一种含铜络合物的制备方法
阅读说明：本技术 一种含铜络合物的制备方法 (Preparation method of copper-containing complex ) 是由 邹国栋 郑红云 凌天阳 于 2020-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明通过将胶原蛋白水解产物与氢氧化铜反应得到一种含铜络合物,制备步骤如下：以氢氧化钠水溶液溶解明胶,滤布滤去不溶物；用盐酸调节pH,加碱性蛋白酶反应；将胶液升温反应；用盐酸调至pH,加中性蛋白酶反应；用盐酸将胶液调至pH,加入酸性蛋白酶反应；用氢氧化钠将胶液调至pH,加入氢氧化铜,搅拌后用滤布除去不溶物；加无水乙醇,搅拌后用滤布除去不溶物；继续加入无水乙醇,搅拌后用滤布过滤收集不溶物,用乙醇冲洗后真空干燥；将干燥产物溶于水,减压旋干得到产品。这种络合物具有和GHK-Cu类似的生理活性,且制造成本更低,可应用于多种皮肤和毛发护理产品中。(The invention obtains a copper-containing complex by reacting collagen hydrolysate with copper hydroxide, and the preparation steps are as follows: dissolving gelatin with sodium hydroxide water solution, filtering insoluble substances with filter cloth; adjusting pH with hydrochloric acid, and adding alkaline protease for reaction; heating the glue solution for reaction; adjusting pH with hydrochloric acid, and adding neutral protease for reaction; adjusting the pH value of the glue solution to be hydrochloric acid, and adding acid protease for reaction; adjusting the pH value of the glue solution to be the same with sodium hydroxide, adding copper hydroxide, stirring, and removing insoluble substances by using filter cloth; adding anhydrous ethanol, stirring, and removing insoluble substances with filter cloth; adding anhydrous ethanol, stirring, filtering with filter cloth, collecting insoluble substance, washing with ethanol, and vacuum drying; dissolving the dried product in water, and carrying out rotary drying under reduced pressure to obtain the product. The complex has similar physiological activity with GHK-Cu, has lower manufacturing cost, and can be applied to various skin and hair care products.)
技术领域
本发明属于生物材料领域，涉及一种含铜络合物的制备方法。
背景技术
铜是人体所必需的微量元素，铜是许多酶的辅助因子，也是合成胶原蛋白和弹性蛋白的必要条件，它可以起到紧致皮肤、抵抗自由基的伤害，甚至协同维生素E起到修复作用。游离态的铜离子很难通过外涂进入皮肤内部起效，人们主要通过将铜与生物质分子复合共同发挥作用。如GHK-Cu就是一种铜与三肽的络合产物，实验发现通过铜与胜肽结合，可以发挥刺激胶原蛋白与弹力蛋白形成，增加皮肤细胞间黏质产生，辅助抗氧化酵素SOD，扩大毛囊加速毛发生长等诸多作用。
目前主要通过人工合成的方法制备GHK-Cu，现有的方法成本较高，限制了其在美容产品中的应用。有实验表明，GHK-Cu主要通过诱导成纤维细胞生成基质金属酶(MMPs)实现上述的多种功能，而使用其他材料作为铜离子载体也能实现相似的效果。
