具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供了一种从发酵醪中提取蛋白质的方法，包括以下步骤：

(1)将所述发酵醪经酸预处理、水解、固液分离I，得到含有蛋白的固体和含有单糖的水解液；

(2)将所述含有蛋白的固体与酶解溶剂混合后进行酶解、固液分离II，得到含有多肽的酶解液，将所述含有多肽的酶解液进行干燥，得到含有多肽的粉末。

根据本发明，固液分离I和固液分离II分别可以采用过滤、离心等常规的固液分离的方式，固液分离I和固液分离II可以采用相同的方式也可以采用不同的方式；步骤(2)中的干燥可以采用冷冻干燥、微波干燥或真空加热干燥等任意一种浓缩干燥的方式。

根据本发明，所述发酵醪的获得方式不受特别的限制，例如可以是乙醇发酵除去乙醇后获得的发酵醪，也可以是维生素C发酵除去维生素C后获得的发酵醪。根据本发明一种优选的实施方式，步骤(1)中所述发酵醪的制备方法包括：将淀粉质原料、α-淀粉酶与液化溶剂混合进行液化后，再与糖化酶、氮源、乙醇发酵菌混合进行发酵得到发酵液，将所述发酵液中的乙醇分离后，得到所述发酵醪。

根据本发明，淀粉质原料可以是粮食原料，也可以是薯类原料，具体可以是玉米淀粉原料、小麦淀粉原料、大米淀粉原料等；所述液化溶剂和所述酶解溶剂分别可以采用水，具体可以为纯净水或者蒸馏水。

根据本发明，相对于干重为100g的所述淀粉质原料，所述α-淀粉酶的用量为0.01-0.05g，所述糖化酶的用量为0.01-0.05g，所述氮源的用量为0.05-0.3g，所述液化溶剂的用量为150-300g；所述乙醇发酵菌的接种量为1×10⁸-5×10⁸cfu/mL。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够有效提高乙醇的产量，并获得富含粗纤维、粗灰分、粗蛋白和少量淀粉的发酵醪。

根据本发明，所述氮源可以采用常规的氮源物质，优选情况下，氮源选自尿素、硫酸铵和硝酸铵中的一种或多种，以能够与糖化酶相配合，促进乙醇发酵菌的发酵速率，提高乙醇的产量。

根据本发明，所述乙醇发酵菌可以采用任意一种能够发酵产生乙醇的菌株，优选情况下，所述乙醇发酵菌选自酵母菌、运动发酵单胞菌、曲霉和根霉中的一种或多种。示例性地，酵母菌可以是酿酒酵母，曲霉可以是黑曲霉、米曲霉。

发明人在研究过程中发现，从发酵醪中提取蛋白质的方法的步骤(1)获得的富含单糖的酶解液，能够继续回配至本发明中所提供的发酵醪的制备过程中，或者回配至乙醇发酵过程中。具体地，将步骤(1)中所述含有单糖的水解液送入所述发酵醪的制备方法中与所述液化溶剂混合，即，将淀粉质原料与α-淀粉酶、液化溶剂、含有单糖的水解液混合后进行液化，再与糖化酶、氮源和乙醇发酵菌混合进行发酵得到发酵液，从发酵液中收集乙醇，也可进一步或者发酵醪。在该优选的实施方式下，能够有效节省淀粉质原料液化的用水成本，进而提高整个乙醇生产工艺的经济性。

根据本发明，将步骤(1)中所述含有单糖的水解液送入所述发酵醪的制备方法中与所述液化溶剂混合时，所述含有单糖的水解液与所述液化溶剂的混合比例可以在较宽的范围内调整，优选地，所述含有单糖的水解液与所述液化溶剂的体积比为1:1-9，具体可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。

根据本发明，所述液化的条件可以为本领域的常规选择，优选地，所述液化至少满足以下条件：pH为3.5-4.5、温度为75-95℃、时间为2-5h；

根据本发明，所述发酵的条件可以为本领域的常规选择，能够提供乙醇发酵菌生长所需的温度、时间等条件即可。优选地，所述发酵至少满足以下条件：温度为25-35℃、转速为120-180rpm、时间为60-85h。

