一种火麻仁粕蛋白多肽液的生产方法和一种具有降尿酸作用的多肽液及其应用
阅读说明：本技术 一种火麻仁粕蛋白多肽液的生产方法和一种具有降尿酸作用的多肽液及其应用 (Production method of fructus cannabis meal protein polypeptide liquid, polypeptide liquid with uric acid reducing effect and application of polypeptide liquid ) 是由 乔长晟 张泽宇 牛思思 钟海蛟 于世云 孙银华 于 2021-02-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种火麻仁粕蛋白多肽液的生产方法及一种具有降尿酸作用的多肽液及,所述火麻仁粕蛋白多肽液的生产方法包括以下步骤：将火麻仁粕加水打浆、超声处理、调节pH值后加入碱性蛋白酶,水解后灭酶,得到火麻仁一步酶解液,再通过酶解结合发酵法或两步酶解法,得到一组具有降尿酸功能的生物活性多肽液。通过反向高效液相色谱法对多肽液体外黄嘌呤氧化酶抑制活性进行测定,以常用药别嘌呤醇作为阳性对照,与火麻仁粕多肽液进行对比,结果表明本发明结合酶解和生物发酵技术,以火麻仁粕制备出的生物活性肽,降尿酸作用显著。(The invention discloses a production method of fructus cannabis meal protein polypeptide liquid, polypeptide liquid with the effect of reducing uric acid and the production method of the fructus cannabis meal protein polypeptide liquid, which comprises the following steps: adding water into fructus cannabis meal, pulping, performing ultrasonic treatment, adjusting the pH value, adding alkaline protease, hydrolyzing, inactivating enzyme to obtain fructus cannabis one-step enzymolysis liquid, and performing enzymolysis combined with fermentation or two-step enzymolysis to obtain a group of bioactive polypeptide liquid with uric acid reducing function. The external xanthine oxidase inhibitory activity of the polypeptide liquid is determined by reverse high performance liquid chromatography, and the common allopurinol is used as a positive control to be compared with the hemp seed meal polypeptide liquid, and the result shows that the biological active peptide prepared from the hemp seed meal has obvious effect of reducing uric acid by combining enzymolysis and biological fermentation technologies.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种降尿酸功能的多肽制备方法及其应用。
