复合材料、其生产方法及用途
阅读说明：本技术 用于稳定活性生物材料的组合复合材料、其生产方法及用途 (Composite material for stabilizing active biological material, method for producing same and use thereof ) 是由 路易斯·古斯塔沃·戈迪尼奥·巴雷里亚 于 2018-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及合成溶胶-凝胶以固定活性或可活化生物材料的技术的用途。更具体地,本发明涉及一种用于将活性或可活化生物材料固定在溶胶-凝胶组合复合材料中的新方法,其中在保持固有生物活性的同时,减少了所述生物材料从所获得的组合复合材料中浸出而造成的损失。本发明还涉及通过该新方法获得的复合材料及其用途,即在生物催化和诊断方法中的用途。(The present invention relates to the use of the technique of synthesizing sol-gels to immobilize active or activatable biological materials. More specifically, the present invention relates to a new method for immobilizing active or activatable biomaterials in a sol-gel composite material, wherein the loss of said biomaterials by leaching out of the obtained composite material is reduced while maintaining the intrinsic biological activity. The invention also relates to the composite material obtained by the novel process and to the use thereof, namely in biocatalytic and diagnostic methods.)
技术领域
本发明涉及利用溶胶-凝胶合成来固定活性或可活化生物材料。更具体地，本发明涉及设想将活性或可活化生物材料固定在组合复合材料溶胶-凝胶中的新方法，其中在保持这些材料的生物活性的同时，减少了所述生物材料从组合复合材料中浸出而造成的损失。
背景技术
溶胶-凝胶基质是高度多孔的材料，主要衍生自二氧化硅，二氧化硅的合成条件被认为对大多数生物分子的封装是有益的。
在典型的溶胶-凝胶合成方案中，前体为Si(OR)4型的烷氧化物或XSi(OR)3或XX′Si(OR)2型的烷氧基硅烷，其中X和X′是指有机基团通过一个顶端中的Si-C桥直接与硅原子连接，并在另一个顶端呈现若干其他官能团。图1示出了一种烷氧化物，其中R基团为甲基基团：原硅酸四甲酯(TMOS)。
溶胶-凝胶合成的第一个反应是前体[1]的水解，其中一个OR配体被OH基取代：
(例如)
水解后进行缩合：
(例如)
那些水解和缩合反应是缓慢的反应，但是可通过捐献能够攻击烷氧基(alcoxyde)的氧的正电荷的酸(例如HCl)使水解速率增加。因此获得了具有类似于聚合物凝胶的质地的二氧化硅凝胶。另一方面，质子受体介质，例如碱性溶液，加速缩合速率，从而导致更致密的胶体颗粒的形成。控制这些动力学的能力对于适应封装条件以更好地响应生物分子很重要。
一些添加剂还表现出对封装在溶胶-凝胶中的生物分子稳定性的有益影响：聚乙烯醇或甘油可提高封装的糖酵解酶的活性[2][3]。除添加剂外，用于水解前体的水量也会影响固定化生物分子的活性，因此有效水必须确保生物分子在成熟基质中的流动性：添加少量水后，封装的β-半乳糖苷酶在最近得凝胶化复合材料中比在成熟的复合材料中活性更高[4]。
与封装技术相关的一个缺点是视为活性复合材料的溶胶-凝胶基质的活性逐渐下降：封装分子的浸出导致基质复合材料的活性下降，并因此限制了其长期使用的效率。
已经提出了若干种策略来规避这一障碍，以控制溶胶-凝胶封装分子的浸出。一些作者旨在通过调节溶胶-凝胶组成和胶凝化/成熟条件来减小孔径以减少浸出，如T.M.Butler et al.[5]、Lobnik,I.Oehme et al.[6]和G.E.Badini et al.[7]所提及的。然而，分析物在基质内扩散的减少导致了更长的响应反应时间。
还提出了在溶胶-凝胶合成中将生物分子与缩聚网共价连接，从而以某种方式减少了浸出[8][9][10]。一种替代策略是通过连接到惰性大分子转运蛋白[11][12][13]或封装在超分子构建体内[14]，来增加固定化生物分子的大小。然而，生物分子的活性需要一定的流动性，而那些方法降低了预期的活性。
因此，本发明关注的问题是溶胶-凝胶基质中活性或可活化生物材料的稳定性，降低其由浸出导致的损失，同时保持了其活性。该问题通过一种固定活性或可活化生物材料的新方法得以解决，其中获得了组合复合材料：一种溶胶-凝胶固定化组合复合材料，而不是先前生产的溶胶-凝胶，其中活性或可活化生物材料以良好的物理化学稳定性和反应活性被封装。
发明内容
本文无差别地使用的术语“固定”、“封装”、“禁锢”和相应的推论具有在溶胶-凝胶复合材料基质内稳定生物材料的意义。
通过活性或可活化生物材料在溶胶-凝胶内的双重固定，期望减少由浸出造成的损失。然而，还应期望较少可到达固定化生物材料的活性位点，接触固定化生物材料的活性位点导致其活性降低。
制造这种组合复合材料存在一些实际困难。通过将另一种溶胶-凝胶(一种简单的复合材料)二次固定在溶胶-凝胶中，这产生了各种各样的不成功的结果，因为胶凝作用完全失败，直至最终材料的物理化学性质不合适。
毫不妥协地从理论上讲，那些不成功之处是由于简单复合材料的高度吸湿性，在反应条件下，该特性已引起由于水饱和而发生的水位错，导致原硅酸盐前体水解所需的水不足。
作为深入研究的结果，本发明人证实了本文所述的方法产生了一种组合复合材料，一种溶胶-凝胶固定了另一种溶胶-凝胶，该另一种溶胶-凝胶是先前得到的，其封装了具有良好的物理化学稳定性的活性或可活化生物材料，并且最终配制为减少了生物材料因浸出造成的损失，并保留了各自的活性。
本发明人令人惊讶地证实了，通过本发明的方法获得的活性或可活化生物材料的在组合溶胶-凝胶复合材料中的双重固定不仅显著减少了由提及的材料的浸出而造成的损失，而且还以以下方式保留了其活性：使得固定化生物材料至少能够响应20个循环。
因此，根据本发明，提供一种生产用于稳定活性或可活化生物材料的组合复合材料的新方法，该方法包括以下步骤：
a)提供简单复合材料，该简单复合材料为溶胶-凝胶形式，该溶胶-凝胶固定一种或多种不同性质的活性或可活化生物材料，该简单复合材料是细磨的并且有效水等级低；
b)提供第二溶胶-凝胶，该第二溶胶-凝胶固定a)的简单复合材料，包括：
i)相对于最终反应混合物的体积，以0.83％至3.34％的浓度，制备a)的简单复合材料在100mM、pH＝6.8±0.2的磷酸盐缓冲溶液中的悬浮液；
ii)添加占该混合物最终体积的28％的浓度为4.50mM至8.34mM的HCl溶液，通过酸催化使原硅酸四甲酯水解；
iii)在25℃至30℃的温度，将ii)的混合物添加到等体积的i)的悬浮液中，使聚合发生，直到获得的组合复合材料具有能够被碎裂的稠度为止；
iv)将在iii)中得到的组合复合材料碎裂成粒度大约等于和小于2mm3和大约2mm3至4mm3；
v)可选地，将iv)的碎裂的组合复合材料以三体积的温育溶液与一体积的复合材料的比例，在2.0％m/v的溶解在10mM pH＝7.3的磷酸盐缓冲液中的牛血清白蛋白(BSA)溶液中孵育24小时；
vi)通过在玻璃表面上干燥直至质量降低约70％并且有效水等级约20ppm，使组合复合材料成熟；
