一种以马蓝鲜叶为原料制备青黛的方法
阅读说明：本技术 一种以马蓝鲜叶为原料制备青黛的方法 (Method for preparing indigo naturalis from fresh leaves of kalanchoe ) 是由 赵亮 刘兆宇 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：一种以马蓝鲜叶为原料制备青黛的方法,其特征在于,包括以下步骤：(1)浸泡液预处理；(2)浸泡发酵；(3)打靛-靛合成；(4)粗靛精制；(5)制备成品。通过对叶柄、马蓝老枝浸泡液预处理,提前使马蓝叶内微生物增殖能缩短马蓝鲜叶浸泡时间,提前处理浸泡液能缩短青黛生产周期,及提高青黛转化率,通气搅拌使溶液中氧气含量增加,促进靛前体物质转化为生成靛蓝、靛玉红的中间体,增加靛蓝靛玉红的含量,利用NaOH调节PH可以减少碳酸钙的用量,便于青黛后期除杂纯化,提高青黛得率。(A method for preparing indigo naturalis by taking fresh leaves of India tinctoria as a raw material is characterized by comprising the following steps: (1) pretreating a soaking solution; (2) soaking and fermenting; (3) performing beat indigo-indigo synthesis; (4) refining crude indigo; (5) and preparing a finished product. Through pretreatment of a petiole and a Chinese cabbage old branch soaking solution, microbial proliferation in a Chinese cabbage leaf can be shortened through the pretreatment, the Chinese cabbage fresh leaf soaking time can be shortened through the pretreatment of the petiole and the Chinese cabbage old branch soaking solution, the natural indigo production period can be shortened through the pretreatment of the Chinese cabbage old branch soaking solution, the natural indigo conversion rate can be improved through the pretreatment of the Chinese cabbage fresh leaf soaking solution, the oxygen content in the solution is increased through aeration and stirring, the indigo precursor substance is promoted to be converted into an intermediate for generating the natural indigo and the indirubin, the content of the indigotin indirubin is increased, the use amount of calcium carbonate can be reduced through the regulation of PH.)
技术领域