背景技术
痛风，又称高尿酸血症，是因体内嘌呤代谢发生紊乱、尿酸增加引起的疾病。近年来，人们食用高能量、高嘌呤类食物的比例显著增加；而且随着生活节奏不断加快，人体常常处于应激状态，内环境紊乱，体内就会产生大量嘌呤；再加上生活起居不规律，缺乏体育锻炼，影响尿酸排出。以至于高尿酸血症已成为一种常见病和多发病。
目前治疗高尿酸血症的方法主要是在急性发作期使用秋水仙碱或非甾体抗炎药消炎，稍缓解后使用别嘌呤等药物降低尿酸含量，严重者只能采取手术治疗。目前所用西药对肝肾存在一定的副作用，而且价格昂贵；手术治疗也很难根治痛风。因此，急需开发一种高效安全的活性物质用于痛风的预防及治疗。
科学研究表明，蛋白质在低聚肽的形式下比大分子蛋白和氨基酸更容易被吸收，而且具有更高的生物活性。生物活性肽具有抗氧化、抑菌、降血压、降血糖、抗肿瘤等生理功能。
火麻仁粕是火麻仁经过压榨提取油脂后的副产品，蛋白含量较为丰富，且富含精氨酸和谷氨酸，是一种良好的植物蛋白资源，也是人体优质的营养来源。但目前火麻仁粕大多作为饲料使用，深加工不足，造成极大的资源浪费。因此，以火麻仁粕作为原料，开发具有降尿酸功能的生物活性多肽具有重要意义和价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一本发明的目的在于提供一组具有降尿酸作用的火麻仁活性多肽液及其制备方法，为开发预防或治疗痛风的保健品或药品提供参考。
本发明提供了一种火麻仁粕蛋白多肽液的生产方法，包括以下步骤：
(1)原料处理：将火麻仁粕和水混匀，破碎混匀，得到火麻仁粕原液；
(2)超声处理：将火麻仁粕原液放入超声破碎；
(3)一步酶解：将超声后的火麻仁粕原液灭酶后，调节pH，加入碱性蛋白酶，混合均匀后，进行酶解反应，然后灭酶，得到一步酶解多肽液；
所述步骤还包括步骤(4)或步骤(5)：
(4)酶解后发酵：将一步酶解多肽液杀菌后后接入乳酸菌，发酵后灭菌，离心取上清，得到酶解后发酵的多肽液；
(5)两步酶解：将一步酶解多肽液加入第二种蛋白酶，混匀，酶解后灭酶，离心取上清，得到两步酶解多肽液。
优选的是，步骤1中火麻仁粕和水的料液比为1:8～1:12,进一步优选的是1：10料液比，浓度过低，增加处理成本；料液过浓在处理的过程中会产生过多气泡，不利于反应的进行。
上述任一项优选的是，破碎方式为过胶体磨破碎。
上述任一项优选的是，步骤2中超声破碎条件为，功率200至600w，处理时间15至25分钟，进一步优选的是功率400w，处理时间20分钟。
上述任一项优选的是，步骤3中pH值调至7.5，加入碱性蛋白酶。由于每种蛋白酶有不同的作用条件(如不同pH值、温度等)，直接混合使用可能会影响酶的效率。优先的先选用碱性蛋白酶是因为碱性蛋白酶酶活性强且水解效率高，而且在碱性条件下有利于火麻仁蛋白质的溶解，可以获得更强的水解蛋白多肽的效果。本发明所述碱性蛋白酶，指在碱性条件下能够水解大分子蛋白质为小分子肽和氨基酸的酶，最适PH7-8。在本发明的优选实施例中使用的是诺维信生物技术有限公司的碱性蛋白酶Alcalase2.4L。但本发明所述碱性蛋白酶种类不限于此，满足上述定义的碱性蛋白酶均在本发明的保护范围内，包括但不限于市售可购买种类的碱性蛋白酶。优选的，碱性蛋白酶浓度为10000U/g([E]/[S])-14000U/g([E]/[S])，进一步优选为12000U/g([E]/[S])。与现有技术中碱性蛋白酶最适pH值是9-11不同，本发明优选碱性蛋白酶最适作用pH为7～8。本发明研究过程中发现这可能与本发明中具体的原料有关，经过本发明前期研究确定适用于本发明原料最优选的最适水解pH值为7.5弱碱性，其酶切效果效率及所得多肽液的降尿酸作用最好，这可能是与火麻仁的一些特殊性质有关。