因此获得了将活性或可活化生物材料双重固定在溶胶-凝胶基质中的组合复合材料，其中减少了由所述材料浸出而造成的损失，还保持了其活性或活化能力。
在本发明方法的一个优选实施方式中，所获得的将活性或可活化生物材料双重固定在溶胶-凝胶中的组合复合材料，具有减少的所述材料的损失并在至少20个使用循环内保持了其活性。
可以固定在本发明的组合复合材料中的活性或可活化生物材料不受限制，允许是简单复合材料中任何可固定分子中的一种或多种，优选为特异性连接中的一个成员，例如酶-底物、抗体-抗原或任何其他成对的特异性连接，优选为一种生物活性蛋白，更优选为一种酶或辅酶，或一种特异性连接的免疫活性蛋白，更优选为一种抗体、一种抗原或一种半抗原蛋白。
将被固定在组合复合材料中的简单复合材料是通过现有技术中已知的任何方法来提供的，其优选通过原硅酸四甲酯的酸水解来产生亲水性复合材料。
在本发明的一个优选实施方式中，将被固定在组合复合材料中的简单复合材料，并且其进而具有固定化的活性或可活化生物材料，有效水的等级低，为10ppm至15ppm，并且被研磨成粒度为100μm3至110μm3。
通过使用浓度为4.50mM至8.34mM的HCl作为催化剂的原硅酸四甲酯的酸水解，实现了固定先前制备的简单复合材料的组合复合材料的形成。该浓度由固定在简单复合材料中的蛋白质的功能区中的水置换量决定。
当固定在组合复合材料中的生物材料是一种或多种免疫活性蛋白，例如抗原、抗体、半抗原蛋白时，本发明的方法包括额外的步骤v)：将碎裂的组合复合材料以三体积的温育溶液与一体积的组合复合材料的比例，在2.0％m/v的溶解在10mM pH＝7.3的磷酸盐缓冲液中的牛血清白蛋白中孵育24小时。该额外的步骤显著提高了成熟的组合复合材料的蛋白质含量，直至相对于简单复合材料的蛋白质含量为3.0至3.5。
本发明还涉及通过本发明的方法获得的将活性或可活化生物材料双重固定在溶胶-凝胶中的组合复合材料。该组合复合材料在本文中也称为具有固定在其中的生物材料的“掺杂”复合材料。
通过本发明的方法获得的将活性或可活化生物材料双重固定在溶胶-凝胶中的组合复合材料，呈现出所述活性或可活化固定化生物材料的坚固性和改善的保留能力。同时，所述组合复合材料呈现出内部结构或孔隙率，该内部结构或孔隙率允许渗透直至那些固定化生物材料、分析物(对活性或可活化生物材料具有特异性的配体、底物或活化分子)的活性部位存在于与所述组合复合材料接触的水性样品中。换句话说，本发明的复合材料不仅呈现出改善的生物材料的物理保留，而且保持了那些保留的生物材料的活性或活化能力。本发明的组合复合材料的坚固性及其保持固定化生物材料的活性的能力，使得本发明的复合材料能够一直使用几个连续的使用循环。
在一个优选的实施方式中，根据本发明的一种组合复合材料可使用至少20个使用循环。
应该通过将所述组合复合材料与含有一种分析物的样品混合，将固定在复合材料内的生物材料与各自的配体或特异性底物或其他特异性相互作用(或分析物)的分子之间的相互作用/反应的每个事件，视为掺杂复合材料的使用循环。例如，当固定化材料是酶或辅酶时，一个使用循环将是酶促反应的一个循环，当固定化生物材料是抗体、抗原或半抗原蛋白时，一个使用循环将是形成免疫复合物的反应的一个循环。
一个使用周期将优选地包括在下一个周期之前调节并洗涤组合复合材料的步骤。它还可能包括用于检测所述相互作用/反应的发生的其他步骤。
因此，本发明的组合复合材料可用于将使用活性或可活化生物材料的任何应用中，更优选地，当在水性介质中使用生物分子时，关于并且不限于一些情况，可用于医学诊断中的免疫复合物的形成，或通过固定化酶的生物催化形成产物。
相对于传统催化，生物催化的优势已得到广泛认可，这来源于酶的固定化并导致了更高的催化效率，更高的酶促稳定性，更高的底物选择性以及由于热操作条件要求较低导致的较低的使用成本，以及对环境更友好[15]。
通过这种方式，在本发明的组合复合材料的一个实施方式中，它可用作酶的载体，因此具有酶活性以及若干反应周循环。此外，将提供碱性磷酸酶的实施例，但不限于此。
在本发明的组合复合材料的一个优选实施方式中，它将用作免疫活性蛋白的载体，例如抗体、抗原或半抗原蛋白，使免疫活性蛋白在与各个配体连接的连续循环中具有活性。因此，在每个使用周期中，将有可能检测固定在组合复合材料内的那些免疫活性蛋白的特异性配体的连接。
关于与特定病相关的固定在组合复合材料中的上述免疫活性蛋白或各自的配体，组合复合材料可通过检测生物样品中存在的特异性配体而用于诊断这种疾病。优选地，生物样品将来自人或高级动物，更优选为生物流体，例如来自血液的血浆/血清、尿液、来自组织浸软的上清液或任何其他不具有从医学诊断建议的个体获得的细胞的水性流体。待诊断的疾病可以是触发人或高级动物的流体和/或组织中抗原和/或抗体存在的任何病。
因此，本发明的组合复合材料的一种用途是在医学诊断上，这构成一种优选用途。
更详细地但不限于，本发明的组合复合材料在医学诊断中的使用遵循免疫诊断的原理，在于提供将怀疑其中包含感兴趣的分析物(例如抗体、抗原或其他分析物)的一种生物样品与各自的特异性配体接触。这些特异性配体将是固定在组合复合材料中的抗原、抗体或任何其他特异性配体，组合复合材料的孔隙率能使水性液体样品中存在的上述分析物渗透，直到它们与特异性固定化配体接触。这类和其他类或这两类的分析物或各自的特异性配体将与病相关。
因此，通过使待分析的生物样品与掺杂有特定分析物的特异性配体的组合复合材料接触，并且该分析物存在于水性样品中，就会形成特定的复合分析物-配体，例如免疫复合抗原-抗体，其可以被进一步检测到，从而阐明了生物样品中分析物存在与否的结论，并因此对相关疾病进行阳性或阴性诊断。
所述检测可通过任何适当的方法进行，例如对标记的抗体进行着色或重现荧光。
将进一步描述该实施方式的一个实施例，其中通过第二标记抗体(用酶标记，例如过氧化物酶)来检测生物样品与固定了抗原(或抗体)的组合复合材料接触后形成的免疫复合物(第一)，该第二标记抗体特异性地与生物样品的抗体(或抗原)连接，从而形成第二免疫复合物。被第二抗体的标记酶降解的发色底物的进一步添加提供了组合复合材料的富色彩的外观，从而完成了对所述第一复合物的检测。
通过将相同的生物样品应用于掺有非免疫原性蛋白的相同复合材料后，可以通过无色来验证上述检测。
回收组合复合材料使其在连续的使用循环中的使用成为可能。如已经描述和进一步证明的，本发明的组合复合材料能够至少重复使用20次使用循环。
在该实施方式的一个方面，本发明的双重固定了一种免疫活性蛋白的组合复合材料，将被用来填充分析室，该分析室被设计用于检测生物样品中存在的所述免疫活性蛋白(靶-分析物)的特异性配体，在这种分析室中组合复合材料将与生物样品接触。
具有组合复合材料的分析室的填充概况将根据靶-分析物和/或固定化生物材料进行调整，并将由用于调整操作流变学的初步试验来确定。以同样的方式，分析室的使用方案、试剂和生物样品的稀释率也将通过常规的初步试验来确定，以满足靶-分析物和/或固定化生物材料的敏感性和特异性标准。
因此，将要确定要固定在组合复合材料中的简单复合材料的最少含量以及要固定在组合复合材料中的简单复合材料的最大含量，该最少含量将能够检测生物样品中分析物的存在(灵敏度)，该最大含量将证明不同分析物之间没有交叉反应(特异性)。同时，将确定将满足分析室的最合适的粒度梯度曲线。
因此，可以想到一种设备，该设备将包括一系列上述分析室，优选直至垂直平行设置的8个室，并在将放置液体样品的公共液体收集器的顶部提供。每个专门用于检测一种独特的分析物的分析室的旁边都有一个专门用于阴性对照测试的类似的室，该类似的室将完全填充具有相同粒度梯度曲线的组合复合材料，该组合复合材料固定了相同含量的简单复合材料，但掺有非免疫原性蛋白。
因此，该设备将由成对的室-分析室和相应的阴性对照室构成，每个分析室均填充有双重固定如上所述的一种不同的活性或可活化生物材料的组合复合材料，并且旁边有一个阴性对照室，该阴性对照室填充有双重固定一种非免疫反应性生物材料的组合复合材料。这种设备将能够在一个独特的生物样品中以及在每个使用循环中检测不同的靶-分析物的数量，优选地直至4种。
