背景技术

已开发的许多药物和化学物本身可能是安全的，但可能被代谢为毒素。因此，药物和化学物开发的一个关键方面是早在其进入人体测试阶段或进入消费者市场之前就通过建立化合物的安全性以确保不安全的化合物“快速失效”。每年大约有2,000种新化学物被商业化，快速确定化学物安全性的关键部分是评估人体从原本安全的母体化学物中产生的潜在有毒代谢物的影响。因此，捕获此类化学代谢物(或分解产物)并对其毒性进行筛查对于确保商业化学物(包括药物)的安全性至关重要。当前，可以快速评估体外代谢的工具有限。因此，长期目标是用多种人类异生物质代谢酶改进现有的毒物筛选测定平台。

磁性酶固定化涉及酶在介孔磁性簇中的捕获，所述介孔磁性簇在酶周围自组装。固定化效率取决于许多因素，包括酶和纳米颗粒的初始浓度、酶表面的性质、酶的静电势、纳米颗粒表面和接触时间。用于工业或医学制造的生物催化过程中的酶在过程之前和过程中应高效、稳定、可在几个生物催化循环中重复使用且经济。用于筛选和测试药物或化学物的酶应稳定、可靠、灵敏、经济并且与高通量自动化兼容。

P450催化的反应可以用于确定测试化合物的毒性。细胞色素P450(称为P450或CYP)属于E.C.1.14类酶。(Br.J.Pharmacol.158(Suppl 1):S215–S217(2009)，全文以引用的方式并入本文。)其构成单加氧酶的一个家族，涉及药物、异生物质、烷、萜和芳香族化合物的生物转化。它们还参与化学致癌物的代谢以及生理相关化合物(诸如类固醇、脂肪酸、类花生酸、脂溶性维生素和胆汁酸)的生物合成。此外，它们还参与环境中异生物质例如杀虫剂和其他工业有机污染物的降解。它们通过将一个羟基基团掺入许多代谢途径中发现的底物中来发挥作用。在该反应中，伴随着辅因子(如NAD(P)H)的氧化将双氧还原为一个羟基基团和一个H₂O分子。

单加氧酶是在所有生命系统中充当解毒生物催化剂并引发内源或外源毒性分子降解的关键酶。异生物质的I期代谢包括功能化反应，例如氧化、还原、水解、水合和脱卤。细胞色素P450单加氧酶代表参与75-80％的代谢的最重要的一类酶。其他的I期酶包括单胺氧化酶、含黄素的加氧酶、酰胺酶和酯酶。

II期代谢涉及I期代谢物上极性基团(例如葡萄糖醛酸，硫酸根和氨基酸)的缀合反应(葡萄糖醛酸化，硫酸化，GSH缀合，乙酰化，氨基酸缀合和甲基化)。

近年来，人们对P450生物催化剂的应用越来越感兴趣。通常，P450和大多数代谢氧化性酶都需要辅因子来转化其目标化合物。质子(H⁺)通常是通过CYP酶中的特定氨基酸从辅因子NADH或NADPH传递的。它们将质子中继到活性位点，在活性位点将氧分子还原性分裂，从而可以将单个原子添加到底物中。CYP酶从一系列不同的氧化还原伴侣酶接收电子，这些酶包括但不限于葡萄糖脱氢酶(GDH)和甲酸脱氢酶(FDH)。

GDH(E.C.1.1.1.47)催化β-D-葡萄糖氧化为β-D-1,5-内酯，同时将NADP+还原为NADPH或将NAD+还原为NADH。FDH(EC1.2.1.2)是指一组催化甲酸氧化为二氧化碳的酶。其将电子捐赠给第二底物，例如NAD+。这些酶，特别是来自真核生物来源的酶，属于在任何酶中具有最低的总转换数的酶。使用细胞色素P450的生物催化反应效率极低，因为底物氧化与副产物活性氧种类(ROS)(例如过氧化氢和超氧化物)的产生相关联。对于真核单加氧酶，大部分来自酶的活化的氧从靶标的氧化中转移出来并转化为ROS，其通过单电子还原的三元复合物的衰变从而产生超氧阴离子自由基(O-2)，而过氧细胞色素P450的质子化和氧的四电子还原从而产生H₂O₂。因此，真核P450酶损失了相当大的一部分(>30％)的消耗还原当量用于产生ROS。

与真核P450相比，细菌P450更有效，因为少于10％的总电子摄入被转移至ROS，从而在氧化途径中产生了更高的O₂效率和电子转化效率。必须在生物反应器中进行特殊设计，以将溶解氧的浓度控制在防止ROS积累而不降低反应速度的水平。

由于产生活性氧种类(ROS)而引起的氧化抑制是P450生物催化的主要限制之一。活性氧种类(ROS)是P450和其他氧化酶(包括NADPH氧化酶(NOX)，脂加氧酶(LOX)和环加氧酶(COX))的代谢反应的主要副产物。活性氧种类(ROS)包括高活性氧自由基[超氧化物(O2·-)，羟基(·OH)，过氧化基(RO2·)，烷氧基(RO·)]和非自由基，它们是氧化剂和/或容易转变为自由基。实例包括次氯酸(HOCl)，臭氧(O₃)，单线态氧(1O₂)和过氧化氢(H₂O₂)，其作为过氧化氢(H₂O₂)和如果反应在氧过量的情况下发生作为超氧离子(O₂-)。高水平的ROS不仅降低了转化反应的效率，而且由于氧化变性而抑制了反应。防止ROS在氧化反应中积聚的一种方法是使用ROS降解酶(例如过氧化氢酶或超氧化物歧化酶(SOD))清除关键中间体。它们在产生双氧的同时净化ROS，并回收可用于P450氧化循环的氧自由基。

本领域已知的在I、II、III期代谢中产生代谢物的其他代谢酶包括UDP-葡萄糖醛酸基转移酶，磺基转移酶，含黄素的单加氧酶，单胺氧化酶和羧酸酯酶。代谢酶的活性低，离体尤其不稳定。为了高产量和快速地生产用于筛选或生化生产的化学代谢物，P450的浓度历来很高(50％至200％的底物负载)。为了提高目标化合物的氧化速率，氧含量也需要很高，在过化学计量(over-stoichiometric)的浓度。这导致产生超氧化物阴离子，其使酶变性并使反应效率受到限制。

生命科学和制药市场中使用的大多数代谢过程系统都是基于体外培养的肝细胞(例如HepG，HepaRG)。基于细胞的平台的优势在于能够在单个集成平台中共同激活多个生物化学网络，这些网络由代谢酶(CYP，UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UGT)，羧酸酯酶等)的系统组成。具有如此高的生物复杂性的代谢加工增加了模拟肝脏生理的机会。不幸的是，基于体外细胞的系统易受代谢物积聚和细胞应激(由延长的氧化加工引起)所赋予的细胞毒性作用影响。与相应的无细胞的酶促系统相比，这导致了较短的孵育时间(1-2小时)和显著更低的酶促速率另外，细胞系统产生显著的背景代谢组，这使通过LC-MS分析鉴定底物衍生的代谢物变得复杂。

本领域需要用于测量化合物毒性的有效方法，从而以酶法筛选数千种化学物。需要在设备和方法中配置代谢酶以协助高通量毒性筛选。