一种防腐消炎脂质体及其制备方法
阅读说明：本技术 一种防腐消炎脂质体及其制备方法 (Antiseptic and anti-inflammatory liposome and preparation method thereof ) 是由 卢永杰 程路诗 张炽坚 张兵 江桦 关焕敏 艾勇 何廷刚 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及脂质体技术领域,尤其涉及一种防腐消炎脂质体及其制备方法。本发明公开了一种防腐消炎脂质体,该脂质体使用马齿苋植物提取水作为制备脂质体的原料之一,使得获得的脂质体具有天然防腐和消炎的功效,无需额外添加防腐剂来保存脂质体。此外,该脂质体不使用有毒有害有机溶剂,使得生产过程安全环保,使得脂质体安全性高。(The invention relates to the technical field of liposome, in particular to an antiseptic and anti-inflammatory liposome and a preparation method thereof. The invention discloses a preservative and anti-inflammatory liposome, which uses purslane plant extract water as one of raw materials for preparing the liposome, so that the obtained liposome has natural preservative and anti-inflammatory effects, and no preservative is required to be additionally added for preserving the liposome. In addition, the liposome does not use toxic and harmful organic solvents, so that the production process is safe and environment-friendly, and the liposome is high in safety.)
技术领域
本发明涉及脂质体
技术领域
，尤其涉及一种防腐消炎脂质体及其制备方法。背景技术
近年来，脂质体的应用越来越备受关注，在生物医学、化妆品、保健食品等领域得到广泛的应用。但脂质体不易保存，大多需额外添加化学防腐剂来保存脂质体，增加了产品的安全风险。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种防腐消炎脂质体及其制备方法，该脂质体具有天然防腐功效，不需额外添加防腐剂，产品安全性高。
本发明提供了一种防腐消炎脂质体，按质量百分数计，包括以下组分：
磷脂2～15％；
药物0.01～5％；
胆固醇0～5％；
余量为马齿苋植物提取水；
所述药物包括脂溶性药物。
马齿苋(Portulaca oleracea Linn.)系马齿苋科马齿苋属肉质草本植物，别名马齿草、五星草、长命草、长寿菜等，广布全世界温带和热带地区，是我国卫生部划定的78种药食同源的野生植物之一，为我国药典所收藏。本发明将马齿苋植物提取水作为制备脂质体的原料之一，使得获得的脂质体具有天然防腐和消炎的功效，无需额外添加防腐剂来保存脂质体。
本发明提供的防腐消炎脂质体不使用有毒有害有机溶剂，使得生产过程安全环保，使得脂质体安全性高。
优选地，按质量百分数计，
磷脂 2～10％；
药物 0.01～4％；
胆固醇 0～4％；
余量为水。
更优选地，按质量百分数计，
磷脂 2～8％；
药物 0.1～3％；
胆固醇 0～3％。
本发明中，所述马齿苋植物提取水由马齿苋在低温真空条件下蒸馏得到。所述蒸馏的温度为30～50℃，压力为-70～-90kPa，时间为5～8h。
本发明中，按质量百分数计，所述防腐消炎脂质体的制备原料还包括：0.1～20％表面活性剂，优选为0.1～15％，更优选为0.1～8％。
所述表面活性剂为离子型表面活性剂和/或非离子型表面活性剂，其中阳离子表面活性剂包括季铵盐类，阴离子表面活性剂包括高级脂肪酸盐类或硫酸酯盐类，非离子表面活性剂包括吐温、司盘、PEG脂肪酸酯和聚甘油-10-硬肪酸酯中的一种或两种以上。
本发明中，按质量百分数计，所述防腐消炎脂质体的制备原料还包括：5～60％多元醇，优选为5～45％，更优选为5～30％。
所述多元醇包括甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇和异戊二醇的一种或多种。
所述磷脂包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷酰胆碱、二棕榈酰磷酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或两种以上。
所述脂溶性药物包括：光甘草定、神经酰胺、白藜芦醇和脂溶性维生素中的一种或两种以上，优选为光甘草定。本发明发现，光甘草定与马齿苋植物提取水复配可以协同增强脂质体的抗炎效果。
所述药物还包括：水溶性药物。所述水溶性药物包括透明质酸钠、纳米金属胶体分散液和水溶性维生素中的一种或两种以上。
当药物为脂溶性药物和水溶性药物时，本发明对两者的用量比不做具体限定。
本发明还提供了上述防腐消炎脂质体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将磷脂、胆固醇、药物与马齿苋植物提取水混合，形成悬浊液；
步骤2：将所述悬浊液在加热保温状态下进行高速剪切，得到防腐消炎脂质体乳液。
本发明将磷脂、难溶性药物与马齿苋植物提取水混合，得到悬浊液，在适当的温度下，通过高速剪切进行分散，磷脂和难溶性药物被粉碎，形成微米尺度。在微米尺度下，经长时间剪切，难溶性药物颗粒跟磷脂颗粒相互作用，发生乳化，并接着自组装形成微米级脂质体。
本发明提供的防腐消炎脂质体的制备设备和过程简单，且适合大规模生产，提高生产效率。
本发明步骤1所述进行混合前，还包括：加入表面活性剂。表面活性剂的加入可以促进脂溶性药物的增溶。
步骤1所述进行混合前，还包括：加入多元醇。多元醇的加入可以进一步促进部分脂溶性药物的溶解。
本发明步骤2中，所述悬浊液的加热温度需达到磷脂的相变温度以上。所述加热的温度为50℃～100℃，优选为50～70℃；然后保持加热温度进行剪切，所述剪切采用剪切分散机；所述剪切的速率为8000～20000rpm(转子直径为13mm)，剪切的时间为30min以上，优选在8000～15000rpm(转子直径为13mm)的剪切速率下剪切60min以上，更优选剪切60～90min。经剪切后得到的脂质体为微米级。