因此，本发明的一个优选实施方式是一种便携式且易于使用的设备，不需要电能供应，并且将使每个生物样品中得阳性或隐性诊断成为可能，存在的分析物的数量优选地(直至4种)与构成该构造的分析室的数量一样多。特别地，由于上述来自怀疑具有一种特定病的人类或高级动物的生物流体的一个独特的样品中的每种分析物都与病有关，该设备将能够鉴别诊断直至四种病。此外，该设备可重复使用至少20次连续的分析使用(诊断试验)循环。
可以以试剂盒形式呈现该设备，除了该设备本身之外，还将包括使用说明和诊断试验操作所需的所有试剂。
前面将描述一些实施本发明的优选方式的实施例，并且还将报道本发明的一些错误和尝试的试验。
附图说明
图1：烷氧化物-原硅酸四甲酯(TMOS)的结构示意图；
图2：简单复合材料在室内停留成熟时的质量损失；
图3：组合复合材料在室内停留成熟时的质量损失；
图4：与固定化酶的质量相关的，由固定在简单复合材料中的碱性磷酸酶催化的对硝基苯酚的产生(对硝基苯酚磷酸盐在100mM、pH＝9.1的磷酸盐缓冲液水性介质中的水解)；
图5：与固定化酶的质量相关的，由固定在组合复合材料中的碱性磷酸酶催化的对硝基苯酚的产生(对硝基苯酚磷酸盐在100mM、pH＝9.1的磷酸盐缓冲液水性介质中的水解)；
图6：用13份的1.0ml蒸馏水进行洗脱，每隔3分钟收集的样品的染料浓度；经历始于用1.0ml浓度为1.4mg/100ml的伊文思蓝(Evan-blue)水溶液进行洗脱，渗透上方层(1.35g，粒度(G)＞1.0mm3；1.8g，1.0mm3＞G＞710μm3；中心层为2.70g，710μm3＞G＞212μm3；1.60g，1.0mm3＞G＞710μm3)上的一定粒度梯度的组合复合材料；使组合复合材料充满12cm3的反应器，其尺寸为4cm长×3cm宽×1cm高；
图7：用12份的1.0ml蒸馏水进行洗脱，每隔30秒收集的样品的染料浓度；经历始于用1.0ml浓度为1.4mg/100ml的伊文思蓝水溶液进行洗脱，渗透上方层(1.35g，粒度(G)＞1.0mm3；1.8g，1.0mm3＞G＞710μm3；中心层为2.70g，710μm3＞G＞300μm3；1.16g，1.0mm3＞G＞710μm3)上的一定粒度梯度的组合复合材料；使组合复合材料充满12cm3的反应器，其尺寸为4cm长×3cm宽×1cm高；
图8：用11份的1.0ml蒸馏水进行洗脱，每隔10秒收集的样品的染料浓度；经历始于用1.0ml浓度为1.4mg/100ml的伊文思蓝水溶液进行洗脱，渗透上方层(1.35g，粒度(G)＞1.0mm3；1.8g，1.0mm3＞G＞710μm3；中心层为2.70g，710μm3＞G＞500μm3；0.97g，1.0mm3＞G＞710μm3)上的一定粒度梯度的组合复合材料；使组合复合材料充满12cm3的反应器，其尺寸为4cm长×3cm宽×1cm高；
图9：用15份的1.0ml蒸馏水进行洗脱，每隔90秒收集的样品的染料浓度；经历始于用1.0ml浓度为1.4mg/100ml的伊文思蓝(Evan-blue)水溶液进行洗脱，通过在上方层(1.35g，粒度(G)＞1.0mm3；1.8g，1.0mm3＞G＞710μm3；中心层为2.70g，500μm3＞G＞300μm3；1.90g，1.0mm3＞G＞710μm3)上渗透一定粒度梯度的组合复合材料；使组合复合材料充满12cm3的反应器，其尺寸为4cm长×3cm宽×1cm高；
图10：使以1：100和1：200稀释(在10mM、pH＝7.3的磷酸盐缓冲液中稀释)的1.0ml人血液渗透上方层(1.35g，粒度(G)＞1.0mm3；1.8g，1.0mm3＞G＞710μm3)、中心层(2.70g，710μm3＞G＞500μm3；0.97g，1.0mm3＞G＞710μm3)上的一定粒度梯度的组合复合材料后收集的1.0ml蒸馏水的馏分中的血红蛋白浓度；使组合复合材料充满12cm3的反应器，其尺寸为4cm长×3cm宽×1cm高；
图11：使以1：100稀释(在10mM、pH＝7.3的磷酸盐缓冲液中稀释)的1.0ml人血液渗透上方层(1.35g，粒度(G)＞1.0mm3；1.8g，1.0mm3＞G＞710μm3)、中心层(2.70g，710μm3＞G＞500μm3；0.97g，1.0mm3＞G＞710μm3)上的一定粒度梯度的组合复合材料后收集的初始10.0ml和连续的1.0ml的蒸馏水的馏分中的血红蛋白浓度；使组合复合材料充满12cm3的反应器，其尺寸为4cm长×3cm宽×1cm高；
图12：使不同稀释度(在10mM、pH＝7.3的磷酸盐缓冲液中稀释)的1.0ml人血液渗透上方层(1.35g，粒度(G)＞1.0mm3；1.8g，1.0mm3＞G＞710μm3)、中心层(2.70g，710μm3＞G＞500μm3；0.97g，1.0mm3＞G＞710μm3)上的一定粒度梯度的组合复合材料后收集的三个10.0ml馏分和一个1.0ml的最后一份馏分的蒸馏水的中的血红蛋白浓度；使组合复合材料充满12cm3的反应器，其尺寸为4cm长×3cm宽×1cm高；
图13：对碱性磷酸酶反应产物对硝基苯酚的浓度进行校准的实施例；
图14：添加在4.0ml份数中的浓度为0.75mM(在磷酸盐缓冲液100mM pH＝9,1中)的对硝基苯酚磷酸盐的水解反应产率，其渗透了掺有浓度为0.43％(m/m)的碱性磷酸酶的一定粒度梯度的组合复合材料；上方层的梯度为：1.35g，粒度(G)＞1.0mm3；1.8g，1.0mm3＞G＞710μm3；中心层为：2.70g，500μm3＞G＞300μm3；1.90g，1.0mm3＞G＞710μm3；使组合复合材料充满12cm3的反应器，其尺寸为4cm长×3cm宽×1cm高；
图15：两个装有组合复合材料的室的照片；左侧的室填充有掺有牛血清白蛋白的组合复合材料，右侧的室填充有掺有粘蛋白的组合复合材料；图像是对产生抗体-抗粘蛋白的杂交瘤细胞培养物的上清液进行试验后获得的；发色过氧化物酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺揭示了第二抗体的连接；
图16：设备原型的照片，其中所有室在一个一次性结构中平行放置，位于一个公共液体收集器的下方和底部收集托盘的上方。
具体实施方式
实施例1-复合材料配方
实施例1.1.-简单复合材料
在制备指示性体积为20ml的简单复合材料的前体时，遵循Alstein及同事[16]所描述的方案，其中使用5.0ml正硅酸四甲酯(TMOS)作为原硅酸盐前体；4.84ml盐酸(2.5mM)；1.0ml聚乙二醇(0.4KDa)。将混合物在涡旋中搅拌，直到液体介质呈现透明。均质化作用放热，然后对混合物进行超声处理30分钟。预先将180mg至500mg冻干蛋白(例如酶、抗原/抗体)溶于10m ml HEPES缓冲液(50mM pH＝7.5)中。
将10ml超声处理的混合物加入相同体积的溶解了蛋白的HEPES缓冲液中。将该混合物均质化，同时发生凝胶化约6分钟。然后将固化的凝胶细碎化，并散布在玻璃表面上，形成薄层，以便在室内暴露干燥。在成熟时，损失了约84％的体积质量：从前体的20.0ml初始液体体积中，大约获得了3.0g的成熟复合物。
然后将简单复合材料研磨成小于106μm3的粒度。成熟的简单复合材料的水含量(aw)约为11ppm。成熟的简单复合材料的蛋白浓度(蛋白质量/复合材料质量)在0.5％和1.8％之间。
对于免疫测定，还合成了简单复合材料，用于固定了牛血清白蛋白的阴性对照，其抗原/抗体的质量与上述完全相同。
实施例1.2.-组合复合材料
1.2.1.固定复合材料失败
试图合成组合复合材料，遵循了常规的溶胶-凝胶制备方案，试图固定一种先前合成的简单复合材料，而不是游离蛋白。了解了原硅酸盐结构发生化学攻击所需的质子可用性，进行了以下实验：用50μl的100mM HCl在不同体积的水的pH＝7.0的缓冲介质中的溶液，来水解1.5ml TMOS，以便获得与前述简单复合材料相容的亲水性复合材料。