本发明提供了一种利用胶原蛋白水解生成小分子肽，进而与铜离子络合的方法，该方法以相对较低的成本生产分子量在500-2000的小分子肽，这个分子量区间的小分子肽生物利用率高，可替代现有的合成小肽作为铜离子载体。
发明内容
本发明的技术方案如下：
一种含铜络合物的制备方法，制备方法如下：
(1)将食用明胶加入85℃1％氢氧化钠水溶液中，搅拌24h，滤布滤去不溶物，滤液冷却至50℃；
(2)用盐酸将胶液调至pH＝9.5，加入碱性蛋白酶，60℃下反应4h；
(3)将胶液升温至90℃并保温1h，然后冷却至40℃；
(4)用盐酸将胶液调至pH＝7.8，加入中性蛋白酶，40℃下反应4h；
(5)用盐酸将胶液调至pH＝3.0，加入酸性蛋白酶，40℃下反应4h；
(6)用氢氧化钠将胶液调至pH＝7.0，加入氢氧化铜，搅拌8h后用滤布除去不溶物；
(7)按胶液体积的1:4加入无水乙醇，搅拌1h后用滤布除去不溶物；
(8)继续加入无水乙醇至乙醇与胶液体积达到1:1，搅拌1h后用滤布过滤收集不溶物，
用乙醇冲洗后真空干燥；
(9)将干燥产物溶于水，60℃减压旋干得到产品。
进一步的，所述步骤(1)中，食用明胶的加入质量百分比为为3-5％。
进一步的，所述步骤(2)中，胶液pH范围为8.0-11.0，优选的，pH范围为9.0-10.0，碱性蛋白酶的加入质量百分比为0.1-0.3％。
进一步的，所述步骤(4)中，胶液pH范围为6.5-8.5，优选的，pH范围为7.5-8.0，中性蛋白酶的加入质量百分比为0.2-0.35％。
进一步的，所述步骤(5)中，胶液的pH范围为2.0-4.0，优选的，pH范围为2.5-3.5，酸性蛋白酶的加入质量百分比为0.2-0.4％。
进一步的，所述步骤(6)中，氢氧化铜的加入量为胶液总重的1-2％。
附图说明
图1为比较含相同当量铜离子(10-9mol/L)的醋酸铜、GHK-Cu和实验1中产物对成纤维细胞释放基质金属酶(MMPs)的促进效果。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
(1)将500g食用明胶加入10L 85℃1％氢氧化钠水溶液中，搅拌24h，滤布滤去不溶物，滤液冷却至60℃；
(2)用盐酸将胶液调至pH＝9.0，加入30g碱性蛋白酶(地衣芽胞杆菌)，60℃下反应4h；将胶液升温至90℃并保温1h，然后冷却至40℃；
(3)用盐酸将胶液调至pH＝7.8，加入35g中性蛋白酶(枯草芽孢杆菌)，40℃下反应4h；
(4)用盐酸将胶液调至pH＝3.0，加入40酸性蛋白酶(黑曲霉菌)，40℃下反应4h；
(5)用氢氧化钠将胶液调至pH＝7.0，加入100g氢氧化铜，搅拌8h后用滤布除去不溶物；
(6)加入2.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布除去不溶物；
(7)继续加入7.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布过滤收集不溶物，用乙醇冲洗后真空干燥；
(8)将干燥产物溶于水，60℃减压旋干得到产品。
实施例2
(1)将500g食用明胶加入10L 85℃1％氢氧化钠水溶液中，搅拌24h，滤布滤去不溶物，滤液冷却至60℃；
(2)用盐酸将胶液调至pH＝9.0，加入30g碱性蛋白酶(地衣芽胞杆菌)，60℃下反应4h；
(3)将胶液升温至90℃并保温1h，然后冷却至40℃；
(4)用盐酸将胶液调至pH＝7.0，加入35g中性蛋白酶(木瓜蛋白酶)，40℃下反应4h；
(5)用盐酸将胶液调至pH＝3.0，加入40酸性蛋白酶(黑曲霉菌)，40℃下反应4h；
(6)用氢氧化钠将胶液调至pH＝7.0，加入100g氢氧化铜，搅拌8h后用滤布除去不溶物；
(7)加入2.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布除去不溶物；
(8)继续加入7.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布过滤收集不溶物，用乙醇冲洗后真空干燥；
(9)将干燥产物溶于水，60℃减压旋干得到产品。
实施例3
(1)将500g食用明胶加入10L 85℃1％氢氧化钠水溶液中，搅拌24h，滤布滤去不溶物，滤液冷却至60℃；
(2)用盐酸将胶液调至pH＝9.0，加入30g碱性蛋白酶(地衣芽胞杆菌)，60℃下微波作用15min；
(3)将胶液升温至90℃并保温1h，然后冷却至40℃；
(4)用盐酸将胶液调至pH＝7.8，加入35g中性蛋白酶(枯草芽孢杆菌)，40℃下微波作用15min；
