具有双靶点的hdac抑制剂的纳米胶束-水凝胶制剂在治疗急性肾损伤药物中的应用
阅读说明：本技术 具有双靶点的hdac抑制剂的纳米胶束-水凝胶制剂在治疗急性肾损伤药物中的应用 (Application of nano-micelle-hydrogel preparation of HDAC (Histone-based activator of nucleic acid) inhibitor with double targets in medicine for treating acute kidney injury ) 是由 韩京华 沈杰 卢亚欣 叶开 林新辉 于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种具有双靶点的HDAC抑制剂的纳米胶束-水凝胶制剂在治疗急性肾损伤药物中的应用。S-SAHA小分子是已知的HDAC抑制剂；本发明首次证实具有抑制LTA4H活性。以此为基础,本发明提供了一种以S-SAHA的前药SAHA-Ac为活性负载药物的水凝胶剂型,并证明该水凝胶通过原位注射,可以抑制LTA4H,下调LTB4,从而具有治疗肾脏炎症的新应用。(The invention provides an application of a nano micelle-hydrogel preparation of an HDAC inhibitor with double targets in a medicine for treating acute kidney injury. S-SAHA small molecules are known HDAC inhibitors; the invention is the first to prove that the LTA4H activity is inhibited. Based on the situation, the invention provides a hydrogel preparation taking S-SAHA prodrug SAHA-Ac as an active load drug, and proves that the hydrogel can inhibit LTA4H and down-regulate LTB4 through in-situ injection, so that the hydrogel has a new application in treating renal inflammation.)
技术领域
本发明属于生物医药
技术领域
，尤其是涉及一种具有双靶点的HDAC抑制剂的纳米胶束-水凝胶制剂在治疗急性肾损伤药物中的应用。背景技术
由肾脏缺血再灌注引起的急性肾损伤占所有肾脏疾病约80％，影响着全球约五亿的患者。肾脏的缺血再灌注会引起细胞内钙离子的过载，活性氧物质的上升，肾脏pH的恢复，继而引起细胞发生炎症反应和坏死。现如今，针对急性肾损伤的标准疗法为肾素-血管紧张素-醛固酮疗法，但疾病的发病率一直处于上升趋势，因此，寻找替代的创新疗法刻不容缓。
乙酰化是组蛋白最广泛且常见的修饰方式，在染色质结构和基因的转录过程中起关键作用。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)是调控此过程重要的酶之一，控制着许多生长发育过程和疾病状态。组蛋白的赖氨酸残基通过许多方式建立不同修饰体系之间的相互连接路径，继而进行翻译后修饰，并参与多种信号通路的调节而对炎症和免疫反应产生影响。LTA4H是一种分子量为61kDa的双功能锌金属酶，它能将环氧化物LTA4特异性催化水解生成LTB4。LTB4能在多核白细胞中产生强大的趋化作用，可促进白细胞亚群向炎症组织的迁移，产生巨噬细胞分化等促炎作用。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种具有双靶点的HDAC抑制剂的纳米胶束-水凝胶制剂在治疗急性肾损伤药物中的应用。