发现反应介质中的水分亏缺与简单复合材料的质量成比例，尽管线性遵循简单复合材料质量与前体体积的初始比例。因此，TMOS水解完全失败。表1列出了汇编的经历，阐明了将简单的复合材料固定在第二溶胶-凝胶中的困难。
表1：试图将简单复合材料固定在溶胶-凝胶中的经历。
1.2.2.组合复合材料的实用配方
使简单复合材料以自0.83％(m/v)直至3.34％(m/v)的浓度进行合成。相对于3.0ml的单位前体体积，添加25mg至100mg的粒度小于106μm3并且水含量(aw)约为11ppm的简单复合材料。将该简单复合材料悬浮在1.5ml磷酸盐缓冲液(PB)中，该缓冲液是用38mMNa2HPO4.2H2O；62mM的KH2PO4制备的。在25℃温度，将PB进一步调整为pH＝6.8±0.2(添加1.0M NaOH等分试样)。
制备了一种HCl溶液，其浓度取决于简单复合材料的higrophilia，并通过各自的固定化蛋白进行调节。例如但不限于，对于碱性磷酸酶，[HCl]＝4.5mM；对于粘蛋白，[HCl]＝8.3mM。
将540μl蒸馏水与50μl HCl溶液混合，然后添加到1.5ml的TMOS中。在最初的120秒内将混合物均质化，并且在3分钟后将1.5ml的该混合物转移至相同体积的简单复合材料的PB悬浮液中。凝胶化发生在10秒至15秒内，在此期间将培养基均质化，以确保简单复合材料颗粒的均匀分布。
聚合进行30分钟至90分钟，然后将固化的凝胶碎裂成近似体积尺寸小于2mm3和2mm3至4mm3的颗粒。
在固定抗原/抗体时，将固化的凝胶在2.0％(m/v)的牛血清白蛋白(BSA)中以400rpm的定轨搅拌孵育24小时。溶剂是用7.6mM Na2HPO4.2H2O；2.4mM KH2PO4；137mM NaCl；2.7mM KCl制备的10mM pH＝7.3±0.3的磷酸盐缓冲液。孵育体积以三倍体积的溶液与一体积的固化凝胶的比例，孵育后将其转移到清洁干燥的玻璃表面上。从在玻璃表面上开始，更换三次玻璃：成熟24小时的时候、成熟48小时的时候和成熟72小时的时候。
组合复合材料的成熟(无论是否在BSA中孵育)都通过暴露于室内条件进行了7天，之后体积质量损失约为70％，即最终水含量aW≈19ppm。
BSA孵育后成熟的组合复合材料的蛋白浓度是简单复合材料中的蛋白质浓度的3.0到3.5倍，未进行BSA孵育的成熟的组合复合材料的蛋白浓度为0.2至0.4。
成熟后，进行颗粒大小(G)分离并将其分为五类：
实施例2-成熟时间
研究了随着暴露于室内条件的简单复合材料和组合复合材料的质量损失。监测从凝胶化的时刻开始进行直到评估的质量值变化小于2.0％为止。
对于两种复合材料，均监测质量相似且两个数量级质量的样品，以验证成熟对前体体积(初始质量)的依赖关系：研究了1.5ml和3.0ml的样品。图2和图3分别示出了简单复合材料和组合复合材料的收集数据。
从获得的结果可以推断出简单复合材料和组合复合材料的质量损失的稳定时间分别为72小时和50小时。因此，将这两种配方的成熟区间确定为7天，成熟的最后的含水量为：
1、简单复合材料aw＝11ppm±0.2ppm；
2、组合复合材料aw＝19ppm±0.6ppm。
实施例3-浸出研究
3.1.用于评估复合材料和上清液的蛋白浓度的蛋白定量方法
蛋白浓度的测定采用改良的劳里法(Lowry方法)[17]。然而，初始步骤无法保证复合材料样品中最初存在的蛋白质之间的零质量平衡(zero-mass-balance)，并且蛋白质由于热碱性消化而转移到上清液中(复合材料样品在100℃、10min内浸没于100M NaOH中，然后进行冰孵育)。
对本文使用的方法进行了优化，以确保所有复合材料样品均被消化，并将固有蛋白质含量转移到NaOH溶液：复合材料样品的质量不大于5.0mg，粒度小于106μm3。从每个消化培养基中取200μl份进行分析。
使用20μg/ml至200μg/ml浓度的BSA标准溶液(100％纯度)对蛋白浓度进行校准：每个浓度使用200μl份进行校准。将劳里试剂(1.0ml)添加到分析上清液和BSA标准溶液中，并在40分钟后添加200μl福林-肖卡(Folin-Ciocalteau)试剂(以1：4稀释)。10min后，当记录值高于1.0时，读取培养液样品(已经对样品进行了稀释)在750nm波长处的吸光度。
3.2.浸出造成的蛋白损失
3.2.1.简单复合材料
首先对固定了三种蛋白质：牛血清白蛋白(BSA)、碱性磷酸酶(ALP)和通用抗体(IgG)的简单复合材料的样品的浸出进行了测试。
本文定义的蛋白负载量是相对于仍在溶胶-凝胶制备中的前体的总体积添加的冻干试剂的质量。旨在获得两组复合材料，其具有不同的蛋白数量级浓度(1.0％和10.0％)的BSA和ALP，并且三分之一类型为固定化抗体(IgG)。因此，针对不同的蛋白质浓度以及使用不同的蛋白质类型，在三次试验中对复合材料的蛋白损失进行了监测。
浸出试验前(成熟和干燥的复合材料)和浸出试验后对复合材料中保留的蛋白含量进行定量分析，其中将各个测试样品在40℃干燥24小时，然后在室内暴露10天。
考虑到蛋白质浸出过程与颗粒的面积/体积比成正比，测试了两种粒度：1mm3以上和750μm3以下。
首先，使用30mg的质量样品，并通过在72个小时的200rpm定轨搅拌下在蒸馏水中孵育成熟的碎裂的复合材料来进行实验。
在10ml的小瓶中，孵育液的体积为1.0ml，在每个试验结束时，将液体介质倒出并以11K rpm离心10min。在三个单独的定量事件中对澄清上清液中三份200μl进行分析，以确定上清液中的蛋白浓度。
确定仍保留在复合材料中的浸出后蛋白质的步骤遵循上述5.0ml样品质量的方案，以确保溶胶-凝胶完全消化，从而使固定化蛋白质大量释放至要分析的上清液中。再次在三个分开的蛋白浓度定量事件中对200μl的三份进行分析。
从获得的数据进行质量平衡以定量相对于相应确定的初始浓度的蛋白质损失。基于此，在浸出经历之前和之后，计算了复合材料的蛋白浓度之间的差值。另外，对浸出之前复合材料样品的总质量中存在的蛋白的量(使用前述数据)与1.0ml孵育培养基中蛋白的总量进行了比较。将记录的数据取平均值，并将相应的数字列于表2。
表2：在掺杂了不同类型蛋白质和不同蛋白质浓度的简单复合材料的浸出测试中获得的蛋白质浓度。
这些结果证实了颗粒大小越小，保留的蛋白质的侵蚀在某种程度上与之越密切相关：随着试验的颗粒大小越大，浸出后记录的复合材料的浓度与初始负载越接近。
另一方面，对于较低粒度的样品，复合材料的初始负载与上清液中溶解的蛋白的质量之间的差异较小，这是蛋白质向浸出介质转移的迹象。简单复合材料中保留的不同蛋白质类型的结果以及相应的不同负载的结果的共同证明，浸出现象不仅与初始蛋白负载成正比，还与颗粒大小成正比。
关于IgG的记录数据证实了Alstein及其同事[16]提到的抗体在该复合材料中保留率升高的结果，其中两种粒度的浸出前后的差异在相同数量级。
另外，还测试了在相同的实验条件下，在最大蛋白负载和较小的粒度下，掺有ALP的简单复合材料的5mg和60mg质量样品的浸出。所获得的数字列于表3，其中其与30mg质量样品作比较。
表3：在浓度相同但样品质量不同的掺有碱性磷酸酶的简单复合材料的浸出测试中获得的蛋白浓度。
通过这些图可以得出结论，保留的蛋白的损失受到液体介质中颗粒扩散的影响：对于相同的批次量，试验样品的质量越低，浸出前后复合材料中保留的蛋白浓度的差越高。
另一方面，对于较大质量的样品，很明显复合材料的初始蛋白负载与浸出上清液中的蛋白质浓度之间存在较大差异，这意味着与较小质量的样品相比，蛋白质向培养液中的转移较少。
对于相同的反应量，较小的蛋白侵蚀和较大的简单复合材料的质量的影响允许推断出，在相同的分批反应器体积中使用的复合材料越简单，发生的蛋白总损失越少，因此掺杂的简单复合材料的生物过程活性越稳定。
3.2.2.组合复合材料
考虑到与简单复合材料中记录的定量蛋白损失的比较，对固定了掺杂有相同蛋白质的简单复合材料的组合复合材料进行相同的实验步骤，这将进一步允许监测酶(碱性磷酸酶)活性反应。
