具体实施方式

鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例的一个方面提供了一种荧光/MRI双模探针的制备方法，其包括：

在保护性气氛下，使包含所述荧光物质烯烃、含烯基的钆离子(Gd)络合物、交联剂、链转移剂、引发剂和第一溶剂的第一混合反应体系发生可逆加成-断裂链转移聚合反应，获得荧光/MRI双模探针。

在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：在保护性气氛下，使包含所述荧光物质烯烃、含烯基的钆离子络合物、交联剂、链转移剂、引发剂和第一溶剂的第一混合反应体系于60～80℃发生可逆加成-断裂链转移聚合反应24～72h，再经后处理，获得所述荧光/MRI双模探针。

在一些较为具体的实施方案中，所述荧光物质烯烃包括荧光素烯烃、N,N四甲基罗丹明烯烃、罗丹明b烯烃中的任意一种，且不限于此。

进一步的，所述含烯基的钆离子络合物具有如式(I)所示的结构：

进一步的，所述交联剂包括N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，且不限于此。

进一步的，所述交联剂可以是单取代双烯类化合物。

进一步的，所述链转移剂包括一硫酯(CTA)、二硫酯、三硫代碳酸酯、三硫代碳酸酯衍生物中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。

进一步的，所述引发剂包括偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈中的任意一种，且不限于此。

进一步的，所述第一溶剂包括甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。

进一步的，所述荧光物质烯烃、含烯基的钆离子络合物、交联剂、链转移剂与引发剂的摩尔比为10～100:100～150:30～50:10～20:1.5～3。

进一步的，所述后处理包括：在所述聚合反应完成后，对所述第一混合反应体系进行冷却、沉淀、离心、洗涤、干燥处理。

在一些较为具体的实施方案中，所述荧光物质烯烃的制备方法包括：

将荧光物质、三乙胺与第二溶剂混合形成混合溶液，同时将丙烯酰氯溶于第二溶剂形成丙烯酰氯溶液，之后于冰浴条件下，将所述丙烯酰氯溶液加入所获混合溶液形成第二混合反应体系，再于室温下反应4～12h，获得所述荧光物质烯烃。

进一步的，所述荧光物质包括荧光素，且不限于此。

进一步的，所述第二溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷中的任意一种，且不限于此。

进一步的，所述荧光物质、三乙胺与丙烯酰氯的摩尔比为1～1.5:1.5～3:1.2～2。

在一些较为具体的实施方案中，所述荧光物质烯烃的制备方法包括：使包含荧光物质、二氯亚砜与第三溶剂的第三混合反应体系于90～100℃反应4～10h，之后将所获产物与甲基丙烯酸羟乙酯于室温下反应24～48h，获得所述荧光物质烯烃；

进一步的，所述荧光物质包括N,N四甲基罗丹明、罗丹明b中的任意一种，且不限于此。

进一步的，所述第三溶剂包括二氯乙烷，且不限于此。

进一步的，所述荧光物质、二氯亚砜与甲基丙烯酸羟乙酯的摩尔比为1～3：6～20：4～15。

在一些较为具体的实施方案中，所述含烯基的钆离子络合物制备方法包括：使包含络合剂、钆离子和第四溶剂的第四混合反应体系于20～25℃发生络合反应12～72h，获得含烯基的钆离子络合物，其中，所述第四混合反应体系的pH值为5～6。

进一步的，所述络合剂为含烯基的二乙烯三胺五乙酸和/或具有如式(Ⅱ)所示结构的化合物：

进一步的，所述络合剂为具有如式(Ⅱ)所示的结构。

进一步的，所述钆离子来源于钆盐，且不限于此。

进一步的，所述钆盐包括氯化钆、水合硝酸钆、硫酸钆、醋酸钆六水合物、水合草酸钆中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。

