具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。本发明提供了以下优选的实施例。

如图1所示，本发明实施例提供一种白藜芦醇原位凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，称取1.25g泊洛沙姆188溶解于25ml烧杯中。

步骤二，称取10.7g泊洛沙姆407溶解于50ml烧杯中。

步骤三，待所述泊洛沙姆188、所述泊洛沙姆407分别完全溶解后定容并在4℃下溶胀12h。

步骤四，用移液器分别量取1.295ml、浓度5%的泊洛沙姆188，以及3.705ml、浓度21.4%的泊洛沙姆407，并混合于7ml西林瓶中。

步骤五，冰浴条件下，采用集热式恒温加热磁力搅拌器以20r/min对西林瓶中的泊洛沙姆188和泊洛沙姆407搅拌15min,使所述泊洛沙姆188和所述泊洛沙姆407混合均匀、静置，得到最优处方空白凝胶。

步骤六，分别称取 0.0005g、0.0010g、0.0015g白藜芦醇于7ml西林瓶中。

步骤七，分别向所述白藜芦醇中加入5ml所述最优处方空白凝胶，冰浴条件下，采用集热式恒温加热磁力搅拌器以20r/min对西林瓶中的白藜芦醇和最优处方空白凝胶搅拌15min，使所述白藜芦醇和所述最优处方空白凝胶混合均匀、静置，分别得到0.0001g/ml、0.0002g/ml、0.0003 g/ml的白藜芦醇原位凝胶。

本发明实施例提供的白藜芦醇原位凝胶的制备方法，以泊洛沙姆407、泊洛沙姆188为载体材料，并对空白凝胶的处方和工艺进行优化，得到最优处方空白凝胶为3.705ml、浓度为21.4%的泊洛沙姆407，以及1.295ml、浓度为5%的泊洛沙姆188，制得凝胶温度接近于体温，并基于最优处方空白凝胶制得白藜芦醇原位凝胶，弥补了白藜芦醇水溶性差的缺点，使得白藜芦醇在临床治疗中更适于应用。

其中，最优处方空白凝胶通过如下实验获得：

预实验。样品制备：目前，制备凝胶的常用方法是冷溶法，具体来说是将药品研磨后和蒸馏水混合，在冰水混合物中用磁力搅拌器搅拌，使药品完全溶解后定容放置在4℃环境中待溶液澄清即可。首先，精密称取3.75g、4.50g、5.00g、5.25g、6.00g、6.25g泊洛沙姆407用蒸馏水溶解于25ml小烧杯中，配制成浓度为15%、18%、20%、21%、24%、25%的泊洛沙姆407溶液，按照上述操作进行药品溶解，待药品完全溶解后定容，放置冰箱冷藏一晚测定成胶温度，泊洛沙姆407的浓度与胶凝温度关系见图2。

其次，精密称取0.25g、0.75g、1.00g、1.25g、1.50g、1.75g泊洛沙姆188用蒸馏水溶解于25ml小烧杯中，配制成浓度为1%、3%、4%、5%、6%、7%的泊洛沙姆188溶液，按照上述操作进行药品溶解，待药品完全溶解后定容，放置冰箱冷藏一晚。

测定胶凝温度：在评价温度敏感型原位凝胶时，凝胶的温度是必不可少的参考数据。目前，研究人员通常使用常用目测法和流变学作为测定凝胶温度的方法。目测法是指缓慢升高温度，倾斜西林瓶，当内容物不能流动时，此时的温度为胶凝温度。虽然这种方法比较简单直观但有很大局限性，因为溶液-凝胶转变需要在一段时间内发生，最终测得的胶凝温度可能由于胶凝时间的原因而高于实际胶凝温度。

本发明在实验测定胶凝温度时不加搅拌子，将盛装5ml凝胶溶液的西林瓶置于水浴下慢慢加热，每升高1℃倾斜西林瓶，观察是否形成凝胶，以内容物不能流动时的温度为胶凝温度，记录胶凝温度。由于实验过程中观察因素影响较大，每个样品测三次，取平均值，减小误差。

单因素实验。根据预实验数据可知，泊洛沙姆407凝胶温度表现为，泊洛沙姆407的浓度增大时，凝胶温度会随之减小，这是一种浓度依赖性的趋势。单独使用泊洛沙姆407溶液时其凝胶温度过低，不符合实验所要求的在室温下为流动液体，在体温下为半固体状态，同时温度较低时将包载药物的凝胶用于病灶处，对人体也有刺激性，因此，需要加入其同系物泊洛沙姆188调节凝胶温度，制得胶凝温度适宜的空白凝胶，以便包载药物。