本发明提供了用mPEG-b-PCL制备其载药胶束的方法，以及将此载药胶束包埋于水凝胶中的方法。
本发明提供了SAHA-Ac对肾脏细胞中p-HDAC和LTA4H的抑制作用的应用。
本发明提供了此种SAHA-Ac胶束水凝胶制剂对急性肾损伤组织的抗炎和修复作用的应用。
本发明中载药胶束的制备已经过工艺优化，在组装温度、药物与材料质量比、透析温度、溶剂种类、材料种类、处理过程等多个方面进行探究，测定其载药量和包封率，以选择最佳纳米胶束组装工艺。
本发明研究了一种把SAHA-Ac这种HDAC抑制剂包裹在胶束中，继而制成水凝胶的新型制剂，在保留其活性的同时提升了药物的溶解度，增加了药物缓释的性质，并研究了其在肾脏中的靶点和作用机理，以及对急性肾损伤的抗炎和修复作用，发现了其对于急性肾损伤的新应用，为临床治疗提供了新思路。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
具有双靶点的HDAC抑制剂的纳米胶束-水凝胶制剂在治疗急性肾损伤药物中的应用，纳米胶束里含有化合物SAHA-Ac，其中SAHA-Ac的结构式为：
优选的，纳米胶束由mPEG-b-PCL包裹化合物SAHA-Ac构成。
优选的，SAHA-Ac对肾脏细胞中p-HDAC和LTA4H的抑制作用。
优选的，在急性肾损伤组织的抗炎和修复的药物中的应用。
优选的，纳米胶束的制备，包括如下步骤，
1)配制药物浓度为10mg/mL的母液；取聚合物材料mPEG-b-PCL(10000：8000)为载体，药物与材料质量比1：10，加入DMSO稀释至1mL后于超声下溶解混匀；
2)另取19mL超纯水于样品瓶中，瓶中加入棒状磁子，再将样品瓶置于恒温电热套上加热搅拌；组装温度设置为40℃；
3)用注射器取上述母液逐滴滴加至超纯水中，加入完毕后以800～1000rpm转速继续搅拌10min，最后于室温下缓慢冷却；
4)将胶束溶液转移至3500Da透析袋内，再将透析袋密封好装入盛有500mL超纯水的烧杯中，于室温下透析，每隔5～6小时更换一次超纯水，更换三～四次；
5)取胶束溶液离心(5000rpm，15min，20℃)，除去难溶性碎片沉淀，再用0.22μm针筒式亲水性滤膜过滤器得到澄清的胶束溶液。
优选的，纳米胶束-水凝胶制剂的制备，包括如下步骤，
1)质量分数为2％壳聚糖(CS)溶液的制备：取经高温高压消毒(120℃，15min)的200mg CS粉末溶解在10mL 0.1M HCl中，持续搅拌至完全溶解，冰浴下储存待用。
2)质量分数为56％β-甘油磷酸钠(β-GP)溶液的制备：取1mL三蒸水溶解0.56gβ-GP，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌；
3)载药胶束水凝胶的制备：将0.1mL载药胶束加至0.8mL CS溶液中，再加入0.1mLβ-GP溶液，以体积比CS:β-GP:载药胶束＝8:1:1充分混合；
4)胶束溶液的浓缩及无菌处理：预先用70％(v/v)异丙醇溶液浸泡超滤离心管15min，之后弃去溶液，用蒸馏水润洗三次后加入超纯水，封口膜密封，离心(5000rpm，10min，20℃)；在超净台中弃去超滤管中的液体，胶束溶液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，取15mL过滤后的胶束溶液于超滤离心管中，用封口膜密封，离心(5000rpm，90min，20℃)获得0.6mL浓缩胶束溶液。
相对于现有技术，本发明所述的应用，具有以下优势：
SAHA-Ac可以抑制细胞由H2O2模拟炎症引起的p-HDAC的升高。在抑制细胞内LTA4HmRNA量的同时，也可以抑制LTA4H的蛋白含量。SAHA-Ac胶束可以显著降低由肾脏分离出的M1促炎巨噬细胞的特征蛋白，同时恢复M2抗炎巨噬细胞的特征蛋白，从而调控炎症反应向抗炎的方向进行。同时，多种M1和M2特征基因也证实了这一调控。本发明中的SAHA-Ac胶束水凝胶制剂有实现药物缓释的功能。该水凝胶制剂可以显著缓解急性肾损伤引起的肾小管坏死和肾小管扩张。该水凝胶制剂可以改善肾小管系膜硬化，间质性浸润，以及肾小管萎缩。两种改善和治疗作用均显示出浓度依赖的效果。