合成了具有最高蛋白质负载(43.11μg/mg)的固定了简单复合材料的组合复合材料，以获得了两组具有不同蛋白浓度的样品：8.81μg/mg和23.14μg/mg。与之前的实验类似，对小颗粒大小的30mg破碎样品进行试验。数据处理和实验步骤与简单复合材料浸出监测的那些相同，表4列出了获得的结果。
表4：由不同质量的掺有碱性磷酸酶的简单复合材料制备的组合复合材料的浸出测试中获得的蛋白浓度。
蛋白初始浓度最高的组合复合材料在浸出前后的差值比简单复合材料低约10倍(0.78μg/mg vs 9.94μg/mg)，蛋白浓度比简单复合材料低约两倍(23.14μg/mg vs 43.11μg/mg)。
同样地，使用低粒度的组合复合材料的5mg和60mg质量样品进行浸出试验。表5列出了获得的结果。
表5：在掺有23.14μg/mg浓度的碱性磷酸酶的样品质量不同的组合复合材料的浸出试验中获得的蛋白浓度。
图中证实了蛋白质的痕量损失与相同液体体积中组合复合材料的量成反比。
与简单复合材料结果相比，最后获得的结果证明了组合复合材料中蛋白质的损失较小：浸出前后复合材料中保留的蛋白质差异。同时，将初始固定化蛋白和上清液中的蛋白含量进行比较，记录了更大的差异，这反映出更高的保留级。
3.2.3.暴露于过高浓度的盐水培养基
将具有最高蛋白浓度和较小粒度的简单复合材料样品和组合复合材料样品暴露于2.0M NaCl的高盐浓度溶液中，以评估在高离子应力培养基中的蛋白损失。
对于这两种复合材料，通过在200rpm的定轨搅拌下浸没72小时来测试60mg质量样品，对浸出的复合材料和相应的上清液按照之前的相同的方案进行蛋白质定量分析。表6列出了获得的数据。
表6：在掺有碱性磷酸酶并浸入2.0M NaCl溶液的简单复合材料和组合复合材料的浸出测试中获得的蛋白浓度。
关于暴露于盐溶液之前和之后的复合材料中保留的蛋白浓度之差的记录值与通过暴露于蒸馏水所记录的值处于相同数量级。
在实验结束时比较初始复合材料样品中的蛋白质量数和上清液中的蛋白质量数，在这种情况下，显然有较小的差异，这可能是由于高离子浓度的本能反应导致蛋白质更强烈地转移到培养液中而导致的现象。
然而，必须将这些数字看作是浸出溶液处于与预计的可用生理样品相比过高的盐浓度，并且暴露时间比优选实施方式中所用的时间长得多。
实施例4-催化试验
先前已经证实本发明的组合复合材料的配方具有固定/保留蛋白质的能力，然后旨在验证一种蛋白质作为酶是否仍然具有活性。在这种情况下，对碱性磷酸酶(ALP；SigmaAldrich Cat.N°10 567 752 001)的活性进行监测。首先作为游离态，然后作为在简单复合材料和组合复合材料中的固定化酶。
酶促试验重复了分光光度法，以定量对硝基苯酚磷酸盐(pNPP)水解的标准反应产物的产物对硝基苯酚(pNP)的浓度，已知的该反应具有1：1化学计量。
4.1.固定在简单复合材料中的酶
按照常规的游离酶试验，以8％和10％的前体浓度(m/v)合成了两个固定了ALP的简单复合材料的样品。在13天成熟期结束时，浓度分别为4.8mg蛋白/g复合材料和6.2mg蛋白/g复合材料。
考虑到减少底物分子的外部可及性限制，将固定的成熟复合材料样品破碎成1mm3至2mm3范围的颗粒大小。本试验使用质量为5.0g至8.3g的简单复合材料样品进行，并由相应复合材料的蛋白浓度和样品的相应质量来推导批量的酶浓度。
在10ml有效容积的反应器中进行酶促试验，在室温下，向其中添加3.6ml在游离酶试验中使用的相同的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液100mM，pH＝9.1)。动力学研究开始于添加0.4ml底物溶液(溶于pH＝9.1缓冲液的pNPP)，反应进行28分钟，在1:30min区间收集200μl液体培养基。在总反应体积下的初始底物浓度相同，约为3.0mM。数据处理时记录了，在28分钟的时间内，收集样品逐渐减少了反应介质体积，但催化的复合材料的质量是相同的。
记录的值使得可以绘制关于酶负载的函数的动力学曲线图，如图4所示。
获得的结果表明，对于一个相同的初始底物浓度，产物浓度与复合材料(含固定化酶)的质量成正比。
4.2.固定了掺有酶的简单复合材料的组合复合材料
对用于浸出测试的来自相同配方的组合复合材料(蛋白质浓度为23.14μg/ml)进行了研究，并对14mg至20mg质量的样品进行了测试。
样品的颗粒大小、酶促试验的实验步骤和数据处理与简单复合材料动力学研究的那些完全相同。类似地，根据预先确定的复合材料的蛋白浓度和每个试验所用的样品的质量，对反应介质中存在的酶进行定量。获得的结果如图5所示。
对由固定在两种复合材料制剂中的相同的酶催化的pNPP水解产物pNP的最大产量进行了比较，很明显的是，对于相同质量的酶(11.65mg简单复合材料；10.8mg简单复合材料vs12mg组合复合材料；11mg组合复合材料)，在相似的时间反应(15min)下，简单复合材料产生的pNP(40.57mM；26.76mM)比组合复合材料产生的pNP(5.03mM；3.03mM)多8到9倍。
考虑到本发明的组合复合材料是一种对酶掺杂的简单复合材料的包覆(封装在具有坚固性和底物外部可及性的颗粒大小范围内)，因此，酶活性位点越来越少是可以理解的，因此，酶代谢产物的产量较低。然而，如浸出研究早期证明的，较低的催化效率被固定化蛋白的更持久的保留所补偿。
实施例5-不同粒度概况下的排放
现在将进行用染料水溶液和稀释的血液渗透颗粒状组合复合材料的水压测试，以获得与医学诊断设备中使用相适应的停留时间。
本文测试的组合复合材料被用作柱的填充床，其也称为分析室或反应器，相应地用于免疫试验或酶促测试。它是一个长方形的盒，尺寸为4cm长×3cm宽×1cm高，由透明的丙烯酸材料制成，可以看得见内部。其内容物的处理是通过钻孔的可移动顶盖来进行的，该顶盖一旦安装在盒子上，便可以使洗脱液通过其内部。相对顶部的表面也要钻孔，以允许液体流出，两个顶盖的孔的直径均为1.0mm。
参照9克的有效质量值(通过对柱全部注水进行称重(体积质量为1g/ml)进行评估)，计划用颗粒状复合材料填充柱。相对于诊断设备装置上的应用，这种质量的量过大，估计后最终以3：1进行了缩小。这些研究的目的是测试液体样品的排放机制，因此，尽管颗粒大小是唯一的条件变量，也因此使用了具有相同成熟度的组合复合材料。
初始对粒度梯度曲线进行了编程，以完全填充有效容积，并且各自的值为：
·底层：15％(1.35g)颗粒(G)＞1.0mm3；
·底部中间层：20％(1.80g)1.0mm3＞G＞710μm3；
·中间层：在710μm3下，0％(2.70g)可变粒度；
·顶部中间层：20％(1.80g)1.0mm3＞G＞710μm3；
·顶层：15％(1.35g)颗粒＞1.0mm3。
5.1.监测染料溶液的排放
按照颗粒大小分离之后，相应地放置两个底层，并且中心层由范围为710μm3至212μm3大小的颗粒组成。试图按编程的放置中间层的上一层，但只能放置1.6g。放置好每一层后，用蒸馏水洗涤，以提高颗粒的致密性并减少优先的径流方式，这样填充步骤就完成了。然后将柱暴露于40℃干热环境下放置24h。
该试验开始于对使柱内容物饱和的水量-有效液体容积(useful liquid volume，ULV)进行测量(将水添加到干燥颗粒状复合材料内容物中，直到底部出现第一滴水)：测得为3.0ml。建议是在这样的梯度曲线下评估保留水的体积。饱和后，很明显，每添加1毫升，对应于从柱的底排出的1毫升，这证明了要孵育柱的整个内容物，应添加等于ULV的液体量。
另外，对添加的每毫升所经过的流失时间进行监测，直到收集了至少900μl，并且这种测量进行了25次试验，其中3分钟是平均记录时间。然后将柱暴露于40℃干热条件下放置24h。再次使复合材料颗粒梯度达到水饱和，并洗脱出一份1.0ml的伊文思蓝(1.4mg/100ml)。
对伊文思蓝溶液进行吸光度校准(λ＝608nm)(从1：1＝1.426％±6％开始；直到1:10＝0.134％±10％)。染料溶液的下溃流通过对连续的洗脱/收集的1.0ml蒸馏水馏分的分光光度读数来进行监测，各自的记录值如图6所示。