泊洛沙姆188的浓度：

表1 泊洛沙姆188浓度变化时的胶凝温度

泊洛沙姆407的浓度：

表2 泊洛沙姆407浓度变化时的胶凝温度

泊洛沙姆188的体积：

由以上两组单因素实验可知，浓度为21%的泊洛沙姆407与浓度为5%的泊洛沙姆188与以体积比为3的体积比混合而成的胶凝温度最接近于人体体温，以下单因素实验固定泊洛沙姆407和泊洛沙姆188浓度，更改两者体积比，确定最优体积比。

表3 更改泊洛沙姆188浓度时的胶凝温度

表4 固定泊洛沙姆188体积、更改体积比时的胶凝温度

泊洛沙姆407与泊洛沙姆188总体积：

为保证凝胶的相转变温度，胶凝时间等不受溶液体积的影响，因此，固定溶液总体积为5ml,变化泊洛沙姆407与泊洛沙姆188体积比。

表5 固定总体积

响应面实验：本实验中使用Design Expert 10软件分析响应面数据。DesignExpert 10是一款专业的实验设计软件，具有高水平专业性。通过选取适当的设计方法，能够将研发效率提高。以单因素实验结果为依据，使用Design Expert 10实验设计软件，以凝胶温度为响应值，在三因素上对制备原位温敏性凝胶的浓度进行优化。

表6 响应面实验中测得的胶凝温度

确定最优处方空白凝胶：由单因素和响应面实验数据可知，胶凝温度最接近于体温的空白凝胶处方为1.295ml 5%泊洛沙姆188与3.705ml 21.4%泊洛沙姆407。分别精密称取1.25g泊洛沙姆188、10.7g泊洛沙姆407溶解于25、50ml烧杯中，待药品完全溶解后定容，并在4℃下溶胀12h。按照最优处方用移液器分别量取溶液混合于7ml西林瓶中，冰浴条件下在集热式恒温加热磁力搅拌器以20r/min的条件下搅拌15min,使两者混合均匀、静置，测得胶凝温度为35.9℃，符合实验要求，因此，在接下来进行的实验中使用该处方的空白凝胶。

载药凝胶的制备：每5ml白藜芦醇用量分别设置为0.0005、0.0010、0.0015 g ，分别精密称取 0.0005、0.0010、0.0015 g 白藜芦醇于 7 ml西林瓶中，加入5ml最优处方空白凝胶，按照上述方法使两者混合均匀、静置，即得0.0001、0.0002、0.0003 g/ml白藜芦醇原位凝胶。

本发明还提供一种白藜芦醇原位凝胶的表征方法，应用于以上所述的白藜芦醇原位凝胶，所述方法包括：

测定胶凝温度：设定好恒温水浴锅，将西林瓶放置其中，调节水温温度每升高1℃，倾斜西林瓶观察白藜芦醇原位凝胶的流动性，直至白藜芦醇原位凝胶完全不再流动，即为胶凝温度；将最优处方空白凝胶以及白藜芦醇含量分别为0.0001g/ml、0.0002g/ml、0.0003g/ml的白藜芦醇原位凝胶测定胶凝温度，记录温度，每个样品测3次，取平均值。

测定凝胶时间：将盛装最优处方空白凝胶和白藜芦醇含量为0.0003 g/ml的白藜芦醇原位凝胶的西林瓶放置于25℃恒温水浴锅中，待稳定后迅速转移到37℃恒温水浴锅中开始计时，记录白藜芦醇原位凝胶从流动到完全不流动所需时间，即为胶凝时间，每个样品测3次，取平均值。

测定凝胶pH：配置25ml最优处方空白凝胶以及白藜芦醇含量为0.0003 g/ml的白藜芦醇原位凝胶，冰浴条件下在集热式恒温加热磁力搅拌器以20r/min的条件下搅拌15min,使两者混合均匀、静置，将pH值测量仪的探头伸入到溶液中，待pH值稳定后读取数据。

标准曲线的制备：称取白藜芦醇标准品10.0mg置于50 mL容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再取3mL稀释后的溶液于25mL容量瓶中用甲醇定容得到第一标准液，吸取第一标准液0、1、2、3、4、5mL,再次分别定容25mL得到5组第二标准液，将以上5组第二标准液逐一测其在306nm处的吸光值，测定3次，求平均值，绘制标准曲线。

样品含量的测定：用50毫升容量瓶装取1.5g白藜芦醇原位凝胶，用甲醇溶解并稀释至刻度，使其混合均匀摇匀；再取摇匀后的溶液3mL于25mL容量瓶中用甲醇定容得到第三标准液，吸取第三标准液2mL,再次定容25mL，用甲醇溶解并稀释至刻度；在306nm波长处测定吸光度，代入标准曲线回归方程，计算白藜芦醇的含量。