根据本发明，步骤(1)中所述酸预处理的过程包括：将所述发酵醪与酸溶液混合得到的预处理液进行酸处理。所述酸溶液可以采用常规的酸性溶液，具体可以为含有盐酸、硫酸、硝酸等强酸的溶液，也可以为含有醋酸、柠檬酸等弱酸的溶液。优选为采用含有强酸的溶液与发酵醪混合进行酸处理，更有利于水解打破发酵醪中淀粉、纤维和蛋白之间相互结合的复杂结构，促进蛋白和单糖的释放。

根据本发明，所述酸溶液选自硫酸溶液、盐酸溶液和硝酸溶液中的一种或多种，所述预处理液中酸的浓度为0.5-3wt％，具体可以为0.5wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，对发酵醪的酸处理效果更优，有利于促进酶水解的效率。

根据本发明，所述酸处理的条件可以为本领域的常规选择，优选地，所述酸处理至少满足以下条件：温度为100-130℃，具体可以为100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；时间为30-90min，具体可以为30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。

根据本发明，步骤(1)中所述水解的的过程包括：步骤(1)中所述水解的的过程包括：将经所述酸处理后的预处理液与酶I混合后进行反应I；优选地，所述酶I选自糖化酶、纤维素酶和木聚糖酶中的一种或多种，所述酶I与所述经酸处理后的预处理液的质量比为0.05-1.4：100；发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高对酸预处理后的发酵醪进行酶水解的得率和效率。

根据本发明，所述反应I的条件可以为本领域的常规选择，优选地，所述反应I至少满足以下条件：pH为4-5.5、温度为45-55℃、转速为200-300rpm、时间为8-20h。

根据本发明，步骤(2)中所述含有蛋白的固体与所述酶解溶剂的质量比为1：1.5-4，以形成具有一定浓度的含有蛋白的混合液，进行酶解反应。

根据本发明，步骤(2)中所述酶解的过程包括：将所述含有蛋白的固体与酶解溶剂混合得到的混合液与酶II混合后进行反应II；优选地，所述酶II选自木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种，所述酶II与所述混合液的质量比为1-3：100。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高对混合液中的蛋白进行酶解生成多肽的反应得率和反应效率。

根据本发明，所述反应II的条件可以为本领域的常规选择，优选地，所述反应II至少满足以下条件：pH为9-11、温度为45-55℃、转速为200-300rpm、时间为8-20h。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，多肽粉末中多肽蛋白的含量通过凯氏定氮法(GB/T5009.5-2010)方法测得，乙醇浓度通过高效液相色谱法测得(分析条件为HPX-87H色谱柱、示差检测器、流动相为0.005M H₂SO₄，流速为0.6mL/min，柱温65℃，时间25min)；酿酒酵母购自安琪酵母股份有限公司，α-淀粉酶购自杰能科(中国)生物工程有限公司，糖化酶购自山东隆大生物工程有限公司，纤维素酶和木聚糖酶购自青岛蔚蓝生物股份有限公司，碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司，其他原料和试剂均为市售品。

实施例1

(1)将干重为1000g的玉米淀粉与一定量的水混合至干物浓度为30wt.％，加入0.12g的α-淀粉酶并调节pH至4.3-4.4，在温度为89℃的条件下进行液化3h，得到玉米液化液，将玉米液化液调节pH至3.8-4.0，加入0.325g糖化酶和1.2g尿素，并以接种量为2.5×10⁸cfu/mL的接种量接入酿酒酵母，在温度为30℃、转速为150rpm的条件下发酵72h得到发酵液，将发酵液中蒸馏去除乙醇得到发酵醪；

(2)取100g步骤(1)得到的发酵醪与浓硫酸溶液混合得到预处理液，使得预处理液中硫酸的质量浓度为2.0wt％，在灭菌锅中120℃的条件下反应60min，冷却后调节pH为5.0，添加糖化酶和纤维素酶(糖化酶、纤维素酶与预处理液的质量比为0.1：0.6：100)，在温度为50℃、转速为250rpm的条件下反应12h后，经固液分离I得到富含蛋白的固体和富含单糖的酶解液；

(3)将步骤(2)得到的富含蛋白的固体与纯水按质量比1:2.5进行混合得到混合液，调节pH为10，加入碱性蛋白酶(碱性蛋白酶与混合液的质量比为1.6：100)，在温度为50℃、转速为250rpm的条件下反应12h，经固液分离II得到含有多肽的酶解液，将得到含有多肽的酶解液冷却后，进行减压浓缩和冷冻干燥，得到多肽粉末；