附图说明
图1：载药水凝胶的储存模量和损耗模量随温度的变化情况。其中所载药物为SAHA-Ac胶束，G’代表储存模量，G”代表损耗模量。
图2：各实验组细胞中p-HDAC2和HDAC2的表达量的免疫印迹分析以及量化。Control组为不进行任何处理的细胞组，H2O2组为使用过氧化氢对细胞进行处理，以激活细胞中的p-HDAC2和HDAC2的表达。H+SAHA-Ac组为将细胞使用H2O2处理后，再使用SAHA-Ac处理。H+SAHA组为将细胞使用H2O2处理后，再使用SAHA处理。*表示与H2O2组相比p<0.05,#表示与H+SAHA-Ac组相比p<0.05。
图3：各实验组细胞中LTA4H相关mRNA的表达量。各分组与图2分组相同。
图4：各实验组细胞中LTA4H的表达量的免疫印迹以及量化。各分组与图2分组相同。
图5：各实验组小鼠肾脏中巨噬细胞M1及M2蛋白表达量的免疫印迹分析以及量化。Sham组为假手术对照组，即对小鼠进行肾脏缺血再灌注相同的手术处理，但不给予实验刺激；I/R为肾脏缺血再灌注模型组；I/R+Control组为在肾脏缺血再灌注模型中使用PBS作为对照组；I/R+LTB4组为在肾脏缺血再灌注模型中注射LTB4以激活免疫反应的实验组；I/R+L+S组为在肾脏缺血再灌注模型中同时注射LTB4和SAHA-Ac胶束水凝胶的实验组；I/R+L+U组为在肾脏缺血再灌注模型中同时注射LTB4和其拮抗剂U-75302的实验组。*表示与I/R+LTB4组相比p<0.05。
图6：各实验组小鼠肾脏巨噬细胞标志物的表达量。各分组与图5分组相同。*表示与I/R+LTB4组相比p<0.05。
图7：各实验组小鼠肾脏组织切片HE染色图片及其量化分析。Sham组为假手术对照组；I/R组为缺血再灌注模型组；2μM SAHA-Ac组为对于缺血再灌注模型使用2μM的SAHA-Ac胶束水凝胶；10μM SAHA-Ac组为对于缺血再灌注模型使用10μM的SAHA-Ac胶束水凝胶；50μMSAHA-Ac组为对于缺血再灌注模型使用50μM的SAHA-Ac胶束水凝胶。*表示与I/R组相比p<0.05。
图8：各实验组小鼠肾脏组织切片PAS染色图片及其量化分析。各分组与图7分组相同。
图9：各实验组小鼠血清中尿素氮(A)和肌酸酐(B)的浓度。各分组与图7分组相同。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1载SAHA-Ac纳米胶束的制备
一、实验方法：
1.配制药物浓度为10mg/mL的母液，即取22mg药物于2.2mL DMSO中溶解。取聚合物材料mPEG-b-PCL(10000：8000)为载体，药物与材料质量比1：10，加入DMSO稀释至1mL后于超声下溶解混匀。
2.另取19mL超纯水于样品瓶中，瓶中加入棒状磁子，再将样品瓶置于恒温电热套上加热搅拌。组装温度设置为40℃。
3.用注射器取上述母液以2秒每滴的速率滴加至超纯水中，加入完毕后以800rpm转速继续搅拌10min，最后于室温下缓慢冷却。
4.将胶束溶液转移至3500Da透析袋内，再将透析袋密封好装入盛有500mL超纯水的烧杯中，于室温下透析，每隔5～6小时更换一次超纯水，更换三次。
5.取胶束溶液离心(5000rpm，15min，20℃)，除去难溶性碎片沉淀，再用0.22μm针筒式亲水性滤膜过滤器得到澄清的胶束溶液。
6.取上述1mL胶束溶液，测定粒径及ζ电位。
7.含量测定：
(1)色谱条件：色谱柱C18，以60％(v/v)乙腈的B浓度为流动相，流速1mL/min，检测波长为245nm，柱温为40℃，进样量20μL。
(2)专属性试验：分别精密量取空白胶束、载药胶束1mL，加入无水甲醇定容至25mL，用0.22μm针筒式过滤器得到续滤液按上述色谱条件测定，另取SAHA-Ac作为对照溶液(10μg/mL)按同样色谱条件测定。