(5)用盐酸将胶液调至pH＝3.0，加入40酸性蛋白酶(黑曲霉菌)，40℃下微波作用15min；
(6)用氢氧化钠将胶液调至pH＝7.0，加入200g氢氧化铜，搅拌8h后用滤布除去不溶物；
(7)加入2.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布除去不溶物；
(8)继续加入7.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布过滤收集不溶物，用乙醇冲洗后真空干燥；
(9)将干燥产物溶于水，60℃减压旋干得到产品。
对比例1
(1)将500g食用明胶加入10L 85℃1％氢氧化钠水溶液中，搅拌24h，滤布滤去不溶物，滤液冷却至60℃；
(2)用盐酸将胶液调至pH＝9.0，加入30g碱性蛋白酶(地衣芽胞杆菌)，60℃下反应4h；
(3)将胶液升温至90℃并保温1h，然后冷却至40℃；
(4)用盐酸将胶液调至pH＝7.8，加入35g中性蛋白酶(枯草芽孢杆菌)，40℃下反应4h；
(5)用盐酸将胶液调至pH＝7.0，加入100g氢氧化铜，搅拌8h后用滤布除去不溶物；
(6)加入2.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布除去不溶物；
(7)继续加入7.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布过滤收集不溶物，用乙醇冲洗后真空干燥；
(8)将干燥产物溶于水，60℃减压旋干得到产品。
对比例2
(1)将500g食用明胶加入10L 85℃水中，搅拌24h，滤液冷却至60℃；
(2)用氢氧化钠将胶液调至pH＝9.0，加入30g碱性蛋白酶(地衣芽胞杆菌)，60℃下反应4h；
(3)将胶液升温至90℃并保温1h，然后冷却至40℃；
(4)用盐酸将胶液调至pH＝7.8，加入35g中性蛋白酶(枯草芽孢杆菌)，40℃下反应4h；
(5)用盐酸将胶液调至pH＝3.0，加入40酸性蛋白酶(黑曲霉菌)，40℃下反应4h；
(6)用氢氧化钠将胶液调至pH＝7.0，加入100g氢氧化铜，搅拌8h后用滤布除去不溶物；
(7)加入2.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布除去不溶物；
(8)继续加入7.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布过滤收集不溶物，用乙醇冲洗后真空干燥；
(9)将干燥产物溶于水，60℃减压旋干得到产品。
对比例3
(1)将500g食用明胶加入10L 85℃1％氢氧化钠水溶液中，搅拌24h，滤布滤去不溶物，滤液冷却至60℃；
(2)用盐酸将胶液调至pH＝7.8，加入35g中性蛋白酶(枯草芽孢杆菌)，40℃下反应4h；
(3)将胶液升温至90℃并保温1h，然后冷却至40℃；
(4)用盐酸将胶液调至pH＝3.0，加入40酸性蛋白酶(黑曲霉菌)，40℃下反应4h；
(5)用氢氧化钠将胶液调至pH＝9.0，加入30g碱性蛋白酶(地衣芽胞杆菌)，60℃下反应4h；
(6)用盐酸将胶液调至pH＝7.0，加入100g氢氧化铜，搅拌8h后用滤布除去不溶物；
(7)加入2.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布除去不溶物；
(8)继续加入7.5L无水乙醇，搅拌1h后用滤布过滤收集不溶物，用乙醇冲洗后真空干燥；
(9)将干燥产物溶于水，60℃减压旋干得到产品。
实验结果：
1.以上各实验例和对比例得到的不同分子量产物的收率如下：
分子量区间
实验例1
实验例2
实验例3
对比例1
对比例2
对比例3
Mw＝690
3.83％
3.21％
4.64％
-
0.14％
1.73％
Mw＝940
5.15％
4.90％
6.23％
0.47％
2.39％
3.54％
Mw＝1170
9.51％
8.62％
10.85％
1.81％
5.03％
7.21％
Mw＝1390
10.24％
11.44％
11.37％
5.12％
7.90％
9.51％
Mw＝1710
9.12％
11.67％
12.06％
8.28％
8.61％
8.63％
Mw＝1890
7.77％
9.38％
10.23％
8.81％
7.97％
8.15％
Mw>2000
12.63％
15.29％
17.05％
15.36％
16.07％
13.45％
2.比较含相同当量铜离子(10-9mol/L)的醋酸铜、GHK-Cu和实验1中产物对成纤维细胞释放基质金属酶(MMPs)的促进效果，结果如图1所示。
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