一种预防和/或治疗宠物肝损伤的组方及其制备和应用
阅读说明：本技术 一种预防和/或治疗宠物肝损伤的组方及其制备和应用 (Formula for preventing and/or treating liver injury of pets and preparation and application thereof ) 是由 苏荣胜 白雨曼 谢文婷 黄健佳 周水莲 邱文粤 王荣梅 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种预防和/或治疗宠物肝损伤的组方及其制备和应用。该组方包含以下重量份的各组分：猪苓8～15份、当归8～15份、黄芩7～9份、柴胡7～9份、黄柏7～9份、金银花8～15份、白芍8～15份、丹参7～9份、川芎8～15份,诸药相合,养肝之中兼以疏肝,清热利湿之中兼以调血理气,针对肝损伤源头-炎症因子的变化具有很好的调控效果,通过缓解炎症,调节免疫反应归于稳态以达到有效治疗肝损伤引起的相关宠物疾病。(The invention provides a formula for preventing and/or treating liver injury of pets, and a preparation method and application thereof. The formula comprises the following components in parts by weight: 8-15 parts of grifola, 8-15 parts of angelica sinensis, 7-9 parts of scutellaria baicalensis, 7-9 parts of radix bupleuri, 7-9 parts of golden cypress, 8-15 parts of honeysuckle, 8-15 parts of radix paeoniae alba, 7-9 parts of salvia miltiorrhiza and 8-15 parts of ligusticum wallichii, all the medicines are combined, the liver is nourished, the liver is soothing, the blood and qi are regulated during clearing heat and promoting diuresis, a good regulation and control effect is achieved for the change of liver injury source-inflammatory factors, and the immune response is regulated to be in a steady state through relieving inflammation so as to effectively treat related pet diseases caused by liver injury.)
技术领域
本发明涉及中药技术领域，更具体地，涉及一种预防和/或治疗宠物肝损伤的组方及其制备和应用。
背景技术
随着人们生活品质的提升，犬猫为代表的宠物在人们日常生活中担任着越来越重要的角色，随着宠物平均寿命的大幅增高，犬的老年病如心血管、肿瘤和肝脏方面的疾病也不期而至。临床研究表明许多犬猫疾病都与肝脏有着直接或间接的关系。目前诊断犬肝脏疾病主要依赖于试验室肝功能检测结果，但由于肝脏的代偿能力非常强，往往在检测结果出现异常时，疾病已发展至后期。肝损伤是多种肝脏疾病的常见发病形式，也是各种肝病发展成肝硬化，肝衰竭的中间环节。肝脏疾病是犬猫临床上的常见疾病，但目前市场上针对宠物肝脏疾病的药物大都对症或者有副作用，缺乏针对的特效药物。