(3)线性考察：精密称取SAHA-Ac原料药125mg，置于25mL容量瓶中，加入甲醇溶解药物并定容至刻度，制成浓度为500μg/mL的SAHA-Ac贮备液。移取适量，用无水甲醇稀释，配成浓度为0.1，1.0，5，10，20，40，100μg/mL的SAHA-Ac对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，以峰面积(Y)对药物浓度(X，μg/mL)进行线性回归，得到回归方程为：Y＝73234X+19414，R2＝0.9997，结果表明SAHA-Ac在0.1～100μg/mL浓度范围内与峰面积线性关系良好。
(4)精密度试验：取浓度为10，20，40μg/mL的低、中、高浓度对照品溶液，分别于1天内重复测定5次，记录峰面积，计算日内精密度，RSD值分别为0.18％，0.04％，0.06％(n＝5)；连续测定5天，记录峰面积，计算日间精密度，RSD值分别为0.20％，0.16％，0.3％(n＝5)。结果表明方法精密度良好。
(5)回收率试验：取空白胶束溶液1mL，加入适量SAHA-Ac贮备液，用无水乙醇配成浓度为10，20，40μg/mL的供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图及峰面积，计算回收率。结果表明，SAHA-Ac的平均回收率为101.10％，RSD＝0.54％(n＝9)，方法回收率符合要求。
(6)包封率和载药量的计算
取2mL胶束溶液，冷冻干燥10h，称得干燥胶束质量。之后用甲醇复溶，经0.22μm针筒式疏水性微孔滤膜得滤液。另精密称取SAHA-Ac对照品适量，加无水甲醇溶解并定量稀释制成浓度为20μg/mL的溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算含量，其药物浓度、包封率和载药量如表3.2所示。(包封率＝包裹的药物含量/投药量；载药量＝包裹的药物含量/载药胶束质量)。
二、实验结果：
结果显示，按本发明方法制备的胶束粒径为95.93nm，PDI为0.15。ζ电位为-7.65mV。胶束对SAHA-Ac的包封率和载药量分别为18.27％和1.35％。证明该纳米胶束粒径较小(100nm以下)，分布均一，轻微带负电较稳定，且对SAHA-Ac的包封率和载药量都达到了较高水平，实现了增加SAHA-Ac溶解度和改变其在体内生物学分布的目的。
实施例2可注射型无菌壳聚糖温敏水凝胶的制备及表征
一、实验方法：
1.质量分数为2％壳聚糖(CS)溶液的制备：取经高温高压消毒(120℃，15min)的200mg CS粉末溶解在10mL 0.1M HCl中，持续搅拌至完全溶解，冰浴下储存待用。
2.质量分数为56％β-甘油磷酸钠(β-GP)溶液的制备：取1mL三蒸水溶解0.56gβ-GP，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
3.载药胶束水凝胶的制备：将0.1mL载药胶束加至0.8mL CS溶液中，再加入0.1mLβ-GP溶液，以体积比CS:β-GP:载药胶束＝8:1:1充分混合。
4.胶束溶液的浓缩及无菌处理：预先用70％(v/v)异丙醇溶液浸泡超滤离心管15min，之后弃去溶液，用蒸馏水润洗三次后加入超纯水，封口膜密封，离心(5000rpm，10min，20℃)。在超净台中弃去超滤管中的液体，胶束溶液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，取15mL过滤后的胶束溶液于超滤离心管中，用封口膜密封，离心(5000rpm，90min，20℃)获得0.6mL浓缩胶束溶液。
5.水凝胶的流变学性能表征：使用25mm钢板测量系统的流变仪测定水凝胶的流体力学参数。首先按照上述方法配制水凝胶，之后缓慢滴加0.5mL样品于平行板底部的中央，避免产生气泡。其次，在0℃～46℃范围内，每隔2℃测定一次，振动频率在0.159Hz，壳聚糖水凝胶在0.1～100rad/s以上的应变幅值为1％时进行频率扫描，最后记录储存模量(G')、损耗模量(G″)随温度的变化关系。