进一步的，所述络合剂与钆离子的摩尔比为1～1.5:2～3。

进一步的，所述第四溶剂包括超纯水，且不限于此。

在一些较为具体的实施方案中，所述络合剂的制备方法包括：

使包含络合剂前驱体(DO3AtBu)、溴乙酸甲酯和/或溴乙酸、无机碱和第五溶剂的第五混合反应体系于20～30℃反应12～36h，获得第一中间产物；

使所述第一中间产物与丙二胺于20～30℃反应12～36h h，获得第二中间产物；

以及，使包含所述第二中间产物、三乙胺、丙烯酰氯和第六溶剂的第六混合反应体系于0～30℃反应4～24h，之后使所获产物与脱保护试剂于20℃～30℃进行脱保护反应20～50h，获得所述络合剂，其中，所述络合剂具有式(Ⅱ)所示的结构，所述第一中间产物具有如式(Ⅲ)所示的结构，所述第二中间产物具有如式(Ⅳ)所示的结构：

进一步的，所述络合剂前驱体(DO3AtBu)具有如式(Ⅴ)所示的结构：

进一步的，所述络合剂前驱体包括1,4,7-三(叔丁氧碳酰甲基)-1,4,7,10-氮杂环十四烷中的任意一种或两种的组合，且不限于此。

进一步的，所述无机碱包括碳酸钠、碳酸钾中的任意一种或两种的组合，且不限于此。

进一步的，所述络合剂前驱体、溴乙酸甲酯和/或溴乙酸与无机碱的摩尔比为1～1.2:1.5～2:3～5。

进一步的，所述第五溶剂包括乙腈，且不限于此。

进一步的，所述第一中间产物与丙二胺的摩尔比为1～1.5:30～50。

进一步的，所述第二中间产物、三乙胺与丙烯酰氯的摩尔比为1～1.5:2～3:1.5～3。

进一步的，所述脱保护试剂包括三氟乙酸、甲酸、浓盐酸与乙酸乙酯的混合液中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。

进一步的，所述第六溶剂包括二氯甲烷，且不限于此。

本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的荧光/MRI双模探针。

进一步的，所述荧光/MRI双模探针的分子量为7000～20000Da。

进一步的，所述荧光/MRI双模探针具有如式(Ⅵ)所示的结构：

其中，m为8～30，n为40～70，q为6～15。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的荧光/MRI双模探针于荧光成像、磁共振成像或荧光与磁共振同时成像中的用途。

下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。

实施例1

(1)荧光物质烯烃(荧光素烯烃)的制备：称取荧光素2g，溶于10ml色谱纯二氯甲烷于100ml圆底烧瓶中，再称取三乙胺1.3g加入上述烧瓶中，称取丙烯酰氯0.84g溶于10ml二氯甲烷中，在冰浴下缓慢滴入上述烧瓶中，滴入完毕过夜反应，在纯二氯甲烷极性下过柱子得到荧光素烯烃；(荧光素烯烃的核磁谱图如图1所示)

(2)钆离子络合物的制备(制备DO3AAMGd反应流程如图2所示)：

将DO3AtBu(2.06g，4mmol)溶于30ml乙腈，将溶于20ml乙腈的溴乙酸甲酯(0.76g，4.8mmol)缓慢滴入其中，最后加入碳酸钾(2.76g，20mmol)，其中：DO3AtBu:溴乙酸甲酯:碳酸钾的摩尔比为1:1.2:5，然后于25℃搅拌20h，反应完成后减压除溶剂，加入甲苯溶解剩余的产物，有机相用水洗涤三次，然后用无水NaSO₄干燥，减压除去溶剂，得到黄色产物DO3AtBu-OMe；(DO3AtBu-OMe的核磁谱图如图3所示)

将DO3AtBu-OMe(2.35g，4mmol)加入丙二胺(8.89g，30mmol)，室温下25℃搅拌18h，反应完成后多余的丙二胺通过旋蒸除去，然后通过硅胶色谱柱纯化产物(洗脱剂为CH₂Cl₂与CH₃OH的体积比为10:0～1)，得到DO3AtBu-NH₂；(DO3AtBu-NH₂的核磁谱图如图4所示)