现有针对宠物临床肝病的药物，以西药为主，围绕对症为治疗原则，效果有限，无法从根源上解决肝脏疾病的问题。例如临床上联苯双酯、葡醛酸钠等药物的保肝作用旨在降低代表肝功能的酶指标，属于对症治疗，虽然西药针对肝损伤虽有短暂的疗效，但存在对症治疗不对因，以及预后的不确定性等问题，使得开发针对病因的药物迫在眉睫。如专利CN103181940B提供了一种宠物用保肝药物，包括S-腺苷甲硫氨酸、水飞蓟素、维生素E、锌、香味剂，但是其中的S-腺苷氨酸与水飞蓟素存在副作用，长周期的使用会导致消化系统出现问题，包括呕吐，腹泻等等【陈美芳.两种海马多肽对酒精诱导HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用及机制研究[D].广东海洋大学,2019.】。
中草药是中华民族几千年累积下来的文化瑰宝，与西药相比，其具有药源丰富、价格便宜、副作用小、多环节整体性治疗等优势。但是目前针对宠物临床肝病的中药研究较少，故急需以传统中医理论和现代药理药效学为指导，研究开发新型的预防或治疗宠物肝损伤的药物。
发明内容
本发明针对现有技术中宠物肝病中药疗方的不足，旨在提供一种预防和/或治疗宠物肝损伤的组方及其制备和应用，提供了一种联合多种中药的组方用于宠物临床肝损伤的治疗中，能有效改善宠物肝功能、减缓肝脏炎症因子反应、缓解炎症变化、调节免疫反应、辅以保肝护肝等优势，达到有效治疗宠物肝炎的效果。
本发明的首要目的是提供一种预防和/或治疗宠物肝损伤的组方。
本发明的另一目的是提供所述组方的制备方法。
本发明的再一目的是提供所述组方在制备宠物肝损伤药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种预防和/或治疗宠物肝损伤的组方，包含以下重量份的各组分：
猪苓8～15份、当归8～15份、黄芩7～9份、柴胡7～9份、黄柏7～9份、金银花8～15份、白芍8～15份、丹参7～9份、川芎8～15份。
经反复试验，作为一种最优选地方案，所述组方包含以下重量份的各组分：猪苓13份、当归13份、黄芩8.7份、柴胡8.7份、黄柏8.7份、金银花13份、白芍13份、丹参8.7份、川芎13份。
肝主疏泄，肝气、肝阳常有余，肝血、肝阴常不足就成为肝的重要病理特点，本发明上述组方遵从中药配伍原则，药性温和，针对肝损伤中的炎症与免疫反应进行对因治疗。方中当归补肝血而活血止痛，白芍归肝敛肝阴养血和抗炎止痛，配伍同用为养血活血的基本药，川芎活血行气，配以丹参活血凉血，一般用于作为慢性肝病的臣药使用，柴胡善疏肝解郁，针对胆汁阻滞，猪苓利水渗湿，金银花宣散风热，清热解毒具备辅助抗炎症作用，配以黄芩归于肝经，入胆缓解炎症、黄柏清热燥湿，清泻中焦实火。诸药相合，养肝之中兼以疏肝，清热利湿之中兼以调血理气，针对缓解炎症，调节免疫反应归于稳态以达到治疗宠物肝炎的目的。针对肝损伤源头-炎症因子的变化具有很好的调控效果，可以很好地恢复肝脏损伤带来的问题。
使用上述组方对肝损伤中华田园犬进行治疗，结果显示，患病犬在给药本发明上述组方后，可有效恢复肝损伤犬肝脏生化指标至正常范围，包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰胺转移酶(γ-GT)；宏观上改善了肝脏组织状态；降低了炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、COX-2、iNOS mRNA相对表达量；降低了炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ三者在肝组织细胞质内的表达量；增加了IL-4、IL-10mRNA作为维持免疫反应平衡的抗炎细胞因子的表达量。可达到治疗肝病犬肝脏损伤，恢复肝功能的效果。
优选地，所述预防和/或治疗宠物肝损伤包括降低肝脏中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、谷氨酰胺转移酶的含量；改善肝脏组织状态；降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、COX-2、iNOS mRNA的表达量；增加IL-4、IL-10mRNA抗炎细胞因子的表达量。
优选地，所述组方的剂型为汤剂、药露、散剂或膏剂等等动物用药的可用剂型。
当所述组方的剂型为汤剂时，其制备方法包括如下步骤：
S1.称取各重量份的中药原料，加去离子水浸泡；