二、实验结果：
成胶过程显示，将CS溶液、β-GP溶液和载药胶束溶液以体积比8:1:1充分混合得到均一水凝胶溶液，置于37℃恒温水浴中，7-8min后发生相转变，即为凝胶态。
图1结果显示，G'随温度的升高呈现指数升高的趋势，G″随温度的升高表现出先下降后升高的趋势。当温度小于36℃时，G″＞G'，表明此时的水凝胶材料主要发生粘性形变，呈液态；当温度大于42℃时，G″＜G'，表明此时的水凝胶材料主要发生弹性形变，呈固态；当温度处于36-42℃范围内，G'和G″的趋势线交汇于一点，G'＝G″，表明此时的水凝胶材料为半固态。由此可见，水凝胶材料的形态会随温度的升高而发生转变，表明其具有温敏的特性，且可通过原位注射在病灶部位形成凝胶，从而达到组织修复和药物缓释的目的。
实施例3、SAHA-Ac对HDAC2激活的体外抑制实验
一、实验细胞：
HK-2肾乳头状瘤细胞系，置于10％胎牛血清RPMI1640培养基中，在37℃，5％CO2的恒温培养箱中培养，两到三天传代一次，取对数生长过期细胞进行实验。
二、实验分组：
1.空白组(Control)：不加药物处理
2.正对照组(H2O2 1mmol/L)：加1mmol/L H2O2激活细胞产生大量的p-HDAC2
3.经5μM的SAHA-Ac处理的实验组(H+SAHA-Ac 5μM)：1mmol/L H2O2+SAHA-Ac 5μM
4.经5μM的SAHA处理的实验组(H+SAHA 5μM)：1mmol/L H2O2+SAHA 5μM
三、实验方法
按实验分组向细胞中加入对应的试剂，孵育结束后进行蛋白分离与免疫印迹实验。
取蛋白裂解缓冲液将细胞置于冰上裂解30min，离心(14000rpm，15min)后收集上清液，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。用10％SDS-PAGE凝胶分离蛋白，加入转膜缓冲液将其转移至聚偏二氟乙烯膜上，在电流300mA条件下转膜2h。随后，在4℃下与含有质量分数为5％脱脂奶粉的TBS中孵育2h。用含质量分数为0.2％吐温-20的TBS(即TBST)洗涤3次，然后在4℃下用一抗孵育过夜。随后，用TBST清洗膜3次，并在室温下用二抗孵育样品2h。使用辣根过氧化物酶化学发光试剂盒检测目的蛋白，再用光学成像系统处理。β-actin作为对照。使用的抗体为HDAC2单克隆抗体，p-HDAC2(Ser394)多克隆抗体。
四、实验结果
图2A显示的是不同实验组下细胞中p-HDAC2和HDAC2蛋白的表达情况。
图2B和图2C是对免疫印迹实验的定量分析。结果显示，相对于SAHA而言，SAHA-Ac更加能显著抑制p-HDAC2在HK-2细胞的表达，但SAHA在抑制HDAC2的表达效果更佳。
实施例4、SAHA-Ac对LTA4H表达活性的体外抑制实验
一、实验细胞：
与实施例3相同
二、实验分组：
与实施例3相同
三、实验方法：
在实施例3对细胞与对应药物进行共孵育之后，按以下步骤提取细胞中的RNA：
参照实验指南，使用TRIzol试剂从细胞系和组织中提取总RNA。利用TransScriptFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix合成互补DNA(cDNA)。采用TransScript两步RT-PCR SuperMix技术，按说明书进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。在1％琼脂糖凝胶上对PCR产物进行分析并将其可视化。采用TransStart Top Green qPCRSuperMix进行定量RT-PCR。以β-actin为对照基因，确保mRNA的表达正常化。对于RT-qPCR，我们使用了以下引物：
LTA4H F:CTCATTCAGCATCGCAGACC 59.06 NM_008517.