上述任一项优选的是，步骤4中乳酸菌为保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌或植物乳杆菌中的至少一种。乳酸菌在发酵过程中会产生丰富的酶系，单纯的使用成品酶制剂进行酶解可能会造成酶切位点单一的状况，以至于所得多肽液功能性受到局限；如果直接使用发酵法，大分子蛋白很难直接被乳酸菌利用，会造成发酵效率低的状况；而使用成品酶对火麻仁蛋白进行一次酶解后再乳酸菌发酵，既能克服酶切位点单一的问题又能提高乳酸菌的发酵效率，使得目标功能性多肽增多。优选的，乳酸菌的接入量为2～4％OD值为0.8的乳酸菌菌液。
上述任一项优选的是，步骤5中，所述第二种蛋白酶是指可把大分子量的多肽链从中间切断，形成分子量较小的肽段或游离氨基酸的酶，并且和第一步酶解中不一样的蛋白酶。不一样的蛋白酶是指，第一步酶解的碱性蛋白酶与第二种蛋白酶具有不同的酶切位点。因为酶具有特异性，本发明的优选方案使酶切位点不单一，使用不同的蛋白酶使酶切后的肽段多样化。优选的，第二种蛋白酶的最适PH为7～8，进一步优选的，所述第二种蛋白酶为风味蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶或木瓜蛋白酶。在本发明的优选实施例中使用的是诺维信生物技术有限公司的风味蛋白酶Flavourzyme500 MG或复合蛋白酶Protamex。菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶也为市售产品。但本发明的第二种蛋白酶种类不限于购买途径和购买种类，满足上述定义和作用的蛋白酶均在本发明的保护范围内，所述第二种蛋白酶添加浓度为8000U/g([E]/[S])-12000U/g([E]/[S])，进一步优选为10000U/g([E]/[S])。
上述任一项优选的是，步骤1中，将火麻仁粕和水按照1:10的料液比混匀，过胶体磨破碎混匀，得到火麻仁粕原液。
上述任一项优选的是，步骤2中，将火麻仁粕原液放入超声波清洗机内，功率400w，处理时间20分钟。
上述任一项优选的是，步骤3中，将超声后的火麻仁粕原液灭酶后，pH值调至7.5，加入碱性蛋白酶，混合均匀后，50℃酶解5小时，灭酶，得到一步酶解多肽液。
上述任一项优选的是，步骤4中，将一步酶解多肽液巴氏杀菌后接入乳酸菌，43℃发酵8小时灭菌，4000r/min，离心10min取上清即可得到酶解后发酵的多肽液。乳酸菌在发酵过程中会产生丰富的酶系，单纯的使用成品酶制剂进行酶解可能会造成酶切位点单一的状况，以至于所得多肽液功能性受到局限；如果直接使用发酵法，大分子蛋白很难直接被乳酸菌利用，会造成发酵效率低的状况；而使用成品酶对火麻仁蛋白进行一次酶解后再乳酸菌发酵，既能克服酶切位点单一的问题又能提高乳酸菌的发酵效率，使得目标功能性多肽增多。优选的，乳酸菌为保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌或植物乳杆菌中的至少一种。进一步优选的，乳酸菌的接入量为2～4％OD值为0.8的乳酸菌菌液。
上述任一项优选的是，步骤5中，将一步酶解多肽液后加入第二种蛋白酶，混匀，50℃酶解5小时后灭酶，4000r/min，离心10min取上清即可得到两步酶解多肽液。
上述任一项优选的是，步骤3所述的灭酶是将火麻仁粕浆液置于在沸水浴中保持10min。
上述任一项优选的是，步骤4所述的巴氏杀菌为将火麻仁粕浆液加热至60℃保持30min。
本发明还提供了一种具有降尿酸作用的多肽液，其特征在于，含有火麻仁活性多肽液。
优选的是，按照如下步骤制备得到：
(1)原料处理：将火麻仁粕和水混匀，破碎混匀，得到火麻仁粕原液；
(2)超声处理：将火麻仁粕原液放入超声破碎；
(3)一步酶解：将超声后的火麻仁粕原液灭酶后，调节PH，加入碱性蛋白酶，混合均匀后，进行酶解反应，然后灭酶，得到一步酶解多肽液。
上述任一项优选的是，所述步骤还包括步骤(4)或步骤(5)：
(4)酶解后发酵：将一步酶解多肽液杀菌后，调节pH值，随后接入乳酸菌，发酵后灭菌，离心取上清，得到酶解后发酵的多肽液；
(5)两步酶解：将一步酶解多肽液调节pH值后加入第二种蛋白酶，混匀，酶解后灭酶，离心取上清，得到两步酶解多肽液。