将DO3AtBu-NH₂(0.23g)溶于5ml无水的CH₂Cl₂，加入三乙胺0.0555g，将溶于CH₂Cl₂的0.0397g丙烯酰氯缓慢滴入冰浴的反应体系中，滴加完成后反应体系在室温搅拌10h,反应完成后通过硅胶色谱柱纯化产物(洗脱剂为CH₂Cl₂与CH₃OH的体积比为10:0～1)，洗脱液用饱和NH₄Cl溶液洗两次，用无水NaSO₄干燥，过滤后旋蒸除溶剂，得到DO3AtBu-AM；(DO3AtBu-AM的核磁谱图如图5所示)

向DO3AtBu-AM中加2ml三氟乙酸，三氟乙酸加入量以原料溶解为宜，再加入少量CH₂Cl₂，室温搅拌20h，反应后旋蒸溶剂后加乙醚沉淀，有白色粉末产物产生，过滤后真空干燥，制得DO3A-AM；

将DO3A-AM溶于15ml超纯水，用0.45μm的滤头过滤后，先调节pH约等于5，加入0.25mol/L得到GdCl₃的溶液，维持pH为5-6，络合搅拌反应16h，过滤后用500Da透析袋透析，制得含烯基的钆离子络合物(DO3AAMGd)；

(3)聚合制备双模探针：

取上述制备的荧光素烯烃(0.85mg)、DO3AAMGd(1.47mg)、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(0.1mg)、三硫代碳酸酯(0.11mg)，AIBN(0.0054mg)，将其分别用乙醇溶解后，加入磨口玻璃管，氮气鼓泡30min，用橡皮塞封管后70℃油浴反应30h，反应结束后先用水冷却后放入-20℃，10min后打开瓶子与空气接触，产物在搅拌下缓慢滴入冷乙醚中，然后离心，离心后加入1ml的THF溶解产物，再加入乙醚沉淀，溶解沉淀的过程重复三遍，放入真空干燥箱中干燥至恒重，制得荧光/MRI双模探针(红外图如图6所示)。本实施例制备的荧光/MRI双模探针可很好的溶于水，荧光/MRI双模探针浓度为10mM的水溶液可长期稳定存在。本实施例制备的荧光/MRI双模探针水溶性良好，既解决了荧光小分子水溶性差的问题，又将荧光和磁共振的双模态成像集中于一体，扩大了其生物应用范围。

为验证双模探针可以成功制备，本案发明人将上述步骤(3)中的DO3AAMGd替换为DO3A-AM，其余同上述步骤，制得的聚合物的核磁图谱如图7所示，证明聚合物被成功制得。

实施例2

(1)罗丹明b烯烃的制备：称取1.05g罗丹明b，溶于15ml二氯乙烷中，常温下逐滴滴加0.9ml二氯亚砜，然后加热到90℃回流10h，旋蒸除溶剂，将所得固体溶于二氯甲烷中，加入1ml甲基丙烯酸羟乙酯，室温搅拌48h，通过柱色谱分离产物，洗脱剂的比例为CH₂Cl₂至CH₂Cl₂:CH₃OH＝100:5，分离得到产物罗丹明b烯烃；

(2)钆离子络合物的制备(制备DO3AAMGd反应流程如图2所示)：

将DO3AtBu溶于乙腈，将溶于乙腈的溴乙酸缓慢滴入其中，最后加入碳酸钠，其中：DO3AtBu:溴乙酸:碳酸钠的摩尔比为1:1.5:3，然后于20℃搅拌36h，反应完成后减压除溶剂，加入甲苯溶解剩余的产物，有机相用水洗涤三次，然后用无水NaSO₄干燥，减压除去溶剂，得到黄色产物DO3AtBu-OMe；