R:TCGCTTTATGTGCCCCAAGG 60.68 2
四、实验结果：
图3结果显示，与5μM的SAHA-Ac和5μM的SAHA共孵育后，其LTA4H mRNA的表达量均显著低于在H2O2孵育的细胞，且5μM的SAHA-Ac比5μM的SAHA作用效果更佳明显。结果表明，在基因层面，SAHA-Ac可显著抑制细胞内LTA4H的表达。
实施例5、SAHA-Ac对LTA4H蛋白含量的体外抑制实验
一、实验细胞：
与实施例3相同
二、实验分组：
与实施例3相同
三、实验方法：
与实施例3相同
四、实验结果：
图4A显示的是不同实验组下细胞中LTA4H蛋白的表达情况。图4B是对免疫印迹实验的定量分析。图4A结果显示，在H2O2诱导细胞内LAT4H蛋白含量升高后，SAHA-Ac可显著降低其含量，降低效果比SAHA要好。图4B更加直观地证实了这一点。结果表明，SAHA-Ac不仅在基因层面可以显著抑制LTA4H mRNA的表达，在蛋白表达层面更进一步证实了其对LTA4H的抑制能力。
实施例6、SAHA-Ac胶束水凝胶调节巨噬细胞体内分化
一、实验细胞：
本实施例采用从肾脏中分离的巨噬细胞来进行实验，分离过程如下：
1.样品制备：
(1)各组肾脏称重后，用眼科手术剪在无菌操作下将其剪成小块。
(2)将小块肾放入70μm细胞筛中，并用研磨机反复研磨。研磨时加入匀浆冲洗液以便让所有细胞通过筛子滴入离心管。
(3)将研磨液离心(450g、10min)，弃去上清液。
(4)用样品稀释液重悬组织细胞，调整细胞悬液的浓度至2×108-1×109/mL备用。
2.分离步骤：
(1)取无菌硅化离心管，依次加入分离液1和分离液2(体积比为3:1，所有试剂和细胞悬液体积比为2:1)，使每层液体表面的分层明显。
(2)用吸管小心地吸取细胞悬液，并将其加至分离液的液体表面，离心处理(500g、25min)。
(3)离心后，离心管从上到下分为六层。第一层是稀释液层；第二层为环状乳白色巨噬细胞层(第一层为白色环，上层为分离液2的50％)；第三层是乳白色的单核细胞环(分离液2和第二个白色环低于50％)；第四层为透明状分离液1；第五层是粒细胞层；第六层是红细胞层。
(4)用吸管小心地将第二层转移至另一个15mL离心管中，在离心管中加入5-10mL洗涤液，并将细胞混匀。
(5)离心(400g、10min)。
(6)弃去上清液。
(7)用吸管取5-10mL清洁液将获得的细胞重悬。
(8)离心(250g、10min)。
(9)重复步骤7、8和9。弃去上清液，并用0.5mL相应的液体重新培养细胞以进行后续实验。具体实验步骤和注意事项参考试剂盒手册(TBD0052SOP，tbdscience)。
二、实验分组：
1.假手术对照组(Sham)：对小鼠进行肾脏缺血再灌注相同的手术处理，但不给予实验刺激。
2.疾病模型组(I/R)：对小鼠肾脏进行缺血再灌注处理。
3.给PBS的对照组(I/R+Control)：对经缺血再灌注肾脏处理的小鼠注射PBS
4.阳性对照组(I/R+LTB4)：对经缺血再灌注肾脏处理的小鼠注射LTB4
5.给SAHA-Ac胶束水凝胶的实验组(I/R+L+S)：对经缺血再灌注肾脏处理的小鼠注射LTB4+SAHA-Ac胶束水凝胶
6.给LTB4拮抗剂U-75302的负对照组(I/R+L+U)：对经缺血再灌注肾脏处理的小鼠注射LTB4+U-75302
三、实验方法：
按照上述实验分组，对小鼠进行不同处理后，按上述细胞处理方法分离出肾脏中的巨噬细胞，继而按照实施例3中实验方法中所述的蛋白分离与免疫印迹实验进行巨噬细胞中各种促炎和抗炎相关蛋白的测定。
四、实验结果：
图5A为不同实验组下巨噬细胞中M1/M2蛋白表达的情况，图5B和图5C为其结果的定量分析。结果显示，SAHA-Ac显著降低了由过量的LTB4引起的M1巨噬细胞标记物(如CD80、CD86和MHCII)的蛋白表达，并恢复了肾巨噬细胞中M2标记物(如CD163、CD206和SLAM)的表达。SAHA-Ac胶束水凝胶的效果仅次于LTB4的拮抗剂。该结果证明SAHA-Ac胶束水凝胶有调节巨噬细胞表型的作用。
实施例7、SAHA-Ac胶束水凝胶调节巨噬细胞多种标志物的表达
一、实验细胞：
本实施例采用实施例6中所述的实验细胞进行实验。