除去湿粒状复合材料后，按照相同步骤将新的干粒状复合材料放入柱中，不同之处在于中心层由710μm3至300μm3的颗粒组成，而上层再次只由1.0mm3＞G＞710μm3的颗粒组成，但这一次消耗了1.16g颗粒状复合材料。对添加的每毫升所经过的流失时间进行监测，直到收集了至少900μl，并且这种测量进行了30次试验，其中25秒是平均记录时间。
然后将柱暴露于40℃干热条件下放置24h。对残留液体(1.9ml)的体积进行进一步评估，并重复了染料溶液排放的试验。收集的数据如图7所示。
除去湿粒状复合材料后，按照相同步骤将新的干粒状复合材料放入柱中，不同之处在于中心层由710μm3至500μm3的颗粒组成，而上层再次只由1.0mm3＞G＞710μm3的颗粒状复合材料组成，但这一次消耗了0.98g颗粒状复合材料。对添加的每毫升所经过的流失时间进行监测，直到收集了至少900μl，并且这种监测进行了25次试验，其中10秒是平均记录时间。然后将柱暴露于40℃干热条件下放置24h。对残留液体(1.0ml)的体积进行进一步评估，并重复了染料溶液排放的试验。收集的数据如图8所示。
除去湿粒状复合材料后，按照相同步骤将新的干粒状复合材料放入柱中，不同之处在于中心层由500μm3至300μm3的颗粒组成，而上层再次只由1.0mm3＞G＞710μm3的颗粒状复合材料组成，但这一次消耗了1.90g颗粒状复合材料。对添加的每毫升所经过的流失时间进行监测，直到收集了至少900μl，并且这种监测进行了25次试验，其中1:30分钟是平均记录时间。
然后将柱暴露于40℃干热条件下放置24h。对残留液体(2.0ml)的体积进行进一步评估，并重复了染料溶液排放的试验。收集的数据如图9所示。
所有这些结果表明，对于该复合材料占据的相同体积并被水渗透的情况，残留液体量和流失时间受最小的颗粒大小层限制。
表7示出了这些情况，其中粒度值以及底部和底部中间层的相应质量得以维持。同时，改变中心层的粒度但保持其质量含量，导致渗透液的停留时间变化。
表7：不同颗粒大小的组合复合材料的中心层(2.7g)的排水量，其也影响了残留液体的有效体积和柱中持有的总质量。
在中心层，对于相同的粒度区间，1.0ml染料溶液的排放时间：
1.与10秒(710μm3＞G＞500μm3)相比，在约200μm3的范围内：90秒(500μm3＞G＞300μm3)；
2.与30秒(710μm3＞G＞300μm3)相比，更大的范围：180秒(700μm3＞G＞212μm3)。
在相同的粒度区间的排放量：
a.与12秒(710μm3＞G＞500μm3)相比，在约200μm3的范围内：15ml(500μm3＞G＞300μm3)；
b.与12ml(710μm3＞G＞300μm3)相比，更大的范围：13ml(710μm3＞G＞212μm3)。
总之，在710μm3颗粒大小的组合复合材料的压实层中，含水样品的渗透体积与颗粒大小区间的量级成正比，与各自的排放时间成反比。
同样明显的是，柱内的复合材料总质量与颗粒大小成反比。关于压实这种发现是可预期的(颗粒越小则越明显)，并因此得到使密度较高的较小的颗粒间空间。
5.2.监测血液排放
对稀释血液的排放进行了测试，根据粒度梯度发现，染料溶液的流动状态较好(中心层710μm3＞G＞500μm3)。将本发明人收集的样品用EDTA(50mg/ml)抗凝并用磷酸盐缓冲液(10mM，pH＝7.3)稀释。洗脱1.0ml的稀释样品，然后洗脱1.0ml蒸馏水馏分，并通过在540nm波长的吸光度下读取收集的馏分来评估径流，该波长靶向血红蛋白(Hb)分子。对0.6mg/ml(吸光度＝0.314％±7％)至3.0mg/ml(吸光度＝1.635％±4％)的Hb浓度进行校准。采样血的Hb浓度为150mg/ml(±1.0％)。三次试验记录的结果如图10所示。
在这些结果之前，很明显，稀释的血液径流主要发生在4.0ml的渗透水之后，这与染料溶液排放的先前数据一致。因此可以得出结论，本文提到的稀释液中血液样品的渗透与浓度为1.4mg/100ml的伊文思蓝溶液记录的径流相同，并且它们是两种流变学相同的液体介质。
因此，推断1：200和1：100血液样品的排放在组合复合材料的其他梯度颗粒上具有相同的排放机制似乎是合理的，这可以预示粘度和密度与水相似的生物样品流体很好地接近固定化蛋白(抗原/抗体)的情况。
5.2.1.监测血液冲洗排放
根据记录的伊文思蓝或血液溶液的径流曲线，研究了组合复合材料梯度粒度的冲洗排放，首先用血液渗透，然后第一份使用10.0ml蒸馏水，随后进行五次连续洗脱，每次1.0ml蒸馏水。用1：100稀释血液进行一系列三次试验中，如图11所示，直接在第一份10.0ml中收集了96％±0.5％的添加的Hb。
根据这些结果，然后研究了使用较少稀释的血液样品(低至1:30)对颗粒状复合材料进行洗涤。在每个实验事件之间的方案中，用蒸馏水充分洗涤柱的颗粒状内容物，然后在35℃干燥24小时。在添加新的血液样品之前，用20.0ml蒸馏水使颗粒状复合材料饱和。
在用3份10.0ml蒸馏水洗脱和用最后1.0ml蒸馏水洗脱中监测收集的馏分的清除率，所得结果示于图12。
从收集的数据中明显看出，即使是最浓缩的血液样品，1.0ml单位体积分析血液的排放也最多出现在用10.0ml水进行洗脱的情况中，因为在第三和第四收集馏分中，Hb浓度低于1.0mg/ml。
考虑到这些测试是用6.82g的总的柱填充质量进行的，并且这些测试的缩放比也大约为3：1，然后在最终利用的规模下，对于相同的梯度(相对比例)，组合复合材料的估计质量将介于1.5g至3.0g之间。鉴于此，以及在本文中对粒度梯度进行线性缩放的研究，合理地估计有效洗涤量为10ml。
实施例6-酶反应器中的组合复合材料
在该实施例中，研究了组合复合材料填充上述丙烯酸柱的至少20个循环活性的酶活性，其由部分底物溶液提供，在垂直活塞流体制下该部分底物溶液由大气压推动渗透颗粒状复合材料。提出的方案是量化通过固定在组合复合材料中的碱性磷酸酶催化的对硝基苯酚磷酸盐(pNPP)向对硝基苯酚(pNP)转化的反应产率。
使用比活和酶负载对应的酶浓度阈值：0.4％(m/m)[18][19]。使用先前发现的颗粒大小梯度作为酶促过程的最佳径流：停留时间至少为1.5分钟(中心层粒度为500μm3＞G＞300μm3)。组合复合材料的总质量为7.75g，并进行压实，以使优先得径流方式最小化。残留液体的体积为2.0ml。
填充柱后，经历开始于在室温用先前用于类似催化经历的相同的洗脱液(磷酸盐缓冲液100mm，pH＝9.1)在此处也用作洗脱液，来充分洗涤颗粒状梯度复合材料。然后向其中加入4.0ml底物溶液(在pH＝9.1溶解)，孵育15分钟后，颗粒状复合材料被三份2.0ml洗脱液渗透，随后被八份1.0ml洗脱液渗透。一旦添加各自的洗脱级分，一份相同体积的，酶促反应产物即可收集到(相反于先前所述的分批过程)。代谢物浓度的定量是直接来源于吸光度读数
数据处理开始于对1.0：高达56μM的产物(pNP)浓度的吸光度值(λ＝405nm)进行校准(参见实施例图13)。
将收集的11个馏分中的每一个馏分所获得的Abs405 nm值转换为pNP浓度。在已知每个收集的馏分的体积的情况下，计算每个收集的馏分中存在的摩尔数。将反应产物的所收集的摩尔数相加。另外，已知底物(pNPP)浓度，基于进料到反应器中的溶液体积计算出初始提供的各自的摩尔数(参见表8)。
表8：固定了碱性磷酸酶的组合复合材料的生物反应器对对硝基苯酚磷酸盐水解的第一个实验结果的数据处理。
已知该反应为1：1化学计量百分比，计算出转化率：产物摩尔数*100/底物摩尔数。在第一次试验中，使用的底物浓度为318μM，记录的产率为7.4％。下一个试验使用高一个数量级的底物溶液：3.03mM，收率为19.5％。
第三次试验保持底物浓度并将延长孵育时间20分钟。记录的产率为25.7％。从该结果推断出更长的孵育时间使得所加入的底物能够更深度地水解。第四次试验是第三次的重复，记录的产率为24.1％。