将DO3AtBu-OMe加入丙二胺，20℃搅拌36h，反应完成后多余的丙二胺通过旋蒸除去，然后通过硅胶色谱柱纯化产物(洗脱剂为CH₂Cl₂与CH₃OH的体积比为10:0～1)，得到DO3AtBu-NH₂；

将DO3AtBu-NH₂溶于无水的CH₂Cl₂，加入三乙胺，将溶于CH₂Cl₂丙烯酰氯缓慢滴入冰浴的反应体系中，滴加完成后反应体系在0℃反应24h，反应完成后通过硅胶色谱柱纯化产物(洗脱剂为CH₂Cl₂与CH₃OH的体积比为10:0～1)，洗脱液用饱和NH₄Cl溶液洗两次，用无水NaSO₄干燥，过滤后旋蒸除溶剂，得到DO3AtBu-AM；

向DO3AtBu-AM中加甲酸，甲酸加入量以原料溶解为宜，再加入少量CH₂Cl₂，20℃进行脱保护反应50h，反应后旋蒸溶剂后加乙醚沉淀，有白色粉末产物产生，过滤后真空干燥，制得DO3A-AM；

将DO3A-AM溶于15ml超纯水，用0.45μm的滤头过滤后，先调节pH约等于5，加入0.25mol/L得到GdCl₃的溶液，维持pH为5-6，20℃发生络合反应72h，过滤后用500Da透析袋透析，制得含烯基的钆离子络合物(DO3AAMGd)；

(3)聚合制备双模探针：

取上述制备的罗丹明b烯烃、DO3AAMGd、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、CTA、AIBN，将其分别用乙醇溶解后，加入磨口玻璃管，氮气鼓泡30min，用橡皮塞封管后60℃油浴反应72h，反应结束后先用水冷却后放入-20℃，10min后打开瓶子与空气接触，产物在搅拌下缓慢滴入冷乙醚中，然后离心，离心后加入1ml的THF溶解产物，再加入乙醚沉淀，溶解沉淀的过程重复三遍，放入真空干燥箱中干燥至恒重，制得荧光/MRI双模探针。

实施例3

(1)N,N四甲基罗丹明烯烃的制备：称取N,N四甲基罗丹明0.847g，溶于10ml二氯乙烷中，常温下逐滴滴加0.9ml二氯亚砜，然后加热到100℃回流4h，旋蒸除溶剂，将所得固体溶于二氯甲烷中，加入1ml甲基丙烯酸羟乙酯室温搅拌24h，通过柱色谱分离产物，洗脱剂的比例为CH₂Cl₂至CH₂Cl₂:CH₃OH＝100:5，分离得到产物N,N四甲基罗丹明烯烃；

(2)钆离子络合物的制备(制备DO3AAMGd反应流程如图2所示)：

将DO3AtBu溶于乙腈，将溶于乙腈的溴乙酸缓慢滴入其中，最后加入碳酸钠，其中：DO3AtBu:溴乙酸:碳酸钠的摩尔比为1:1.3:4，然后于30℃搅拌36h，反应完成后减压除溶剂，加入甲苯溶解剩余的产物，有机相用水洗涤三次，然后用无水NaSO₄干燥，减压除去溶剂，得到黄色产物DO3AtBu-OMe；

将DO3AtBu-OMe加入丙二胺，30℃搅拌12h，反应完成后多余的丙二胺通过旋蒸除去，然后通过硅胶色谱柱纯化产物(洗脱剂为CH₂Cl₂与CH₃OH的体积比为10:0～1)，得到DO3AtBu-NH₂；

将DO3AtBu-NH₂溶于无水的CH₂Cl₂，加入三乙胺，将溶于CH₂Cl₂丙烯酰氯缓慢滴入冰浴的反应体系中，滴加完成后反应体系在30℃反应4h，反应完成后通过硅胶色谱柱纯化产物(洗脱剂为CH₂Cl₂与CH₃OH的体积比为10:0～1)，洗脱液用饱和NH₄Cl溶液洗两次，用无水NaSO₄干燥，过滤后旋蒸除溶剂，得到DO3AtBu-AM；