二、实验分组：
本实施例的实验分组与实施例6中相同。
三、实验方法
本实施例先采用实施例6中的实验方法分离出肾脏中的巨噬细胞，继而按照实施例4中提取细胞中的RNA进行其含量的测定。
四、实验结果
图6A结果显示，SAHA-Ac胶束水凝胶显著降低了多种M1型肾脏巨噬细胞标志物的mRNA表达(如IL1B，IL6，TNF，IL12A，NOS2)，并提高了(图6B)M2型肾巨噬细胞标志物的表达(如IL10，TGFB1，ARG1，PDGFA)。该结果进一步确认了SAHA-Ac胶束水凝胶可以分别下调肾脏中巨噬细胞的M1和M2表型，从而实现抗炎的目的。
实施例8、SAHA-Ac胶束水凝胶对急性肾损伤组织有修复的作用
一、实验分组
1.假手术对照组(Sham)：对小鼠进行肾脏缺血再灌注相同的手术处理，但不给予实验刺激。
2.疾病模型组(I/R)：对小鼠肾脏进行缺血再灌注处理。
3.给2μM SAHA-Ac胶束水凝胶的实验组(2μM SAHA-Ac)：对经缺血再灌注肾脏处理的小鼠注射2μM的SAHA-Ac胶束水凝胶
4.给10μM SAHA-Ac胶束水凝胶的实验组(10μM SAHA-Ac)：对经缺血再灌注肾脏处理的小鼠注射10μM的SAHA-Ac胶束水凝胶
5.给50μM SAHA-Ac胶束水凝胶的实验组(50μM SAHA-Ac)：对经缺血再灌注肾脏处理的小鼠注射50μM的SAHA-Ac胶束水凝胶
二、实验方法
按照实验分组对小鼠进行处理，在给药第7天后，取出小鼠肾脏，进行如下实验：
1.组织学分析：通过苏木精-伊红(H&E)染色分析炎症细胞浸润情况。用盲测法计算10个不同随机区域的炎性浸润程度，并分析其管型形成、肾小管坏死和肾小管扩张的面积比。
2.过碘希夫反应：对所有小鼠的肾进行缺血再灌注处理后，固定在含有10％(v/v)磷酸盐缓冲溶液的福尔马林溶液中，之后用石蜡包埋。将其切成厚度为10μm的薄片，用过碘酸希夫染色，观察肾小球(毛细血管、系膜)和近曲小管的变化。为了表征肾小球病变，在所有小鼠中随机抽查10个肾小球，并计算各类别所占比例(病变分为无病变、节段性肾小球硬化、弥漫性硬化和渗出性病变四种严重程度)。近曲小管上皮细胞的液泡变性作为以下四类之一被半定量表征，分别是：无、轻度、中度和重度。每只小鼠随机选取4个200×高分辨区域，计算肾小管间质的严重程度。
三、实验结果
图7A显示了不同实验组H&E肾脏组织染色的结果，图7B为其定量分析。结果显示，50μM的SAHA-Ac胶束水凝胶对肾小管坏死和肾小管扩张有显著的改善作用，并呈现对SAHA-Ac胶束水凝胶浓度依赖的现象。
图8A显示了不同实验组过碘希夫肾脏组织染色的结果，图8B为其定量分析。结果显示，当SAHA-Ac胶束水凝胶给药浓度在2μM时，其效果与对照组一致，均显示出肾小管系膜硬化，间质性浸润，以及肾小管萎缩等现象。当给药浓度提升至10μM时，这些现象均得到了一定程度的缓解。而当给药浓度提升至50μM时，这些急性肾损伤的表征均得到显著改善。这更进一步证实了SAHA-Ac胶束水凝胶对肾脏缺血再灌注引起的急性肾损伤组织有修复的作用，且这一作用呈现浓度依赖的现象。
实施例9、SAHA-Ac胶束水凝胶对急性肾损伤后肾脏功能有保护和修复作用
一、实验分组
实验分组与实施例8中相同
二、实验方法
按照上述实验分组对小鼠进行处理，在损伤后的1天、7天、21天分别采集血样，用尿素检测试剂盒和肌酐检测试剂盒检测血清中尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)的含量。
三、实验结果
图9A和图9B分别显示了不同实验组在三个时间点下血清中BUN和SCr的变化。结果表明，在急性肾损伤后的7天，血清中BUN和SCr的量相比第1天大幅提升，这反映着肾脏功能的损坏。SAHA-Ac胶束水凝胶则可以显著降低BUN和SCr的含量，而这种改善作用在损伤发生后的21天更为显著。结果显示SAHA-Ac胶束水凝胶对急性肾损伤后肾功能的恢复有显著疗效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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