S2.使用武火煮沸，转文火维持其沸腾40～50min，分离药渣和药液1；
S3.药渣加去离子水，再次使用武火煮沸，转文火维持其沸腾40～50min，过滤得药液2；
S4.合并药液1和2，浓缩药液使生药浓度达到1g/mL，离心取上清即得所述组方。
上述汤剂制备工艺简单，所需原料成本廉价，不含激素与其它抗生素，符合行业未来减抗替抗与环保趋势，对宠物临床在肝脏疾病的治疗应用中有较大的现实意义。
优选地，步骤S1所述浸泡的时间为2～3h。
最优选地，步骤S1所述浸泡的时间为2h。
优选地，步骤S1和S3为加1～2倍中药原料或药渣重量的去离子水浸泡。
优选地，步骤S4所述浓缩为使用旋转蒸发仪50～60℃浓缩药液。
最优选地，步骤S4所述浓缩为使用旋转蒸发仪60℃浓缩药液。
优选地，步骤S4所述离心为2000～3000r/min离心5～8min。
最优选地，步骤S4所述离心为3000r/min离心5min。
本发明还请求保护上述方法制备得到的预防和/或治疗宠物肝损伤的组方。
作为一种优选的可实施方式，上述方剂的使用方法为0.5mL/kg宠物体重，1日1～2次，随餐送服，可以减少动物的应激反应，以两周为一个疗程。
此外，上述组方在制备宠物肝损伤药物中的应用也在本发明的保护范围中。
本发明所述宠物指犬、猫及其它供玩赏、伴侣之目的而饲养或管领之动物。本发明要求保护的组方除了对犬治疗有益以外，还可应用于其他一些动物的治疗，包括马、猫等等，以及其他引进品种的动物和农场的动物，包括哺乳动物，啮齿类动物等。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了的中药组方，诸药相合，养肝之中兼以疏肝，清热利湿之中兼以调血理气，针对缓解炎症，调节免疫反应归于稳态以达到治疗宠物肝炎的目的。针对肝损伤源头-炎症因子的变化具有很好的调控效果，可以很好地恢复肝脏损伤带来的问题。用于宠物临床肝损伤的治疗中，能有效改善宠物肝功能、减缓肝脏炎症因子反应、缓解炎症变化、调节免疫反应、辅以保肝护肝等优势，可达到西药治疗宠物肝炎的效果。此外，该中药组方的制备简单，不需要其他佐剂，能满足宠物临床肝脏疾病治疗切实的需求。
附图说明
图1为肝功生化指标检测结果，其中，Control为对照组；Treatment为中药治疗组；Hepatic injury为肝炎发病组。
图2为肝脏组织病理变化HE染色图(400×)。
图3为肝脏炎症因子mRNA相对表达量变化，其中，Control为对照组；Treatment为中药治疗组；Hepatic injury为肝炎发病组。
图4为肝脏组织炎症因子免疫组化检测的变化(400×)，其中，Negative为阴性对照组；Positive in CON，HJ，TRE：分别为对照组，发病组以及药物治疗组。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1预防和/或治疗宠物肝损伤的组方1～3
本实施例提供了3种预防和/或治疗宠物肝损伤的组方。
1、各组方按重量份计算，分别为：
组方1：猪苓13份、当归13份、黄芩8.7份、柴胡8.7份、黄柏8.7份、金银花13份、白芍13份、丹参8.7份、川芎13份。
组方2：猪苓8份、当归15份、黄芩7份、柴胡9份、黄柏9份、金银花8份、白芍8份、丹参7份、川芎8份。
组方3：猪苓15份、当归8份、黄芩9份、柴胡7份、黄柏7份、金银花15份、白芍15份、丹参9份、川芎15份。
2、组方的制备方法
上述3种组方为汤剂，其制备包括如下步骤：
S1.称取各重量份的中药原料，加2倍中药原料重量的去离子水浸泡；
S2.使用武火煮沸，转文火维持其沸腾40min，分离药渣和药液1；
S3.分离的药渣加2倍药渣重量的去离子水，再次使用武火煮沸，转文火维持其沸腾40min，过滤得药液2；
S3.合并药液1和2，使用旋转蒸发仪60℃浓缩药液，使生药浓度达到1g/mL，3000r/min离心5min取上清即得所述组方汤剂1-3。
实施例2预防和/或治疗宠物肝损伤的组方效果实验
为验证本发明护肝中药组方在治疗犬肝损伤时的对肝脏的保护效果，发明人进行了犬急性肝损伤的临床试验研究与疗效观察。
1、实验材料