上述任一项优选的是，步骤1中火麻仁粕和水的料液比为1:8至1：12，进一步优选的是1：10。
上述任一项优选的是，破碎方式为过胶体磨破碎。
上述任一项优选的是，步骤2中超声破碎条件为，功率400w，处理时间20分钟。
上述任一项优选的是，步骤3中pH值调至7.5，加入碱性蛋白酶。
上述任一项优选的是，步骤4中乳酸菌为保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌或植物乳杆菌中的至少一种。乳酸菌在发酵过程中会产生丰富的酶系，单纯的使用成品酶制剂进行酶解可能会造成酶切位点单一的状况，以至于所得多肽液功能性受到局限；如果直接使用发酵法，大分子蛋白很难直接被乳酸菌利用，会造成发酵效率低的状况；而使用成品酶对火麻仁蛋白进行一次酶解后再乳酸菌发酵，既能克服酶切位点单一的问题又能提高乳酸菌的发酵效率，使得目标功能性多肽增多。优选的，乳酸菌的接入量为2～4％OD值为0.8的乳酸菌菌液。
上述任一项优选的是，步骤5中，所述第二种蛋白酶为风味蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶或木瓜蛋白酶中至少一种。
上述任一项优选的是，步骤1中，将火麻仁粕和水按照1:10的料液比混匀，过胶体磨破碎混匀，得到火麻仁粕原液。
上述任一项优选的是，步骤2中，将火麻仁粕原液放入超声波清洗机内，功率400w，处理时间20分钟。
上述任一项优选的是，步骤3中，将超声后的火麻仁粕原液灭酶后，pH值调至7.5，加入碱性蛋白酶，混合均匀后，50℃酶解5小时，灭酶，得到一步酶解多肽液。
上述任一项优选的是，步骤4中，将一步酶解多肽液巴氏杀菌后接入乳酸菌，43℃发酵8小时灭菌，4000r/min，离心10min取上清即可得到酶解后发酵的多肽液。乳酸菌在发酵过程中会产生丰富的酶系，单纯的使用成品酶制剂进行酶解可能会造成酶切位点单一的状况，以至于所得多肽液功能性受到局限；如果直接使用发酵法，大分子蛋白很难直接被乳酸菌利用，会造成发酵效率低的状况；而使用成品酶对火麻仁蛋白进行一次酶解后再乳酸菌发酵，既能克服酶切位点单一的问题又能提高乳酸菌的发酵效率，使得目标功能性多肽增多。
上述任一项优选的是，步骤5中，将一步酶解多肽液加入第二种蛋白酶，混匀，50℃酶解5小时后灭酶，4000r/min，离心10min取上清即可得到两步酶解多肽液。
上述任一项优选的是，步骤3所述的灭酶是将火麻仁粕浆液置于在沸水浴中保持10min。
上述任一项优选的是，步骤4所述的巴氏杀菌为将火麻仁粕浆液加热至60℃保持30min。
本发明还提供了利用上述任一项所述的火麻仁粕蛋白多肽液的生产方法和上述任一项具有降尿酸作用的多肽液，作为痛风疾病的辅助治疗药物或具有降尿酸功能的保健食品及药品中的应用。
本发明采用了RP-HPLC法检测多肽液的体外降尿酸活性，所述多肽液在体外降尿酸活性检测中表现出明显的降尿酸活性。
进一步地，所述多肽液的降尿酸活性较高。
进一步地，所述多肽可用作包括痛风疾病的辅助治疗药物或者用于开发具有以降尿酸为功能因子的保健食品及药品。
附图说明
图1为本发明实施例1-7的尿酸峰色谱图。
图2为本发明对比例1-3的别嘌呤醇尿酸峰形图尿酸峰色谱图。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
本发明利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)测定尿酸含量，如下所示的操作方法仅为一种实施方式，本发明的保护范围并不局限于此。
反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)测定尿酸含量的方法如下：
(1)试剂配置方法
50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)缓冲液：准确称取6.0572g Tris，用超纯水溶解，以1mol/L HCl调节pH至7.5，定容至1000mL，备用。
