根瘤菌klbmpgc32和大肠杆菌klbmppt020在减施氮磷肥中的应用
阅读说明：本技术 根瘤菌klbmpgc32和大肠杆菌klbmppt020在减施氮磷肥中的应用 (Application of rhizobium KLBMPGC32 and escherichia coli KLBMPPT020 in nitrogen and phosphorus fertilizer reduction ) 是由 李欠欠 吴洁 蒋继宏 王彦苏 于 2020-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了内生细菌Rhizobium sp.KLBMPGC32和Enterobacter sp.KLBMPPT020在减施氮磷肥中的应用。通过向种植百合的土壤中喷洒Rhizobium sp.KLBMPGC32和Enterobacter sp.KLBMPPT020的混合菌液,诱导土壤-百合的解磷固氮作用,从而为百合提供部分氮磷养分,减少肥料氮磷投入。本发明菌液通过固氮、溶磷等内生菌在土壤-植株中的作用,增加植物对氮磷养分的吸收,促进植物生长,提高氮磷利用潜力,减少肥料氮磷环境损失,可替代部分氮磷肥的施用。以Rhizobium sp.KLBMPGC32和Enterobacter sp.KLBMPPT020制备的菌液作为微生物肥料,无化学肥料残留,改善土壤微生态环境、土壤养分循环,提高植物产量和抗逆能力；制备过程简单,成本低,效果好,使用方便。(The invention provides application of endophytic bacteria Rhizobium sp.KLBMPGC32 and Enterobacter sp.KLBMPPTa020 in nitrogen and phosphorus fertilizer reduction. By spraying a mixed bacterial solution of Rhizobium sp.KLBMPGC32 and Enterobacter sp.KLBMPPTPCT020 into the soil for planting lily, the phosphorus and nitrogen dissolving and fixing effects of the soil-lily are induced, so that part of nitrogen and phosphorus nutrients are provided for the lily, and the nitrogen and phosphorus input of a fertilizer is reduced. The bacterial liquid of the invention increases the absorption of plants to nitrogen and phosphorus nutrients, promotes the growth of plants, improves the utilization potential of nitrogen and phosphorus, reduces the environmental loss of nitrogen and phosphorus of fertilizers and can replace the application of partial nitrogen and phosphorus fertilizers through the action of endophytes such as nitrogen fixation, phosphorus dissolution and the like in soil-plants. The bacterial liquid prepared from Rhizobium sp.KLBMPGC32 and Enterobacter sp.KLBMPPTa020 is used as the microbial fertilizer, no chemical fertilizer residue is left, the soil micro-ecological environment and the soil nutrient circulation are improved, and the plant yield and the stress resistance are improved; simple preparation process, low cost, good effect and convenient use.)