(1)实验动物：18只健康中华田园犬，年龄1～2岁，体重为7～9kg。
(2)受试中药：实施例1中的组方汤剂1。
(3)实验动物日粮：试验粮为雷米高澳宝牛肉蔬菜成犬粮，日粮组成及其营养水平见表1。
表1日粮组成及营养水平(风干基础)
2、实验方法
(1)动物分组和处理
18只中华田园犬通过常规的免疫，经过常规临床理学检查、血常规、血生化指标检测均未见明显异常。开展试验前对实验动物房进行消毒通风，所有试验犬适应性饲养1周后开始实验，动物每天自由采食与饮水，笼养。
本试验将试验犬分成空白组、阳性对照组及中药治疗组共3组。先将18只试验犬随机分成2组，分别为空白对照组6只，发病组12只。发病组按1mL/kg一次性腹腔注射50％四氯化碳(CCl4)油溶液(即CCl4∶花生油＝1∶1，造模前将花生油高压灭菌，造模时按体积比根据用量临时配制)，空白对照组注射相应体积的花生油溶液，24h后发病组再随机分成2组，每组6只，分别为阳性对照组及中药治疗组。空白对照组及阳性对照组常规饲养，中药治疗组在发病24h后开始口服使用上述组方汤剂1治疗，剂量为0.5mL/kg犬体重，每天1次，治疗14天。
(2)临床指标检测
在试验期间，每日观察犬精神状况、全身体况、进食情况、二便等临床体征。试验犬采血前禁食8h以上，于治疗后第0d、1d、7d、14d时经前臂头静脉采血8mL。1mL用EDTA抗凝，进行血常规检测；4mL用肝素抗凝后3500r/min离心10min，取上清液，进行血清生化检测，检测ALT、AST、ALP、γ-GT等指标。
(3)样品采集与处理
于用药试验第14d对三组试验犬进行采样。采集血液之后，对试验犬进行安乐死，采集肝脏组织，PBS清洗粘附脏器上的血液，去除粘附在脏器上的脂肪组织和残留粘膜后称重。称重后，部分肝脏组织浸泡于4％多聚甲醛中固定备检，剩余组织经液氮速冻后放入-80℃冰箱保存备用。
(4)组织切片制作及HE染色
将新鲜的组织于磷酸缓冲液冲洗后固定于4％多聚甲醛浸泡，经梯度酒精脱水后进行组织包埋，自然凝固后进行组织切片。石蜡切片经苏木精-伊红染色后封片，在显微镜下观察组织形态。
(5)实时荧光定量PCR
组织总RNA经Trizol试剂盒提取后进行浓度和纯度检测。RNA的反转按试剂盒说明书指示进行操作。相关基因序列从NCBI获得，并选用GAPDH作为内参基因。引物序列由Primer Express 5.0软件设计，引物序列见表2。反转后的cDNA进行qPCR反应，反应体系为10μL：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix5μL，cDNA 1μL，上下游引物均为0.4μL，去离子水3.2μL。反应条件参考试剂说明。
表2引物序列
(6)肝脏组织炎症因子的免疫组化表达检测
从4％多聚甲醛中取出固定好的肝脏组织后，使用防脱玻片按照制作石蜡组织切片的方法常规制片。经过烘片、脱蜡复水、抗原修复、透膜、封闭、一抗，二抗孵育、DAPI显色、苏木精核染，梯度脱水，中性树脂封片。待风干后置于光学显微镜下进行拍摄分析。
(7)数据统计与分析
实验数据先用Excel2016初步处理，所得数据以平均值±标准误(Mean±SD)表示，应用SPSS统计分析软件进行差异显著性检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。所有数据用GraphPad Prism 8.0对结果进行分析呈现。
3、实验结果
(1)临床表现
空白对照组试验犬食欲旺盛，饮水正常，活泼好动，叫声洪亮，被毛光洁整齐，粪便成型，试验期间无一犬死亡。阳性对照组犬食欲降低，饮水正常，精神沉郁，小便呈现深黄色，有的大便带血，食后有强烈呕吐反应，中药治疗组试验犬在试验初期有出现尿液颜色变黄，软便，但饮欲食欲正常，精神状态良好，试验期间无一犬死亡。
(2)血清肝指标变化
由图1的A-D可知，随着疾病发生发展的时间延长，代表血清中肝脏功能指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰胺转移酶(γ-GT)四项显著提升(p<0.05)，而相比之下使用中药治疗的犬生化指标对应显著下降(p<0.05or p<0.01)，并逐渐恢复至正常范围。