0.42mM黄嘌呤工作液：称取0.0064g黄嘌呤，用少量1mol/LNaOH溶解，用去离子水定容至10mL，混匀，为10×黄嘌呤储备液，使用时稀释10倍。
0.03U/mL黄嘌呤氧化酶工作液：准确称取0.0034g黄嘌呤氧化酶，去离子水定容至10mL，震荡均匀，为100×黄嘌呤氧化酶储备液，使用时稀释100倍。
别嘌呤醇工作液：准确称取0.0054g别嘌呤醇，用少量1mol/LNaOH溶解，去离子水定容至10mL，混匀即为400μM/L别嘌呤醇储备液。分别稀释至20、40、60μM/L。
10μg/mL尿酸储备液：准确称取0.0010g尿酸，去离子水定容至1ml，震荡均匀，分别稀释至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μg/mL，备用。
流动相：95％(V/V)15mmol/L的NH4H2PO4+5％(V/V)色谱级甲醇，超纯水定容至1000ml，使用磷酸调节pH值为6.5，过0.22μm有机膜，超声，备用。
(2)样品预处理
取200μL多肽液于10ml离心管中，加入50μL黄嘌呤氧化酶，37℃下水浴保温10min；加入2.8mL上述pH＝7.5的Tris-HCl缓冲液，400μL黄嘌呤标准储备液，37℃下水浴保温25min；25min后加入150μL l mol/LHCl，终止反应，冷却后过0.22μm水系滤膜，以Tris-HCl缓冲液代替多肽样品溶液作为空白对照，待测。
色谱柱：Shim-pack GIST C18(4.6×250mm，5μm)
液相条件：洗脱液为5％(V/V)甲醇+95％(V/V)NH4H2PO4，进样体积为20μL，流速lmL/min，检测波长290nm，柱温25℃，运行时间10min。
黄嘌呤氧化酶抑制率计算公式
本发明，步骤1中所述火麻仁粕购于市面，所购火麻仁粕为油脂含量不高于10％的冷榨火麻仁粕。优选的油脂含量高于10％的冷榨火麻仁粕也适用于本发明。
保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌或植物乳杆菌可购自中国微生物菌种查询网。然而本发明的保护范围并不限定于菌种的购买途径。
实施例1
将火麻仁粕和水按照1:10的料液比混匀，过胶体磨破碎混匀，得到火麻仁粕原液；将上述原液调制适合的pH值＝7.5，放入超声波清洗机内，功率400w，处理20分钟；灭酶后，向蛋白原液中加入12000U/g([E]/[S])的碱性蛋白酶，混合均匀后，50℃酶解5小时，灭酶，得到一步酶解多肽液；4000r/min离心10min即可得到HSPS1(指的是实施例1中处理得到的火麻仁多肽液)。
RP-HPLC法测定的HSPS1尿酸峰形图及峰面积如图1。
实施例2
将火麻仁粕和水按照1:10的料液比混匀，过胶体磨破碎混匀，得到火麻仁粕原液；将上述原液调制适合的pH值＝7.5，放入超声波清洗机内，功率400w，处理20分钟；灭酶后，向蛋白原液中加入12000U/g([E]/[S])的碱性蛋白酶，混合均匀后，50℃酶解5小时，灭酶，得到一步酶解多肽液；将一步酶解多肽液巴氏杀菌后接入2％的保加利亚乳杆菌，43℃厌氧发酵8h，4℃后酵24h；灭菌，4000r/min离心10min即可得到HSPS2(指的是实施例2中处理得到的火麻仁多肽液)。
RP-HPLC法测定的HSPS2尿酸峰形图及峰面积如图1。
实施例3
将火麻仁粕和水按照1:10的料液比混匀，过胶体磨破碎混匀，得到火麻仁粕原液；将上述原液调制适合的pH值＝7.5，放入超声波清洗机内，功率400w，处理20分钟；灭酶后，向蛋白原液中加入12000U/g([E]/[S])的碱性蛋白酶，混合均匀后，50℃酶解5小时，灭酶，得到一步酶解多肽液；将一步酶解多肽液巴氏杀菌后接入2％的德氏乳杆菌，43℃厌氧发酵8h，4℃后酵24h；灭菌，4000r/min离心10min即可得到HSPS3(指的是实施例3中处理得到的火麻仁多肽液)。