技术领域
本发明涉及生物肥料，尤其涉及植物内生细菌在植物减施氮磷肥中的应用。
背景技术
农业生产中，土壤中化肥的施入能有效补充作物生长过程中所需的矿质营养元素，尤其是氮磷作为植物必须的第一和第二大营养元素，通过化肥施入对作物的生长发育和产量起到了重要作用，但同时化肥不合理的施入，也导致了土壤-植物-环境的一系列生态环境问题，如氮肥的大量施入，导致土壤酸化、增加农业温室气体排放、影响空气质量和能见度、危害人体健康、降低物种的多样性、促进水体的富营养化等一系列环境问题；磷矿是不可再生资源，随着磷肥需求增大，有限的磷肥资源正在被快速耗竭，同时磷肥施入土壤后，极易被土壤固定，大大降低其对作物的有效性。以上一系列氮磷肥大量施入农业土壤中导致的问题，严重阻碍了农业的绿色可持续发展。
内生菌指其生活史的部分或全部阶段存在于植物组织内部的微生物，被侵染宿主植物不表现明显病症，这种内生性是植物与微生物间独特的成本-收益互作。内生菌可以通过分泌生长素、细胞分裂素、赤霉素等植物激素直接调节植物生长发育过程；同时，内生菌能通过固氮、溶磷等作用增加植物养分吸收，促进宿主植物的生长，提高植物抗逆性。挖掘植物内生菌的潜力，将其制备成微生物肥料来促进土壤良性循环，替代部分氮磷肥等的施用，减少肥料带来的环境损失风险，对于农业绿色可持续发展具有重要研究意义。
我国作为百合属植物原产大国，拥有极其丰富的种质资源，占全世界百合总数的一半以上。百合的鳞茎，味甘、微苦、性平，具有补益心肺、调理脾胃等功效，药用价值很高。由于百合的药食价值，人们对百合的需求日益增加，但目前我国百合生产依然存在许多问题，其中大量化肥的施用及连作障碍影响着百合品质和产量。
因此，本发明通过对解磷固氮内生菌液的制备，将其代替部分化肥施入百合土壤中，不仅提高百合的产量和氮磷利用率，还可以节约化肥资源，从而减轻氮磷化肥施入带来的生态环境问题。
发明内容
为了减少大量氮磷化肥投入对百合生长的影响和环境的损失风险，本发明提供了Rhizobium sp.KLBMPGC32和Enterobacter sp.KLBMPPT020两种内生菌的在解磷固氮中的应用，此构成本发明的第一个方面。
本发明还提供了Rhizobium sp.KLBMPGC32和Enterobacter sp.KLBMPPT020制备的菌液在减施氮磷肥方面的应用，通过向百合植株根部土壤中喷洒制备的两种内生菌液促进了土壤- 百合植株的解磷固氮效果，提高对百合产量和氮磷利用的潜力等方面，此构成本发明的第二个方面。
本发明的有益效果：以Rhizobium sp.KLBMPGC32和Enterobacter sp.KLBMPPT020制备的菌液代替部分氮磷化肥施入土壤，挖掘了土壤-植株氮磷利用潜力降低氮磷化肥对农业生态环境的损害风险；以Rhizobium sp.KLBMPGC32和Enterobacter sp.KLBMPPT020两种菌制备的菌液，制备过程简单，成本低，效果好，使用方便。
本发明的解磷菌Enterobacter sp.KLBMPPT020为半夏中分离得到，文献出处：张盼盼.邳半夏内生细菌多样性及其对邳半夏次生代谢产物积累的影响[D].江苏师范大学,2017.本发明的解磷菌Rhizobium sp.KLBMPGC32为大蒜中分离得到，从百合鳞茎内生细菌28株加上208株大蒜内生菌中筛选，使用JNFbN-free培养基、NBRIP培养基和蒙金娜有机磷培养基分离固氮解磷内生菌，并使用16S扩增子测序。对获得的固氮解磷内生菌进行鉴定，获得1株固氮菌 (Rhizobium sp.)。文献出处：李乐溪,李丹,张亮,王军娟,杨绪勤,蒋继宏.大蒜内生菌的分离及拮抗菌株的筛选与鉴定[J].江苏农业科学,2018,46(05):97-101.
这两中解磷固氮菌可从各地大蒜和半夏种植区的植株上通过常规方法分离筛选而获得，也可联系本申请人索取。申请人声明从本申请日起二十年内，公众可联系申请人索取该菌种。
附图说明
图1为本发明实施例1所述固氮菌Rhizobium sp.KLBMPGC32的16SrRNA基因系统发育树；
图2为本发明实施例1所述解磷菌Enterobacter sp.KLBMPPT020的16SrRNA基因系统发育树；
图3为本发明实施例1中Enterobacter sp.KLBMPPT020和Rhizobiumsp.KLBMPGC32两种菌共存/拮抗作用检测的照片；
图4为本发明实施例1中Enterobacter sp.KLBMPPT020和Rhizobiumsp.KLBMPGC32两种菌在JNFbN-free培养基上的固氮能力鉴定照片，其中左图为Rhizobiumsp.KLBMPGC32固氮菌，右图为Enterobacter sp.KLBMPPT020解磷菌；