(4)将步骤(2)得到的富含单糖的酶解液与水以体积比2:3进行混合作为液化溶剂，取干重为1000g的玉米淀粉与一定量的液化溶剂混合至干物浓度为30wt％，加入0.12g的α-淀粉酶，并调节pH至4.3-4.4，在温度为89℃的条件下进行液化3h，得到玉米液化液，将玉米液化液调节pH至3.8-4.0，加入0.325g糖化酶和1.2g尿素，并以接种量为2.5×10⁸cfu/mL的接种量接入酿酒酵母，在温度为30℃、转速为150rpm的条件下发酵72h得到发酵液，将发酵液经蒸馏获得乙醇产品。

实施例2

(1)将干重为1000g的玉米淀粉与一定量的水混合至干物浓度为25wt％，加入0.1g的α-淀粉酶并调节pH至3.8-4.0，在温度为75℃的条件下进行液化5h，得到玉米液化液，将玉米液化液调节pH至3.8-4.0，加入0.5g糖化酶和0.5g硫酸铵，并以接种量为1×10⁸cfu/mL的接种量接入酿酒酵母，在温度为35℃、转速为180rpm的条件下发酵60h得到发酵液，将发酵液中蒸馏去除乙醇得到发酵醪；

(2)取100g步骤(1)得到的发酵醪与浓盐酸溶液混合得到预处理液，使得预处理液中盐酸的质量浓度为0.5wt％，在灭菌锅中100℃的条件下反应90min，冷却后调节pH为5.5，添加糖化酶和木聚糖酶(糖化酶、木聚糖酶与预处理液的质量比为0.7：0.7：100)，在温度为45℃、转速为200rpm的条件下反应20h后，经固液分离I得到富含蛋白的固体和富含单糖的酶解液；

(3)将步骤(2)得到的富含蛋白的固体与纯水按质量比1:1.5进行混合得到混合液，调节pH为11，加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶与混合液的质量比为1.5：1.5：100)，在温度为55℃、转速为200rpm的条件下反应20h，经固液分离II得到含有多肽的酶解液，将得到含有多肽的酶解液冷却后，进行减压浓缩和冷冻干燥，得到多肽粉末；

(4)将步骤(2)得到的富含单糖的酶解液与水以体积比1:9进行混合作为液化溶剂，取干重为1000g的玉米淀粉与一定量的液化溶剂混合至干物浓度为25wt％，加入0.1g的α-淀粉酶，并调节pH至至3.8-4.0，在温度为75℃的条件下进行液化5h，得到玉米液化液，将玉米液化液调节pH至3.8-4.0，加入0.5g糖化酶和0.5g尿素，并以接种量为1×10⁸cfu/mL的接种量接入酿酒酵母，在温度为35℃、转速为180rpm的条件下发酵60h得到发酵液，将发酵液经蒸馏获得乙醇产品。

实施例3

(1)将干重为1000g的玉米淀粉与一定量的水混合至干物浓度为40wt％，加入0.5g的α-淀粉酶并调节pH至4.3-4.5，在温度为95℃的条件下进行液化2h，得到玉米液化液，将玉米液化液调节pH至4.3-4.5，加入0.1g糖化酶和3g硝酸铵，并以接种量为5×10⁸cfu/mL的接种量接入酿酒酵母，在温度为25℃、转速为120rpm的条件下发酵85h得到发酵液，将发酵液中蒸馏去除乙醇得到发酵醪；

(2)取100g步骤(1)得到的发酵醪与硫酸溶液混合得到预处理液，使得预处理液中硫酸的质量浓度为3wt％，在灭菌锅中130℃的条件下反应30min，冷却后调节pH为4，添加纤维素酶(纤维素酶与预处理液的质量比为0.05：100)，在温度为55℃、转速为300rpm的条件下反应8h后，经固液分离I得到富含蛋白的固体和富含单糖的酶解液；

(3)将步骤(2)得到的富含蛋白的固体与纯水按质量比1:4进行混合得到混合液，调节pH为9，加入酸性蛋白酶(酸性蛋白酶与混合液的质量比为1：100)，在温度为45℃、转速为300rpm的条件下反应8h，经固液分离II得到含有多肽的酶解液，将得到含有多肽的酶解液冷却后，进行减压浓缩和冷冻干燥，得到多肽粉末；