RP-HPLC法测定的HSPS3尿酸峰形图及峰面积如图1。
实施例4
将火麻仁粕和水按照1:10的料液比混匀，过胶体磨破碎混匀，得到火麻仁粕原液；将上述原液调制适合的pH值＝7.5，放入超声波清洗机内，功率400w，处理20分钟；灭酶后，向蛋白原液中加入12000U/g([E]/[S])的碱性蛋白酶，混合均匀后，50℃酶解5小时，灭酶，得到一步酶解多肽液；将一步酶解多肽液巴氏杀菌后接入2％的植物乳杆菌，43℃厌氧发酵8h，4℃后酵24h；灭菌，4000r/min离心10min即可得到HSPS4(指的是实施例4中处理得到的火麻仁多肽液)。
RP-HPLC法测定的HSPS4尿酸峰形图及峰面积如图1。
实施例5
将火麻仁粕和水按照1:10的料液比混匀，过胶体磨破碎混匀，得到火麻仁粕原液；将上述原液调制适合的pH值＝7.5，放入超声波清洗机内，功率400w，处理20分钟；灭酶后，向蛋白原液中加入12000U/g([E]/[S])的碱性蛋白酶，混合均匀后，50℃酶解5小时，灭酶，得到一步酶解多肽液；向一步酶解多肽液中加入10000U/g([E]/[S])的风味蛋白酶，50℃酶解5小时，灭酶，4000r/min离心10min即可得到HSPS5(指的是实施例5中处理得到的火麻仁多肽液)。
RP-HPLC法测定的HSPS5尿酸峰形图及峰面积如图1。
实施例6
将火麻仁粕和水按照1:10的料液比混匀，过胶体磨破碎混匀，得到火麻仁粕原液；将上述原液调制适合的pH值＝7.5，放入超声波清洗机内，功率400w，处理20分钟；灭酶后，向蛋白原液中加入12000U/g([E]/[S])的碱性蛋白酶，混合均匀后，50℃酶解5小时，灭酶，得到一步酶解多肽液；向一步酶解多肽液中加入10000U/g([E]/[S])的中性蛋白酶，50℃酶解5小时，灭酶，4000r/min离心10min即可得到HSPS6(指的是实施例6中处理得到的火麻仁多肽液)。
RP-HPLC法测定的HSPS6尿酸峰形图及峰面积如图1。
实施例7
火麻仁粕原液代替多肽液，待测。
RP-HPLC法测定的火麻仁粕原液尿酸峰形图及峰面积如图1。
实施例8
实施例8与实施例1至7相似，不同的是火麻仁粕和水按照1:8的料液比混匀，碱性蛋白酶的添加量为10000U/g([E]/[S])。乳酸菌的添加量为2％OD0.8的乳酸菌液。实验表明，实施例8所得的多肽液具有明显降尿酸作用。
实施例9
实施例9与实施例1至7相似，不同的是火麻仁粕和水按照1:12的料液比混匀，碱性蛋白酶的添加量为14000U/g([E]/[S])。乳酸菌的添加量为4％OD0.8的乳酸菌液。实验表明，实施例9所得的多肽液具有明显降尿酸作用。
实施例10
实施例10与实施例1至7相似，不同的是火麻仁粕和水按照1:9的料液比混匀，碱性蛋白酶的添加量为11000U/g([E]/[S])。木瓜蛋白酶的添加量为8000U/g([E]/[S])。实验表明，实施例10所得的多肽液具有明显降尿酸作用。
实施例11
实施例11与实施例1至7相似，不同的是火麻仁粕和水按照1:12的料液比混匀，碱性蛋白酶的添加量为13000U/g([E]/[S])。菠萝蛋白酶的添加量为12000U/g([E]/[S])。实验表明，实施例11所得的多肽液具有明显降尿酸作用。
对比例1
20μM/L别嘌呤醇代替多肽液，待测。
RP-HPLC法测定的20μM/L别嘌呤醇尿酸峰形图及峰面积如图2。
对比例2
40μM/L别嘌呤醇代替多肽液，待测。
RP-HPLC法测定的40μM/L别嘌呤醇尿酸峰形图及峰面积如图2。
对比例3
60μM/L别嘌呤醇代替多肽液，待测。
RP-HPLC法测定的60μM/L别嘌呤醇尿酸峰形图及峰面积如图2。
由图1和图2可知，HSPS2～HSPS5所述多肽对尿酸的抑制作用均已高于40μM别嘌呤醇，其中HSPS4的抑制作用已经超过60μM别嘌呤醇。降尿酸作用显著。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种硫酸软骨素超滤废液制备胶原蛋白肽的方法