图5为本发明实施例1中Enterobacter sp.KLBMPPT020和Rhizobiumsp.KLBMPGC32两种菌在PVK培养基上的解磷能力鉴定的照片，左边为Enterobactersp.KLBMPPT020，右边为 Rhizobium sp.KLBMPGC32；
图6为本发明实施例1中Enterobacter sp.KLBMPPT020和Rhizobiumsp.KLBMPGC32两种菌随时间变化的OD值趋势图；
图7为本发明实施例2中施加Enterobacter sp.KLBMPPT020和Rhizobiumsp.KLBMPGC32 菌液和未施加菌液在不同氮磷肥料处理下的百合磷茎收获照片；
图8为本发明实施例2中经SPSS统计分析后的百合鳞茎鲜重柱状图；
图9为本发明实施例2中经SPSS统计分析后的百合植株吸氮量柱状图；
图10为本发明实施例2中经SPSS统计分析后的百合植株吸磷量柱状图；
图11为本发明实施例2中经SPSS统计分析后的氮肥利用率柱状图；
图12为本发明实施例2中经SPSS统计分析后的磷肥利用率柱状图；
具体实施方式
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实施例1：Rhizobium sp.KLBMPGC32和Enterobacter sp.KLBMPPT020两种菌的筛选/鉴定及混合菌液制备
选用健康百合常规方法筛选得到百合鳞茎内生细菌28株，加上实验室保藏的208株大蒜内生菌，使用JNFbN-free培养基、NBRIP培养基和蒙金娜有机磷培养基分离固氮解磷内生菌。并对获得的固氮解磷内生菌进行鉴定，获得1株固氮菌Rhizobium sp.KLBMPGC32。选用从半夏中分离出来解磷效果出众的实验室保藏解磷菌Enterobacter sp.KLBMPPT020。用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R： 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'进行16S rDNNA基因PCR扩增。PCR反应体系为： 10×buffer Mix(包含Taq酶)12.5μL，10μmol/L27F 0.5μL，10μmol/L 1492R 0.5μL，ddH2O 10.5μL，模板DNA 1μL，PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海生工有限公司测序。系统发育树的构建，送到生工测序之后获得菌株16s序列，然后通过NCBI 网站进行BLAST序列比对，获得相似度大于90％的序列，然后使用MEGA软件构建NJ (Neighbor-Joining)系统发育树。固氮菌Rhizobiumsp.KLBMPGC32的16S扩增子测序得到系统发育树如图1所示，解磷菌Enterobactersp.KLBMPPT020的16S扩增子测序得到系统发育树如图2所示。其中NBRIP培养基为无菌溶液，主要由葡萄糖、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、磷酸钙等组成，经无菌处理，该试剂不含ACC(又称1-氨基羰酰-1-环丙烷羧酸)；蒙金娜有机磷培养基如下：葡萄糖10克，硫酸铵0.5克，氯化钠0.3克，酵母浸粉0.5克，氯化钾0.3克，硫酸镁0.3克，硫酸亚铁0.03克，硫酸锰0.03克，卵磷脂0.2克，碳酸钙1 克，琼脂15克，PH7.0-7.5。
用十字划线法进行Rhizobium sp.KLBMPGC32和Enterobacter sp.KLBMPPT020两种菌之间拮抗作用检测，用LB固体平板培养基活化两种菌株，运用平板划线法置于培养箱中，置于28℃培养箱中，培养7天，并定期观察细菌交叉点的细菌生长情况如图3所示，两种菌交界处无明显抑制现象，说明这两种菌无拮抗作用，可共存。
用无氮培养基对Enterobacter sp.KLBMPPT020和Rhizobium sp.KLBMPGC32固氮能力鉴定如图4所示，将两种菌分别在固氮培养基上28℃培养箱中生长7天并进行转接，进行转接五次以上都能生长，表明Enterobacter sp.KLPBMPPT020和Rhizobium sp.KLBMPGC32这两种菌都具有固氮能力。其中无氮培养基制备(JNFbN-free)如下： K2HPO4 0.5克，CaCO3 1.0克，MgSO4·7H2O 0.2克，蔗糖10.0克，KCl 0.2克，PH 7.0-7.5，琼脂20.0克，1000毫升蒸馏水。