(3)肝脏组织学变化的影响
由图2可看出，对照组肝脏细胞结构清晰，未见明显病变(图2A)；相比对照组而言，发病组(图2B)的肝脏出现了肝细胞坏死，细胞核仁消失(如右边的所示)、固缩、肝索间隙变宽、炎性细胞浸润，并伴有空泡变性(如左边的所示)；经中药(图2C)治疗，虽仍有少量空泡变性(如所示)，肝索间隙扩大，但肝脏整体结构清晰，未出现炎性细胞浸润，核仁溶解等病理变化。
(4)中药组方对肝损伤炎症因子基因表达的影响
犬肝脏组织炎症因子基因表达水平变化见图3。由图可知，炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、COX-2、iNOS mRNA相对表达量随肝损伤程度增加(p<0.01或p<0.05)；相对而言，中药组mRNA表达量显著降低(p<0.05，p<0.01或p<0.001)。肝脏组IL-4mRNA水平显著降低(p<0.01)，但表达量在中药组显著升高(p<0.001)。IL-10作为维持免疫反应平衡的抗炎细胞因子，在中药干预后mRNA表达增强(p<0.001)。
(5)中药对肝脏组织炎症因子免疫组化的影响
中药针对犬肝损伤组织中炎症因子变化和定位见图4(A1-C2)。由图可知，TNF-α、IL-1β以及IFN-γ的黄棕色阳性表达颗粒主要位于细胞质中。在对照组中，肝细胞质中的黄棕色颗粒比较少，而且颜色比较淡，指示三者蛋白阳性表达较低。而在发病组中的细胞质中黄棕色颗粒相比对照组而言表达增多，表明发病组的TNF-α、IL-1β以及IFN-γ三种参与炎症反应的蛋白阳性表达明显高于对照组(p<0.01或p<0.05)；相反因中药的治疗，三者的表达在中药组中的肝脏细胞质中有所下降，说明中药组中的三种蛋白表达因药物的参与而显著降低(p<0.05，p<0.01或p<0.001)。
综上，汤剂组方1可以改善肝炎发生时产生的炎症因子变化，调节免疫反应以达到治疗肝脏损伤，恢复肝功能的目的。此外，发明人将实施例1制备的汤剂组方2和3同样对四氯化碳(CCl4)油溶液诱导的肝损伤中华田园犬进行治疗，结果同样表明本发明的中药组方能改善肝炎发生时产生的炎症因子变化，调节免疫反应，达到治疗肝脏损伤，恢复肝功能的效果。
对比例1
同实施例1中组方1的制备方法，区别在于，组方药物中不加猪苓，其他成分的重量份同组方1。
对比例2
同实施例1中组方1的制备方法，区别在于，组方药物中不加川芎，其他成分的重量份同组方1。
对比例3
同实施例1中组方1的制备方法，区别在于，组方药物中不加金银花，其他成分的重量份同组方1。
对比例4
同实施例1中组方1的制备方法，区别在于，组方药物中不加丹参，其他成分的重量份同组方1。
对比例5
同实施例1中组方1的制备方法，区别在于，各中药原料的重量份为：猪苓5份、当归13份、黄芩8.7份、柴胡8.7份、黄柏8.7份、金银花13份、白芍13份、丹参8.7份、川芎13份。
对比例6
同实施例1中组方1的制备方法，区别在于，各中药原料的重量份为：猪苓13份、当归5份、黄芩8.7份、柴胡8.7份、黄柏8.7份、金银花13份、白芍13份、丹参8.7份、川芎13份。
对比例7
同实施例1中组方1的制备方法，区别在于，各中药原料的重量份为：猪苓13份、当归13份、黄芩8.7份、柴胡8.7份、黄柏8.7份、金银花6份、白芍13份、丹参8.7份、川芎13份。
对比例8
同实施例1中组方1的制备方法，区别在于，各中药原料的重量份为：猪苓13份、当归13份、黄芩8.7份、柴胡8.7份、黄柏8.7份、金银花13份、白芍13份、丹参8.7份、川芎6份。
发明人经反复试验，按照上述对比例1～8制备得到的组方对四氯化碳(CCl4)油溶液诱导的肝损伤中华田园犬进行治疗，结果显示其对改善肝炎炎症因子变化，调节免疫反应的效果不好，无法达到治疗病犬肝脏损伤，恢复其肝功能的目的。这也表明本发明的组方需要控制各中药原料在特定的配比下才能实现较好的治疗肝损伤的效果。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
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