(4)将步骤(2)得到的富含单糖的酶解液与水以体积比1:1进行混合作为液化溶剂，取干重为1000g的玉米淀粉与一定量的液化溶剂混合至干物浓度为40wt％，加入0.5g的α-淀粉酶并调节pH至4.3-4.5，在温度为95℃的条件下进行液化2h，得到玉米液化液，将玉米液化液调节pH至4.3-4.5，加入0.1g糖化酶和3g尿素，并以接种量为5×10⁸cfu/mL的接种量接入酿酒酵母，在温度为25℃、转速为120rpm的条件下发酵85h得到发酵液，将发酵液经蒸馏获得乙醇产品。

实施例4

按照实施例3的方法进行蛋白提取，不同的是，步骤(2)中发酵醪与浓盐酸溶液混合后得到的预处理液中硫酸的质量浓度为5wt％。

实施例5

按照实施例3的方法进行蛋白提取，不同的是，步骤(2)中发酵醪与浓盐酸溶液混合后得到的预处理液在灭菌锅中80℃的条件下反应30min。

实施例6

按照实施例3的方法进行蛋白提取，不同的是，步骤(2)中利用金属蛋白酶代替纤维素酶。

实施例7

按照实施例3的方法进行蛋白提取，不同的是，步骤(2)中为：取100g步骤(1)得到的发酵醪与硫酸溶液混合得到预处理液，使得预处理液中硫酸的质量浓度为3wt％，在灭菌锅中130℃的条件下反应30min，冷却后调节pH为4，添加纤维素酶(纤维素酶与预处理液的质量比为0.05：100)，在温度为35℃、转速为120rpm的条件下反应10h后，经固液分离I得到富含蛋白的固体和富含单糖的酶解液。

对比例1

按照实施例3的方法进行蛋白提取，不同的是，步骤(2)为：取100g步骤(1)得到的发酵醪与适量的水混合后得到混合料A，将混合料A与纤维素酶混合(纤维素酶与合料A的质量比为0.05：100)，在温度为55℃、转速为300rpm的条件下反应8h后，经固液分离I得到富含蛋白的固体和富含单糖的酶解液。

对比例2

(1)将干重为1000g的玉米淀粉与一定量的水混合至干物浓度为40wt％，加入0.5g的α-淀粉酶并调节pH至4.3-4.5，在温度为95℃的条件下进行液化2h，得到玉米液化液，将玉米液化液调节pH至4.3-4.5，加入0.1g糖化酶和3g尿素，并以接种量为5×10⁸cfu/mL的接种量接入酿酒酵母，在温度为25℃、转速为120rpm的条件下发酵85h得到发酵液，将发酵液中蒸馏去除乙醇得到发酵醪；

(2)将步骤(1)得到的发酵醪与纯水按质量比1:4进行混合得到混合液，调节pH为9，加入酸性蛋白酶(酸性蛋白酶与混合液的质量比为2：100)，在温度为45℃、转速为300rpm的条件下反应8h，经固液分离II得到含有多肽的酶解液，将得到含有多肽的酶解液冷却后，进行减压浓缩和冷冻干燥，得到多肽粉末。

测试例

取实施例1-实施例7和对比例1-对比例2制得的多肽粉末，测定多肽粉末中的多肽含量，结果见表1；取实施例1-实施例7和对比例1的步骤(4)制得的发酵液，测定其中乙醇的浓度，即每升发酵液中乙醇的含量，结果见表1。测定实施例1中步骤(1)发酵液的乙醇浓度为123.36g/L。

表1

通过表1的结果可以看出，实施例1-实施例7采用本发明提供的方法从乙醇发酵醪中提取蛋白质，获得的多肽粉末中多肽的含量明显高于对比例1和对比例2获得的多肽粉末中多肽的含量；此外，通过实施例1-实施例7的步骤(4)获得的发酵液中乙醇浓度可以看出，将蛋白提取后获得的富含单糖的酶解液，回配至发酵醪的制备过程中的液化阶段，能够获得与常规的乙醇发酵的品质更优或者品质相近的乙醇产品，进而能够节省淀粉质原料液化用水的成本，提高整个乙醇工艺的经济性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。