测定凝胶粘度：使用NDJ-8S黏度计，采用号3转子，转速为 60rpm/min，黏度范围：10-200000mPa.s，将最优处方空白凝胶和白藜芦醇原位凝胶分别放进待测样品瓶中，保持溶液的液面没至转子的液面刻度线，测定25℃和37℃时的黏度，每个样品测 3 次，取平均值。

测定凝胶溶蚀时间：先称10mL西林瓶的空瓶重，加入白藜芦醇原位凝胶5g，置于37.0±0.1℃的水浴恒温振荡器中平衡10min，使聚合物溶液完全形成凝胶；取出凝胶，加入37℃、1mL的磷酸盐缓冲溶液PBS，pH=7.4，作为释放介质，再放入水浴恒温振荡器中，在37.0±0.1℃下，以 40r/min 的速率振荡，在设定的时间内倾出全部释放介质，将瓶擦干后称重；然后重新放入水浴恒温振荡器中平衡10min，再补充1mL 、37℃的PBS 溶液，按此步骤反复，直到剩余凝胶量小于起始量的10%，每个实验设置 3 个平行组，记录溶蚀时间，取其平均值。

载白藜芦醇原位凝胶的稳定性考察：将2份白藜芦醇含量为0.0003 g/ml的白藜芦醇原位凝胶分别于25℃和 37℃条件下静置15min，然后以2000r/min离心15min，观察是否有分层等不稳定现象。

实验数据分析。

响应面数据：

根据实验数据，Design Expert 10软件预测出最优处方为1.295ml 5%泊洛沙姆188与3.705ml 21.4%泊洛沙姆407。其公式为：凝胶温度=+37.84+0.75A-6.75B+3.00C-0.10AB-0.20AC-0.65BC+0.26A2+3.11B2-0.25C2。图3为自变量A、B与因变量凝胶温度的效应面图。图4为自变量A、B与因变量凝胶温度的等高线图。

凝胶相变温度：

实验数据表明，白藜芦醇含量为0.0015mg的凝胶相变温度适宜，符合在室温下为流动的液体，在体温下发生相变形成凝胶的要求。图5为不同用药剂量时的胶凝温度图。

表7 不同用药剂量时的胶凝温度

胶凝时间：

经测得，空白凝胶的胶凝时间分别为262s、259s、264s，白藜芦醇用量为0.0015g凝胶的胶凝时间分别为230s、229s、232s。

凝胶pH：

空白凝胶pH值为7.15，白藜芦醇含量为0.0075的凝胶pH为7.12，符合应用于人体的条件，因此实验所得的凝胶可作为一种良好的给药基质。

白藜芦醇标准曲线测定结果：图6为白藜芦醇标准曲线折线图。由图6可知白藜芦醇标准曲线回归方程:A=0.1283C+0.4682（R2=0.9927），线性范围为0.5～5.0μg/ml。

凝胶载药量的测定结果：

白藜芦醇含量为0.0015g的凝胶在306nm波长下测得吸光值为，将吸光值带入上图标准曲线中，经计算凝胶的载药量为0.09%，包封率为60%。

载药量=凝胶中白藜芦醇总量/凝胶体积 ×100%

包封率=实际载药量/理论载药量 ×100%

凝胶粘度的测定结果：

表8 不同温度时的粘度

凝胶溶蚀时间的测定结果：

根据无膜溶出法测得的该凝胶体外溶蚀时间为5.6h，溶蚀率为91.1%。

实验现象分析：

载白藜芦醇原位凝胶的外观，载白藜芦醇原位凝胶室温时外观呈现白色透明液体态，达到胶凝温度后外观为白色透明凝胶态。

载白藜芦醇原位凝胶的稳定性：

白藜芦醇原位凝胶溶液在 25℃和37℃胶凝后经离心不发生分层浑浊等现象，表示该制剂有良好的稳定性。

综上所述，白藜芦醇对肺癌的治疗效果很好，但其水溶性差的缺点导致其不能较好的应用于临床治疗中。本发明以多种高分子材料为基质制备的凝胶剂用以包载白藜芦醇,使用泊洛沙姆作为缓释凝胶的基质，因为其毒性很低，生物相容性较好等。前文通过单因素实验和响应面实验已确定了载药凝胶的最优处方，通过参考白藜芦醇抑制肿瘤细胞的相关文献，确定加药量，处方为：3.705ml 21.4%泊洛沙姆407与1.295ml 5%泊洛沙姆188，白藜芦醇含量为0.3mg/ml。制备出来的凝胶胶凝温度为36.4℃，胶凝时间为230s。

该种凝胶pH值以及胶凝温度均符合应用于人体的要求。

以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。