在第五次试验中，底物浓度降至1/2，记录的产率为23.1％，以及在下一个试验中，在相同条件下，记录的值为29.7％。
在第七次试验中，底物浓度降低至1/4：750μM。记录的产率为36.4％。最后的试验重复了两次，记录的产率为：38.9％和35.6％。
在下一个实验事件中，进行了三次试验，重复了最后一个方案，记录的产量为：32.9％；28.8％；和28.2％。在一系列新的五次试验中，记录的产率为：25.4％；24.9％；27.5％；27.8％；和25.3％。在三次试验的另一项实验事件中，记录的产率为：16.6％；19.0％；和18.9％。
在随后两次试验中，记录的产率为：21.7％和21.1％。在最后一次实验事件中，进行了9次试验，记录的产率为：18.2％；16.0％；15.5％；16.7％；16.3％；14.6％；13.9％；14.0％；和19.0％。
对于第7次试验后，对这些提到的数字进行归一化步骤汇编在图14中，其中使用了750μM的底物浓度和20分钟的孵育时间。该图示出了记录的产率，该产率参考该系列的第二次实验获得的值(38.9％)，使其保持最大值：100％。
在得出这些结果之前，可以合理地得出结论，即组合复合材料始终适用于酶(碱性磷酸酶)的固定化，同时保持其活性。另外考虑到，经过七次试验的步骤调整后达到了实验标准化，因此合理地预见该复合材料制剂比最初指出的20个循环更多的循环数的使用情况。
实施例7-组合复合材料优选应用于诊断设备
现将描述本发明的组合复合材料的一种优选用途，该组合复合材料被应用在便携式设备上用于医学诊断，该便携式设备构造为垂直并行操作单元。它最多容纳4个单元，每个单元包括两个室，一个分析室和一个阴性对照室。
所有室都填充有颗粒状组合复合材料，其中分析用的室内填充有固定了与人或高级动物病的诊断有关的免疫应答蛋白、抗原或抗体的组合复合材料，阴性对照室填充有固定了免疫非应答蛋白的组合复合材料。
该设备的功能基于免疫诊断原理，其中生物样品被怀疑携带与病相关的抗体(或抗原)，通过操作该设备将那些分子与相应的特异性配体连接。该特异性配体将是固定在组合复合材料中的抗原(或抗体)，组合复合材料的孔径的物理特性使这些液体生物样品能够渗透。抗原-抗体连接后，将形成一级免疫复合物，必须清洗复合材料以去除多余的碎片和未连接的蛋白质。
在本实施例的第一个情况下，初步测试了固定了掺有粘蛋白1.8％(m/m)的简单复合材料的组合复合材料[20]的响应。组合复合材料用于填充与一个设备单元同调的测试柱。在测试柱中填充有颗粒状复合材料，其粒度梯度曲线类似于血液排放测试。
固定的抗原粘蛋白是具有与肿瘤细胞(例如乳腺癌)的表面配体同源的糖苷(glycidic structure)结构唾液酸的分子。通过新里斯本大学科学技术学院(Science andTechnology Faculty of Universidade Nova de Lisboa)的免疫学课题组提供的抗体-试剂的连接对第一复合物的形成进行了测试。这种抗体先前已显示出对赘生性组织的高连接亲和力[21]。在那些测试中的生物样品是来自产生抗体的动物细胞(杂交瘤细胞)培养物的上清液。
孵育生物样品后，洗涤颗粒状复合材料以除去过量的未连接的抗体。通过添加用过氧化物酶标记的第二抗体来检测形成的免疫复合物。这种抗体对所述第一抗体具有特异性亲和力。第二抗体的添加提供了第二免疫复合物的形成：抗原固定化-抗体生物样品-抗体标记。再次洗涤粒状复合材料以去除过量的未连接的蛋白。
然后添加过氧化物酶的发色底物：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。底物被第二抗体降解，并因此赋予组合复合材料以蓝绿色颜色，从而揭示了生物样品中第一抗体的存在。该步骤通过掺有非免疫原性蛋白牛血清白蛋白的同源颗粒状组合复合材料进行的相似测试得到了验证，如图15所示，在该组合复合材料中没有获得任何颜色。
回收颗粒状复合材料使分别再利用成为可能，并且该步骤通过用破坏第一抗体和第二抗体的连接的离液溶液进行洗脱来完成。然后洗涤颗粒状复合材料以除去所有释放的蛋白质。
7.1.初步试验方案
在将本发明的组合复合材料优先用于医学诊断中时，必须进行初步试验以测试敏感性和特异性标准。
将对固定了具有同一浓度的抗原/抗体/BSA的相同简单复合材料的组合复合材料样品进行测试。方案包括8个试验瓶，每个试验瓶具有100mg颗粒状复合材料的样品，粒度范围为100μm3至300μm3：
i)其中四个瓶的每个瓶分别具有固定了25mg；50mg；75mg；100mg的含有BSA的简单复合材料的颗粒状复合材料样品。当合成组合复合材料时，这些简单复合材料的质量对应于3.0ml前体。
ii)另外四个瓶的每个瓶分别具有固定了25mg；50mg；75mg；100mg的含有抗原/抗体的简单复合材料的颗粒状复合材料样品。当要合成组合复合材料时，这些简单复合材料的质量对应于3.0ml前体。
7.1.1.反应溶液
磷酸盐缓冲液10mM，pH＝7.3±0.3(25℃)+0.05％(m/v)吐温-20(PBS-T)用于：
·稀释生物样品；
·稀释标记的第二抗体；
·洗涤颗粒状组合复合材料。
发色过氧化物酶底物：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)在蒸馏水稀释下使用。
回收方法：RestoreTM蛋白质印迹剥离缓冲液(Western Blot Stripping Buffer)；Thermo Scientific(Sb)在蒸馏水稀释下使用。
7.1.2.使用瓶的实验步骤
步骤1：复合材料的调节。
将用2×2.5ml PBS-T湿润颗粒状组合复合材料：孵育时间：5min。然后将液体介质倒出。
步骤2：洗脱生物样品。
首先将生物液体样品以1:10稀释(在PBS-T中)至各自体积为2.5ml。旨在获得掺有抗原(或抗体)的复合材料明确着色的结果和掺有BSA的复合材料明确清除的结果，因此生物样品的稀释等级将从1：5到1:13进行优化。孵育时间：20min。然后将液体介质倒出。
步骤3：首先用2×2.5ml PBS-T洗涤。然后将液体介质倒出。
步骤4：洗脱第二抗体。
用过氧化物酶标记的第二抗体将首先以1：3333稀释(在PBS-T中)至各自体积为2.5ml。旨在获得掺有抗原(或抗体)的复合材料明确着色的结果和掺有BSA的复合材料明确清除的结果，因此稀释等级将从1：2000到1:5000进行优化。孵育时间：5min。然后将液体介质倒出。
步骤5：用4×2.5ml PBS-T进行第二次洗涤。然后将液体介质倒出。
步骤6：洗脱发色底物。
首先将过氧化物酶发色底物用蒸馏水以1：4稀释至各自体积为2.5ml。旨在获得掺有抗原(或抗体)的复合材料明确着色的结果和掺有BSA的复合材料明确清除的结果，因此TMB稀释等级将优化为1:3。孵育时间：10min至20min。然后将液体介质倒出。
结果：组合复合材料的着色是免疫复合物形成的结果。每个试验的复合材料样品中获得的颜色强度将给出该方法的分析标准的指示：
敏感性-将较少的简单复合材料(适时地25mg)禁锢在组合复合材料中，将能够检测生物样品中抗体(或抗原)的存在；
特异性-将最大质量的简单复合材料(适时地100mg)禁锢在组合复合材料中，在以下情况下不会显示交叉反应：
I.阴性对照组合复合材料无着色；
II.用含有不同特异性抗体(或抗原)的生物样品测试的组合复合材料无着色。
步骤7：回收。
首先用蒸馏水将剥离缓冲液以1:16稀释至各自体积为2.5ml。根据获得的清除率，Sb稀释液体从1:10到1:32进行优化。孵育时间：10min。然后将液体介质倒出。
步骤8：用6×2.5ml PBS-T进行第三次洗涤。然后将液体介质倒出。
7.1.3.填充室
该实施例涉及如先前所提到的设想最大容纳量为八个室的诊断医疗设备的操作。每个室的有效内部容积为9cm3，并如前所述进行填充。
成熟7天后，将颗粒状组合复合材料用蒸馏水洗涤，然后在37℃干燥3小时。颗粒大小分离定义了5种粒度等级：
每个室的填充物由6层组成，如下述从上到下颗粒大小的质量分别为：
·第6层：
·第5层：