纳米级别的脂质体分散性和稳定性较好，皮肤渗透性较佳。因此，本发明步骤2所述进行高速剪切后，还包括：高压均质。高压均质可以将微米级的脂质体进行粉碎细化得到纳米级脂质体。所述高压均质具体为：在400bar、600bar、800bar、1000bar压力下各循环2次或以上。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种防腐消炎脂质体，该脂质体使用马齿苋植物提取水作为制备脂质体的原料之一，使得获得的脂质体具有天然防腐和消炎的功效，无需额外添加防腐剂来保存脂质体。此外，该脂质体不使用有毒有害有机溶剂，使得生产过程安全环保，使得脂质体安全性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例2步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图2为本发明实施例3步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图3为本发明实施例4步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图4为本发明实施例5步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图5为本发明实施例6步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图6为本发明实施例7步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图7为本发明实施例9步骤1制得的乳液中脂质体的光学显微镜图(标尺为3微米)；
图8为本发明试验例3提供的IL-1含量测试结果图；
图9为本发明试验例3提供的FLG含量测试结果图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中的试剂均为市购。
其中，实验型高速均质分散机：德国IKA公司。
实验型高压均质机：苏州ATS公司。
Zeta纳米粒度仪：英国马尔文公司。
试剂：
大豆卵磷脂：PC≥95％，Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
光甘草定：HPLC纯度≥90％，青海湖药业有限公司。
胆固醇：纯度＞96％，Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
聚甘油-10-硬脂酸酯：日光化学贸易(上海)有限公司。
丁二醇：纯度＞98％，日本大赛璐株式会社。
实施例1
本实施例为马齿苋提取水的制备，具体制备步骤如下：
选取新鲜的马齿苋为原料，不添加任何外来水分和溶剂，利用低温真空条件(提取温度为35℃，提取压力为-90kPa，提取时间为6h)，将植物内水分和其他挥发性物质蒸馏，提取得到马齿苋提取水。
实施例2
本实施例为防腐消炎脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、光甘草定和胆固醇加入到处方量的马齿苋提取水中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的防腐消炎脂质体。
从图1可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
实施例3～5
本实施例为防腐消炎脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、光甘草定和胆固醇加入到处方量的马齿苋提取水中，60℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切60min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的防腐消炎脂质体。
从图2～4可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
实施例6
本实施例为防腐消炎脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的马齿苋植物提取水中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的防腐消炎脂质体。
从图5可以看出，经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
实施例7～8
本实施例为防腐消炎脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的马齿苋提取水和丁二醇混合液中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的防腐消炎脂质体。
从图6可以看出，实施例7经步骤1高速剪切后，步骤1乳液中可以观察到类似脂质体的多层球状结构。
实施例9
本实施例为防腐消炎脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的马齿苋提取水中，60℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切60min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的防腐消炎脂质体。
实施例10
本实施例为防腐消炎脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的马齿苋植物提取水和丁二醇混合液中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速8000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的防腐消炎脂质体。
实施例11
本实施例为防腐消炎脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的马齿苋植物提取水和丁二醇混合液中，60℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的防腐消炎脂质体。
实施例12