向DO3AtBu-AM中加甲酸，甲酸加入量以原料溶解为宜，再加入少量CH₂Cl₂，30℃进行脱保护反应20h，反应后旋蒸溶剂后加乙醚沉淀，有白色粉末产物产生，过滤后真空干燥，制得DO3A-AM；

将DO3A-AM溶于15ml超纯水，用0.45μm的滤头过滤后，先调节pH约等于5，加入0.25mol/L得到水合硝酸钆的溶液，维持pH为5-6，25℃发生络合反应12h，过滤后用500Da透析袋透析，制得含烯基的钆离子络合物(DO3AAMGd)；

(3)聚合制备双模探针：

取上述制备的N,N四甲基罗丹明烯烃、DO3AAMGd、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、二硫酯、AIBN，将其分别用乙醇溶解后，加入磨口玻璃管，氮气鼓泡30min，用橡皮塞封管后80℃油浴反应24h，反应结束后先用水冷却后放入-20℃，10min后打开瓶子与空气接触，产物在搅拌下缓慢滴入冷乙醚中，然后离心，离心后加入1ml的THF溶解产物，再加入乙醚沉淀，溶解沉淀的过程重复三遍，放入真空干燥箱中干燥至恒重，制得荧光/MRI双模探针。

实施例4

(1)荧光物质烯烃(荧光素烯烃)的制备：称取荧光素2g，溶于10ml色谱纯二氯甲烷于100ml圆底烧瓶中，再称取三乙胺1.3g加入上述烧瓶中，称取丙烯酰氯0.84g溶于10ml二氯甲烷中，在冰浴下缓慢滴入上述烧瓶中，滴入完毕过夜反应，在纯二氯甲烷极性下过柱子得到荧光素烯烃；

(2)将含烯基的二乙烯三胺五乙酸溶于超纯水，用0.45μm的滤头过滤后，先调节pH约等于5，加入0.25mol/L得到水合草酸钆的溶液，维持pH为5-6，25℃发生络合反应12h，过滤后用500Da透析袋透析，制得含烯基的钆离子络合物；

(3)取上述制备的荧光素烯烃、含烯基的钆离子络合物、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、三硫代碳酸酯、AIBN，将其分别用乙醇溶解后，加入磨口玻璃管，氮气鼓泡30min，用橡皮塞封管后70℃油浴反应36h，反应结束后先用水冷却后放入-20℃，10min后打开瓶子与空气接触，产物在搅拌下缓慢滴入冷乙醚中，然后离心，离心后加入1ml的THF溶解产物，再加入乙醚沉淀，溶解沉淀的过程重复三遍，放入真空干燥箱中干燥至恒重，制得荧光/MRI双模探针。

实施例5

将实施例1中制备的荧光/MRI双模探针溶于PBS中，浓度为10mM，用1640的培养基分别稀释至0.1mM，0.5mM，1mM，孵育L929细胞24h，将培养基吸掉，用PBS洗六次，加入1ml胰蛋白酶消化细胞30s，将细胞收集离心，5000r，3min，离心后去上清，加入4mlPBS将细胞吹打均匀，再次离心，离心后去上清，将细胞沉淀转移到1.5mm玻璃管中，1500r，5min离心后将细胞沉淀上面的水去掉，进行磁共振成像，结果如图8所示；

将实施例1中制备的荧光/MRI双模探针溶于PBS中，浓度为10mM，用1640的培养基稀释至0.1mM，孵育L929细胞4h，将培养基吸掉，用PBS洗六次，加入1mlPBS，用激光共聚焦进行细胞成像，结果如图9所示。

此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。

本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。

在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。

在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。

应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。

尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。