本发明属于天然产物提取领域，具体涉及一种以马蓝鲜叶为原料制备青黛的方法。
背景技术
青黛，中药名。为爵床酬科植物马蓝、蓼科植物蓼蓝、十字花科植物菘蓝的叶或茎叶经加工制得的干燥粉末、团块或颗粒。具清热解毒、凉血消斑，泻火定惊等作用，在古代亦常用于印染布匹、画眉等。主产于福建、云南、江苏等地。性味咸寒，有清热解毒，凉血消斑，泻火定惊等功效。其主要用于温病热盛，斑疹，吐血、咯血，咽痛口疮，小儿惊痫，疮肿，丹毒，蛇虫咬伤等。
青黛由“蓝”加工制成,在上千年的应用历史中,积累了大量而丰富的加工及应用经验,青黛靛蓝逐渐由染料发展为药用,而“蓝”也由制青的原料发展为制靛的原料。青黛的传统炮制主要包括浸泡、打靛、精制等三环节，其炮制过程主要是将蓝类植物新鲜叶或茎叶中的吲哚苷、靛红烷B等前体物质转化为靛蓝、靛玉红等有效成分。传统的炮制方法为：在秋季收割茎叶，将其置于浸泡池内，引入河水，将其完全淹没，浸泡发酵数日，待池液呈污绿色时，捞去残渣，投入石灰，充分搅拌，静置1至2日，弃去上清液，收集底部的沉淀物移至小池中，静置、再弃去上清液，得到半成品——粗靛。粗靛再经过水飞、泡沫浮选等除杂精制过程，干燥后即得青黛。[贾思勰.齐民要术.卷五[M].缪启愉校释，缪桂龙参校.北京：农业出版社，1982：53.][宋应星.天工开物[M].北京：商务印书馆，1954：12.]专利申请号：200310110926.8，发明名称：“青黛炮制的现代化生产方法”的专利申请公开了一种以天然植物马蓝的叶或茎叶炮制粗靛的现代化生产方法：浸泡环节将切制后的马蓝茎叶，按照1∶10～1∶30的比例加入经预处理过的浸泡用水，浸泡发酵至浸泡液变成污绿色为止，浸泡用水的温度为20～50℃，浸泡时间为24～72h后过滤除茎叶碎片；制粗靛环节按生石灰用量与马蓝量的比值为10∶1的比例加入生石灰，调成石灰乳，将其引入上述已除杂的浸泡发酵液中，并用搅拌器充分搅拌，同时在搅拌过程中通过对溶液酸碱度的测试进而增减生石灰的用量，至1小时后观察溶液有蓝靛成线状沉淀为止；或者使用鼓风机或空气压缩机将空气直接通入浸泡发酵池中，直至有蓝靛成线状沉淀生成为止。其中，所述的酸碱度的测试，是指一方面在搅拌过程中注意观察池内溶液的颜色变化，若由绿色变为蛋黄色说明石灰用量已适度；另一方面，为稳重起见，还须经口尝味道加以验证，感到先苦后带甜是碱性适度，即pH值为12～13。
浸泡水解环节以微生物发酵为起，微生物在适宜的温度、值等条件下大量繁殖,发酵分泌出的糖化酶使吲哚苷的苷键发生酶解断裂，青黛的浸泡过程中微生物代谢过程属于杂菌发酵,即利用自然条件下存在的微生物进行发酵的方法,没有人为加入微生物菌种,必须要花很长的时间才能能够产生葡萄糖苷酶的。产生β葡萄糖苷酶的微生物有嗜热菌β、木霉、黑曲霉等。黑曲霉是一种纤维素酶，能加速分解马蓝叶细胞壁的，使植物体细胞内前体物质溶出。马蓝老枝及叶柄比叶片细胞木质化程度大，微生物酶分解细胞是靛物质溶出浸泡液需更长时间。进而预处理能增加产量。
浸泡过程是整个青黛生产过程中的重要部分,它直接影响前体物质的溶出效果，及前体物质到靛蓝、靛玉红的转化。关系到产品的产量和质量。目前青黛制备工艺在这个过程花费了大量的时间,却常常不能充分地利用原料,造成了大量的浪费。浸泡用水量、浸泡时间等对粗靛质量和产量有着至关重要的影响,。青黛主要有效成分靛蓝、靛玉红由前体物质转化，需要借助微生物产生的酶的作用。马蓝叶柄及老枝含靛前体量少，提前使马蓝叶内微生物增殖能缩短马蓝鲜叶浸泡时间，研究表明浸泡时间增长，青黛中靛蓝、靛玉红含量下降。因此提前处理浸泡液能缩短青黛生产周期，及提高青黛产量。
另外，青黛制备过程中浸泡时间、温度、pH及打靛工艺条件都会影响靛蓝、靛玉红产生的，炮制工艺难以规范，导致青黛成品质量参差不齐，影响了临床疗效的发挥。结合传统炮制方法，建立规范化、现代化的青黛加工过程量化，促进青黛标准制定工作，即通过对药材生产全过程加工的规范管理得到质量稳定的青黛，保证青黛标准制定的科学性和合理性。
发明内容