本实施例为防腐消炎脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的马齿苋植物提取水和丁二醇混合液中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切60min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的防腐消炎脂质体。
实施例13
本实施例为防腐消炎脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的马齿苋植物提取水和丁二醇混合液中，50℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切90min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的防腐消炎脂质体。
对比例1
本实施例为脂质体的制备配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水中，60℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切60min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到均匀的脂质体。
对比例2～3
本对比例为脂质体的制备，配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇溶于200g甲醇-氯仿(质量比为62:38)，得到澄清透明溶液，旋转蒸发去除有机溶剂，得到薄膜。
(2)将步骤(1)得到的薄膜置于60℃的水浴中，搅拌下加入处方量的马齿苋植物提取水和丁二醇混合溶液，得到粗的乳状液。将粗乳状液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到脂质体。
对比例4
本对比例为脂质体的制备，配方见表1，具体制备步骤如下：
(1)将磷脂(PC95％)、聚甘油-10-硬脂酸酯、光甘草定和胆固醇加入到处方量的水和丁二醇混合液中，30℃水浴加热，使用实验型IKA高速剪切分散机在转速10000rpm下高速剪切30min，得到均一的乳液。
(2)将步骤(1)得到的均一乳液经高压均质，400/600/800/1000bar压力下各循环2次，得到透明均匀的脂质体。
表1 实施例和对比例配方
试验例1
使用PBS作为分散剂分散实施例9和对比1制得的脂质体，使用Zeta纳米粒度仪测定平均粒径；采用超滤离心管分离包封和游离的光甘草定，使用HPLC检测光甘草定含量并计算包封率。测试结果表2。
由表2的结果可知，大部分实施例制得的防腐消炎脂质体在外观、平均粒径、光甘草定含量上与对比例2～3薄膜法制得的脂质体基本无差异，说明采用本发明实施例的制备方法获得的脂质体的性能与薄膜法制得的脂质体的性能基本一致。实施例9相比于对比例1制得的光甘草定脂质体在外观、平均粒径、光甘草定含量上基本无差异，说明实施例使用马齿苋植物提取水代替纯水制得脂质体的效果基本一致，可替代纯水作为溶剂。对比例4的脂质体制备方法制得的光甘草定脂质体在外观呈黄色浑浊状态，存在不溶颗粒；样品粒径较大，光甘草定药物包封率显著降低，说明当温度不足时，磷脂相未能充分转变为液晶相，光甘草定等脂溶性药物难以与磷脂分子发生充分作用，导致粒径增大，包封率降低，降低脂质体制剂的品质。
表2 实施例和对比例光甘草定脂质体的表征数据
试验例2
对实施例和对比例制得的脂质体进行防腐挑战测试。
接种一定数量的细菌和真菌，间隔0天、7天、14天、21天、28天按照美国药典USP32<51>微生物防腐功效测试的检测方法检测微生物数量变化情况，测试结果如表3所示。
按国标GB7918.2-87《化妆品微生物标准检验方法》进行微生物检测，测试结果如表4所示。
从表3和表4可知，实施例制得的马齿苋植物提取水光甘草定脂质体可以抑制微生物的生长，具有一定的防腐效果。
表3 实施例和对比例脂质体的防腐挑战测试结果
表4
试验例3
对实施例9和对比例1制得的脂质体，进行动物皮肤过敏模型对样品的抗炎能力的检测评价。
实验方法：
对5周龄SPF级小鼠适应性饲养1周，使用脱毛膏去除小鼠背部皮肤。小鼠分为空白组、模型组、阳性组、光甘草定脂质体组(对比例1)、光甘草定脂质体复配马齿苋提取水组(实施例9)、马齿苋提取水组。
给药阶段每天给药一次，空白组和模型组在小鼠背部涂抹丙二醇(200uL/只)；阳性组在小鼠背部涂抹0.5％透明质酸钠的丙二醇溶液(200uL/只)；光甘草定脂质体组在小鼠背部涂抹对比例1制得的样品(200uL/只)；光甘草定脂质体复配马齿苋提取水组在小鼠背部涂抹实施例9制得的样品(200uL/只)；马齿苋提取水组在小鼠背部涂抹马齿苋提取水(200uL/只)。以上组别一天给药一次，为期七天。
给药第七天时，建立组胺诱导的急性瘙痒小鼠模型。所有组别先进行给药，阳性组以腹腔注射方式给与盐酸苯海拉明(生理盐水溶液，剂量为2mg/ml/10g)。所有组别给药结束30min后，除空白组外，其他组别以腹腔注射方式给与组胺(生理盐水溶液，剂量为1mg/ml)100uL，之后以颈椎脱臼法处死小鼠，取背部皮肤组织于多聚甲醛中固定及冻存。将各组小鼠经解剖采集的皮肤组织，制备组织匀浆，按ELISA试剂盒说明书的方法检测IL-1(白介素-1)和FLG(丝聚蛋白)的含量。
丝聚蛋白(Filaggrin，FLG)、白细胞介素1(IL-1)在皮肤炎症的病理机制中发挥着重要的作用，Filaggrin是角质层重要的成分,有角质形成细胞合成，分布在角质层的不同部分，并随角质形成细胞迁移过程逐渐被酶降解，降解为天然保湿因子等角质层需要的小分子物质，在保湿、屏障完整性方面发挥重要的作用。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。
如图8所示，对于IL-1含量，模型组比空白组显著升高，说明注射组胺药物后，皮肤的炎症产生，引起IL-1含量升高。而阳性组、样品组均能将IL-1含量降低，说明起到一定抗炎的作用，而复配马齿苋提取水后的光甘草定脂质体抗炎效果更加显著。如图9所示，对于FLG蛋白含量，模型组比空白组显著降低，说明注射组胺药物后，皮肤炎症产生引起FLG降低。阳性组和样品组均能抵抗由炎症引起的FLG蛋白含量减少，说明起到抗炎的作用，而复配马齿苋提取水后的光甘草定脂质体抗炎效果更好。
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
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