用PVK培养基对Enterobacter sp.KLBMPPT020和Rhizobium sp.KLBMPGC32解磷能力鉴定如图5所示，将两种菌分别接种在PVK固体培养基左右两侧，28℃培养箱中培养7天，Enterobacter sp.KLPBMPPT020菌周围有非常明显的透明圈，说明有很强的解磷能力，解磷能力PVC约为5左右。而Rhizobium sp.KLBMPGC32附近没有透明圈，说明其不具备解磷能力。其中PVK培养基如下：葡萄糖10克,磷酸钙5克,硫酸铵0.5克,氯化钠0.2克,七水硫酸镁1克,酵母提取物0.5克，一水合硫酸锰0.002 克，七水合硫酸亚铁0.002克,琼脂20克,溴酚蓝6毫升,PH 7-7.2，1000毫升蒸馏水。
将两菌株分别按2％的接种量接入相应的液体培养基中，28℃，160r/min，培养40小时，在培养第4、8、12、16、20、24、28、32、36、40时进行取样,每次取样10毫升,每瓶菌液连续取样4次,重复3次。在722s可见分光光度计上测定菌液在适宜波长下的吸光值,并以时间为横坐标,菌体的浓度为纵坐标,绘制菌体生长曲线如图6所示。从摇菌开始后，两种菌在第8小时左右的时候，菌浓度的增长率最高，为指数期，此时进行实验可以达到较好的效果，以此确定功能菌株组合时候的接种时间。
实施例2：Rhizobium sp.KLBMPGC32和Enterobacter sp.KLBMPPT020混合菌液对土壤-百合植株的解磷固氮效果
应用具有解磷固氮潜力的内生细菌Rhizobium sp.KLBMPGC32和Enterobactersp. KLBMPPT020制备成复合内生菌液，通过盆栽试验验证所制备的菌液是否有增效减排的作用。供试植物为卷丹百合，土壤为典型潮土，试验前土壤理化性质见表1。
表1供试土壤理化性质
采用直径和高均为30cm的PVC土柱圆盆种植百合，试验共7个处理，4个重复，按照3×2因子进行设计，三个不同氮磷水平和内生菌共生组、非共生组：无氮磷肥对照组(无 B无NP)、无氮磷肥+内生菌液(B无NP)、氮磷肥对照组(无B正常NP)、减20％氮磷肥对照组(无B减20％NP)、减20％氮磷肥+内生菌液(B减20％NP)、减40％氮磷肥对照组 (无B减40％NP)、减40％氮磷肥+内生菌液(B减40％NP)，具体试验处理见表2。
表2百合施菌施肥处理
不同施肥处理下(无B无NP；B无NP；无B正常NP；无B减20％NP；B减20％NP；无B减40％NP；B减40％NP)的百合鳞茎收获拍照记录(如图7)所示，同样盆栽自然环境及等量氮磷肥施用下，没有加内生菌液的百合鳞茎收获大小不均和缺失，推算可能受水淹/降雨等环境或病害等胁迫影响，而加菌很可能有抑制有害病原菌入侵/增强百合对外部环境变化的适应能力。经SPASS统计分析(Tukey,p<0.01)百合鳞茎收获鲜重的结果显示(图 8)，加内生菌液(B)有增加百合鳞茎鲜重的趋势，尤其是在减40％NP施肥处理对比下，加B显著增加鳞茎鲜重。此外，添加内生菌液(B)有提高植株氮磷吸收量的潜力(图9， 10)；其中在无NP肥施用下，加B显著增加植株吸氮量，也有提高百合植株吸磷量的潜力，说明B提高了土壤-植株的固氮和解磷能力。相较其他处理，减40％NP加内生菌液的施肥处理能稳产/提高产量的同时，显著增加NP肥的利用率(图11，图12；氮肥利用率NUE％＝ (施肥区N吸收-无肥无B区N吸收)/N肥施用量*100％，磷肥利用率PUE％＝(施肥区P 吸收-无肥无B区P吸收)/P肥施用量*100％)。值得注意的是，各施肥处理下的氮肥利用率(9～27％)和磷肥利用率(9-32％)普遍偏低，因受2020年夏天高温下，降雨频繁，降雨量较往年更大，一方面可导致氮磷肥淋洗等损失量大，另一方面造成百合地下部淹水，不利于生长及营养物质向地下鳞茎的转移，从而提早进行百合收获有关。
通过氮素表观平衡监测的计算(表3；氮输入＝初始土壤氮+施氮量+氮表观矿化，氮输出＝作物吸氮量，氮盈余＝氮输入-氮输出，表观氮损失＝氮盈余-土壤残留氮)的结果显示，在同样无NP肥施入条件下，添加内生菌肥(B)比不加B能提高百合吸氮量，其表观氮损失为-100mg/pot，说明B可能增强了土壤-百合植物的固氮能力，约为4mg N/kg soil；各处理之间的氮残留无显著差异，说明施肥区施用的氮肥除少数被植株吸收外，大部分氮通过淋洗或气态损失到环境中去了；在加B减20％NP和加B减40％NP肥中，与正常NP/等量减NP施入相比，加B均有提高N利用的趋势；此外，在等量施N下，加B后均减少表观氮损失2mg N/kgsoil，说明B能部分替代氮肥，有节肥和减少氮环境损失风险的潜力；在进一步减40％NP肥的处理下，加B能显著提高百合鳞茎产量和吸NP量，表明B在养分匮乏的土壤条件下，能更大发挥其解磷固氮的能力。
表3氮素表观平衡计算(单位：mg/pot)
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