基于上述背景技术中的不足本发明拟公开一种以马蓝鲜叶为原料制备青黛的方法，增加青黛的提取效率。
通过对叶柄、马蓝老枝浸泡液预处理，青黛主要有效成分靛蓝、靛玉红由前体物质转化，需要借助微生物产生的酶的作用。马蓝叶柄及老枝含靛前体量少，提前使马蓝叶内微生物增殖能缩短马蓝鲜叶浸泡时间，浸泡时间增长，青黛中靛蓝、靛玉红含量下降，因此提前处理浸泡液能缩短青黛生产周期，及提高青黛产量。
浸泡水解环节以微生物发酵为起，微生物在适宜的温度、值等条件下大量繁殖,发酵分泌出的糖化酶使吲哚苷的苷键发生酶解断裂，青黛的浸泡过程中微生物代谢过程属于杂菌发酵,即利用自然条件下存在的微生物进行发酵的方法,没有人为加入微生物菌种,必须要花很长的时间才能能够产生葡萄糖苷酶的。产生β葡萄糖苷酶的微生物有嗜热菌β、木霉、黑曲霉等。黑曲霉是一种纤维素酶，能加速分解马蓝叶细胞壁的，使植物体细胞内物质溶出。
马蓝老枝及叶柄比叶片细胞木质化程度大，微生物酶分解细胞是靛物质溶出浸泡液需更长时间。进而预处理能增加产量。
通气搅拌使溶液中氧气含量增加，促进靛前体物质转化为生成靛蓝、靛玉红的中间体，增加靛蓝靛玉红的含量。传统工艺通过添加石灰乳使浸泡液成碱性，石灰乳另一个作用是生成碳酸钙，是靛蓝靛玉红吸附载体于沉降，利用NaOH调节PH可以减少碳酸钙的用量，便于青黛后期除杂纯化。
本发明是通过以下工艺步骤来实现的：
一种以马蓝鲜叶为原料制备青黛的方法，包括以下步骤：(1)浸泡液预处理；(2)浸泡发酵；(3)打靛-靛合成；(4)粗靛精制；(5)制备成品。
作为优选，工艺的具体步骤为：
(1)浸泡液预处理：将去离子水与马蓝叶柄、马蓝老枝按照重量比为10-15:1-3：1-3进行混合，破碎至100-200目的混合液，置于发酵罐内发酵2-3天；
(2)浸泡发酵：称取步骤(1)中浸泡液重量比10％-15％的新鲜马蓝叶，冲洗干净，切碎破碎至1-2cm，加入到步骤(1)发酵后的浸泡液中，加碱调节PH至5.5，30℃浸泡12h，2小时搅拌一次，浸泡发酵完成后，浸泡液过筛网滤过除杂；
(3)打靛-靛合成：步骤(2)得到的滤液中加NaOH调节滤液pH、通氧、加入沉淀剂，搅拌打靛40min后，静止至沉淀，上层液重过滤回收；
(4)粗靛精制：将沉淀加2倍水，用搅拌机碾碎洗涤，滤膜过滤除杂，离心机离心脱水得靛膏；
(5)制备成品：靛膏，60℃干燥，粉碎过100目筛，得青黛。
作为优选，步骤(3)中所述调节滤液pH为调至10.5，通氧为通空气1h，所述沉淀剂为加入4％新制的石灰乳。
本发明的有益效果
(1)通过对叶柄、马蓝老枝浸泡液预处理，提前使马蓝叶内微生物增殖能缩短马蓝鲜叶浸泡时间，提前处理浸泡液能缩短青黛生产周期，及提高青黛转化率。
(2)通气搅拌使溶液中氧气含量增加，促进靛前体物质转化为生成靛蓝、靛玉红的中间体，增加靛蓝靛玉红的含量，利用NaOH调节PH可以减少碳酸钙的用量，便于青黛后期除杂纯化，提高青黛得率。
具体实施方式
实施例1
不同浸泡处理及发酵时间对青黛制备的影响
在马蓝鲜叶发酵过程中，原料浸泡条件及浸泡时间是影响青黛质量和产量的关键因素。适宜的温度下，浸泡时间过短发酵不充分，浸泡时间过长青黛主要有效成分靛蓝靛玉红降解及靛前提物质转化为其他靛类物质。适当提高温度能缩短发酵时间，过高温度会影响微生物生殖及酶的活性，从而影响靛前体物质生成靛蓝、靛玉红。根据发酵原理、资料分析试验，为科学规范化生产，马蓝鲜叶发酵在30度，搅拌半透氧下进行。
本实施例对浸泡液预处理对青黛产率及质量的影响。称取九月份采收的10份马蓝鲜叶，每份1kg，清洗干净，切制成1.5CM。5组分别30度下30水浸泡12、24、36、48、72小时。
另五组用提前用新鲜马蓝叶柄及老枝浸泡3天的30倍浸泡液30度下浸泡4、8、12、24、36小时。1小时搅拌一次，浸泡液筛网滤过除杂。加NaOH调节滤液pH至10.5，通空气1h后，加入4％新制的石灰乳，搅拌打靛40min后，静止沉淀，上层液过滤回收，合并沉淀。RP-HPLC法检测产品靛蓝靛玉红得率。