·第4层：
·第3层：
·第2层：
·第1层：
通过用3.0ml至5.0ml蒸馏水进行洗脱来优化每一层的压实度，从而减少优先的径流方式的形成。一旦沉积了所有层，对室的剩余的自由体积从顶部开始填充(用直径为0.8mm至1.2mm的玻璃球填充)直至1.0cm。留下该上部空间以便具有可见的反流窗口。
将整个8个室在37℃放置48小时，然后通过用10ml蒸馏水进行洗脱来定量残留液体的体积。收集水后通过测量得到的差为2.0ml±0.4ml。
7.1.4.设备的操作
放置在液体收集器上的生物样品直接排到放置在下面的分析腔中，如图16所示。所有实验步骤中的液体排放均没有充满反流窗口，以避免室与室之间的横向污染。前面描述的实验步骤涉及一个室的操作，稀释等级先前已在初步试验中确定。
由于每个分析室与相应的阴性对照室同时运行，因此在设备运行时使用的最小液体体积是以下所示值的两倍。
步骤1：复合材料的调节。
用10.0ml PBS-T湿润颗粒状复合材料。
步骤2：洗脱生物样品。
将生物液体样品以1:5直至1:13稀释(在PBS-T中)至各自体积为4.0ml。孵育时间：20min。
步骤3：首先用2×10.0ml PBS-T洗涤。
步骤4：洗脱第二抗体。
将过氧化物酶标记的第二抗体的母液用PBS-T以1：2000直至1：5000稀释至各自体积为4.0ml。孵育时间：5min。
步骤5：用2份10.0ml PBS-T进行第二次洗涤。
步骤6：洗脱发色底物。
将过氧化物酶发色底物用蒸馏水以1:4直至1:3稀释至各自体积为4.0ml。孵育时间：10min至20min。
结果：填充有掺有粘蛋白的颗粒状组合复合材料的分析室获得了与粘蛋白浓度大约成正比的蓝绿色，而填充有掺有BSA的颗粒状组合复合材料的分析室对相应的粘蛋白浓度没有颜色变化。
步骤7：回收。
用蒸馏水将剥离缓冲液以1:16直至1:10稀释至各自体积为7.0ml。孵育时间：10min。
步骤8：用3份10.0ml PBS-T进行第三次洗涤。
对于整个8个室的操作，所使用的液体体积处于与一个室的值呈线性相关的量级。
8、参考文献
[1]Rassy,H.,Perrard,A.,Pierre,A.2003.Behaviour of Silica AerogelNetwork as Highly Porous Solid Solvent Media for Lipases in a ModelTransesterification Reaction.Chem.Biochem.44:203–210.
[2]Reetz,M.,Zonta,A.,Simplekamp,J.,Konen,W.1996.In situ fixation oflipase-containing hydrophobic sol-gel materials on stirred glass-highlyefficient heterogeneous biocatalyst.Chem.Comm.11:1397–1398.
[3]Reetz,M.,Tielmann,P.,W.,W.,Zonta,A.2003.SecondGeneration Sol-Gel Encasuplated Lipases:Robust Heterogeneous Biocatalysts.Adv.Synth.Catal.345,717–728.
[4]Bergogne,L.,Fennouh,S.,Guyon,S.,Roux,C.,Livage,J.2001.Sol-gelentrapment of enzymes.Materials Research Society Symposium Proceedings 628:(Organic/Inorganic Hybrid Materials)CC10.2.1-CC10.2.6.
[5]T.M.Butler,B.D.MacCraith,C.McDonagh,J.Non-Cryst.Solids 224(1998)249.
[6]Lobnik,I.Oehme,I.Murkovic,O.S.Wolfbeis,Anal.Chim.Acta 367(1998)159.
[7]G.E.Badini,K.T.V.Grattan,A.C.C.Tseung,Analyst 120(1995)1025.
[8]N.Aharonson,M.Altstein,G.Avidan,D.Avnir,A.Bronshtein,A.Lewis,K.Lieberman,M.Ottolenghi,Y.Polevaya,C.Rottman,J.Samuel,S.Shalom,A.Strinkovski,A.Turiansky,Mater.Res.Soc.Symp.Proc.346(1994)519.
[9]M.M.Collinson,Mikrochim.Acta 129(1998)149.
[10]U.Schubert,N.Hüsing,A.Lorenz,Chem.Mater.7(1995)2010.
[11]M.Plaschke,R.Czolk,J.Reichert,H.J.Ache.Thin Solid Films 279(1996)233.
[12]P.J.Skrdla,S.S.Saavedra,N.R.Armstrong.Appl.Spectrosc.53(1999)785.
[13]Muditha D.Senarath-Yapa,S.Scott Saavedra.Analytica ChimicaActa432(2001)89–94.
[14]T.Nguyen,K.P.McNamara,Z.Rosenzweig.Anal.Chim.Acta 400(1999)45.
[15]Johannes,T.,Simurdiak,M.,Zhao,H.Encyclopedia of ChemicalProcessing DOI:10.1081/E-ECHE-120017565Copyright.(2006)101-102.
[16]Alstein,M.,Bronshtein,A.,Glattshein,B.,Zeichner,A.,Tamiri,T.,Almog,J.Immunochemical Approaches for Purification and Detection of TNTtraces by Antibodies Entrapped in a Sol-Gel Matrix.Anal.Chem.(2001)73,2461-2467.
[17]Lowry,O.H.,Rosenbrough,N.J.,Farr,A.L.,Randall.R.J.Proteinmeasurement with the Foullin phenol reagent.J.Biol.Chem.(1951)193:265-275.
[18]Reetz,M.,Zonta,A.,Simpelkamp,J.Biotechnol.Bioeng.(1996)49,527-534.
[19]Barreira,G.,Ferreira,A.Vidinha,P.,Cabral,J.,Martinho,J.,Lima,J.,Cabrita,E.,Barreiros,S.Acessing Diffusion in Enzyme Sol-gel Matrices.RSCAdvances(2014)25099-25105.
[20]Mucin,Bovine Submaxillary Gland,Cat:4999643-500MG.
[21]Antibody produced by Glicoimunology Group,of Faculty of Scienceand Technology of Universidade NOVA de Lisboa and submitted to Portuguesepatent request N.°110526,“ANTIBODY,FUNCTIONAL FRAGMENT OR PROBE THEREOFAGAINST TUMOUR ANTIGENS”.