表1不同发酵时间对靛蓝、靛玉红产率影响
发酵时间(h)
靛蓝(g/kg)
靛玉红(g/kg)
马蓝叶鲜品
0.48
4.15
12
3.45
3.86
24
8.84
4.35
36
12.57
5.04
48
15.82
5.58
72
14.73
5.12
表2浸泡液预发酵处理后不同发酵时间对靛蓝、靛玉红产率影响
各组的原药材重量以鲜品计算。从表1和表2的数据发现，采用常规马蓝鲜叶浸泡发酵，30度温度条件下，浸泡最优时间为48h,靛蓝和靛玉红的产率分别为16.32g/kg、5.58g/kg。采用预浸泡液发酵处理后再将马蓝鲜叶浸泡发酵，30度温度条件下，最优浸泡时间为12h,靛蓝和靛玉红的产率分别17.28g/kg、6.27g/kg，比常规发酵节约36h,并且能提高靛蓝靛玉红含量。因此采用新鲜马蓝叶柄及老枝提前发酵，无需另外增加成本达到缩短生产周期，提高产量和生产效率。
实施例2
老枝中靛蓝靛玉红含量
称取九月份采收的1kg马蓝老枝3份，清洗干净，切制成1-2CM。3组分别30度下30水浸泡48、72、84小时。1小时搅拌一次，浸泡液筛网滤过除杂。加NaOH调节滤液pH至10.5，通空气1h后，加入4％新制的石灰乳，搅拌打靛40min后，静止沉淀，上层液过滤回收，合并沉淀。RP-HPLC法检测产品靛蓝靛玉红得率。
表3检测产品靛蓝靛玉红得率
实施例3
通氧对制备青黛影响(提高靛蓝靛玉红产量)
采用实例1中最优浸泡发酵方式，用1kg马蓝用提前用叶柄老枝发酵过的浸泡液30度浸泡12h。1小时搅拌一次，浸泡液筛网滤过除杂。加NaOH调节滤液pH至10.5，通空气1h后，加入4％新制的石灰乳，搅拌打靛40min后，静止沉淀，上层液过滤回收，沉淀碾碎加2倍水搅拌洗涤，离心过滤除杂，滤渣60℃干燥，粉碎过100目筛，得成品青黛181.33g,靛蓝和靛玉红在青黛中含量分别9.37％，2.89％。
采用实例1中最优浸泡发酵方式，用1kg马蓝用提前用叶柄老枝发酵过的浸泡液30度浸泡12h。1小时搅拌一次，浸泡液筛网滤过除杂。加NaOH调节滤液pH至10.5，不通气加入4％新制的石灰乳，搅拌打靛40min后，静止沉淀，上层液过滤回收，沉淀碾碎加2倍水搅拌洗涤，离心过滤除杂，滤渣60℃干燥，粉碎过100目筛，得成品青黛148.75g,靛蓝和靛玉红在青黛中含量分别6.54％，1.72％。
实施例4
碱调PH制备青黛(碳酸钙含量较高)
采用实施例中最优浸泡发酵方式，用1kg马蓝用提前用叶柄老枝发酵过的浸泡液30度浸泡12h。1小时搅拌一次，浸泡液筛网滤过除杂。加NaOH调节滤液pH至10.5，通空气1h后，加入4％新制的石灰乳，搅拌打靛40min后，静止沉淀，上层液过滤回收，沉淀碾碎加2倍水搅拌洗涤，离心过滤除杂，滤渣60℃干燥，粉碎过100目筛，得成品青黛181.33g,靛蓝和靛玉红在青黛中含量分别9.37％，2.89％。
采用实例1中最优浸泡发酵方式，用1kg马蓝用提前用叶柄老枝发酵过的浸泡液30度浸泡12h。1小时搅拌一次，浸泡液筛网滤过除杂。通空气1h后，加入12％新制的石灰乳，搅拌打靛40min后，静止沉淀，上层液过滤回收，沉淀碾碎加2倍水搅拌洗涤，离心过滤除杂，滤渣60℃干燥，粉碎过100目筛，得成品青黛353.28g,靛蓝和靛玉红在青黛中含量分别4.15％，1.22％。
实施例5
采用实施例1中最优浸泡发酵方式，用1kg马蓝用提前用叶柄老枝发酵过的浸泡液30度浸泡12h。1小时搅拌一次，浸泡液筛网滤过除杂。加NaOH调节滤液pH至10.5，通空气1h后，加入4％新制的石灰乳，搅拌打靛40min后，静止沉淀，上层液过滤回收，沉淀碾碎加2倍水搅拌洗涤，离心过滤除杂，滤渣60℃干燥，粉碎过100目筛，得成品青黛181.33g,检测青黛中靛蓝和靛玉红的含量，得到靛蓝和靛玉红的含量分别9.37％，2.89％。
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