具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案。实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

实施例1：免疫原的制备

为筛选出针对特异性表位的抗体，特异性合成了针对不同表位的肽段，序列如下所示：

(1)ETS GLQEQ RNHLQ GK；

(2)KLSE LQVEQ TSLEP LQ；

(3)TSLEP LQESP RPTGV W；

(4)KSRE VATEG IRGHR KMVLY T；

碳二亚胺(EDC)法偶联小肽与BSA蛋白载体：分别称取15mg小肽和25mg EDC-HCl，5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别溶于0.25ml超纯水中使其充分溶解，将两者在4℃避光混合搅拌反应过夜，然后向此混合液中缓慢滴加入含5mg BSA的超纯水约0.5ml，调pH值至7.4，继续搅拌反应6h，将反应混合物用10mM、pH7.4的PBS充分透析，隔5h左右换一次透析液，共换液6次，最后分装于-20℃保存待用。

实施例2：抗NT-proBNP单克隆抗体制备

鼠抗制备过程

将实施例1得到的重组蛋白分别作为免疫原免疫小鼠，制备单克隆抗体。

具体制备方法为：

a)小鼠免疫及抗体检测：将2mg/ml重组蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合并乳化后分别注射到3只6-8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠，每只小鼠40μg，初次免疫后两周，将重组蛋白与不完全佐剂混合乳化注射40μg到小鼠，两周后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价，每两周免疫一次并检测血清效价。筛选血清效价10⁶以上的小鼠，得到免疫小鼠，取免疫小鼠的脾脏分离淋巴细胞用于细胞融合。

b)细胞融合：

分离免疫小鼠的淋巴细胞与培养的SP2/0骨髓瘤细胞进行PEG1500介导的融合或者进行电融合。融合细胞培养在包含20％FBS血清的HAT-1640培养基中筛选培养。一周之后更换培养基，再培养4天之后取培养上清用于阳性克隆筛选。

羊抗制备过程

(1)使用化学合成的人重组肽偶联BSA后免疫波尔羊；分离羊脾细胞并提取总RNA，应用反转录技术制备cDNA；

(2)以cDNA为模板，分别合成羊IgG重链编码序列和轻链编码序列，应用重叠延伸PCR技术连接重链编码序列和轻链编码序列；

(3)将步骤(2)连接后获得的编码序列插入噬菌粒载体中，构建免疫抗体库；通过噬菌体展示和抗原特异性淘选，筛选得到特异性结合人NT-proBNP的单链抗体；

(4)将编码上述人NT-proBNP的单链抗体的DNA片段连接人IgG Fc段编码片段后亚克隆入真核表达载体中，构建重组质粒，将重组质粒转染宿主细胞表达，亲和纯化细胞培养上清即可得到人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体。

c)细胞筛选：

使用HAT选择培养基在96孔细胞培养板上培养杂交瘤细胞，显微镜下检测总融合率＞95％。在96孔板挑选具有单克隆细胞的孔，采用包被天然NT-proBNP蛋白对单克隆细胞孔的上清进行检测，挑取OD450＞0.8的孔内细胞进行亚克隆，最终获得对天然NT-proBNP反应阳性率＞99％的细胞克隆，作为分泌抗NT-proBNP单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。

d)抗体基因序列克隆测定

采用SouthernBiothech公司的SBA Clonotyping System-HRP试剂盒，按照说明书的操作来鉴定单克隆抗体重链和轻链的亚型。具体操作为：

1、用包被液(0.05M pH＝9.5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液)将捕获抗体稀释至1μg/mL，按照100μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液(洗板液)洗板3次。

2、用稀释液(1％BSA，0.1％PBST)按照1∶1稀释待检杂交瘤细胞的培养上清，按照100μL/孔加入酶标板，于37℃孵育30分钟。用稀释液将对应的酶标抗体(Ig-HRP、IgG1-HRP、IgG2a-HRP、IgG2b-HRP、IgG3-HRP、IgM-HRP、kappa-HRP、lamda-HRP)1∶3000稀释。

3、用洗板液3次洗板后每孔加入100μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，约5分钟(视反应强弱而定)之后加入2M硫酸终止反应，读取OD450吸光值。

经过鉴定，四株抗体的重链均为IgG2b，轻链为Kappa。根据抗体亚型结果，采用成熟的技术路线克隆抗体基因序列。收集生长状态良好的杂交瘤细胞，利用Thermo公司的Trizol提取杂交瘤细胞总RNA，按照Takara公司的PrimeScript II ReverseTranscriptase说明书的操作方法将mRNA逆转录为cDNA，于-20℃冻存备用。

反转录具体操作流程如下：

首先配制10μL总体积的模板RNA/引物DNA的预混液，其中包括1μL 10μM浓度的特异引物(序列为atgggtgccagtgtctcttagga以及gaagcctccaagaccttagaagggaa)，4μL浓度为2.5mM的dNTP混合液，5μL RNA(总量小于5μg)。混匀之后于65℃处理5分钟，立即放于冰上。

向预混液中加入4μL 5×PrimeScript II缓冲液，20单位的RNA酶抑制剂，1μLPrimeScript II RTase(200单位)，混匀之后于42℃反应60分钟，再于70℃处理15分钟，之后放于冰上冷却备用。

以cDNA为模板，采用文献报道的抗体基因扩增引物分别独立进行扩增尝试，筛选出能够高效扩增抗体基因的引物。按南京诺唯赞公司的Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase说明书的操作方案进行PCR

PCR反应体系为：

25μL 2×Phanta

1μL dNTP

4μL 10uM引物对

4μL杂交瘤细胞cDNA

1μL DNA polymerase

15μL dd H2O

总反应体积为50μL。扩增条件为：预变性94℃，3min；变性94℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，2min。按照OMEGA公司OMEGA Gel Extraction Kit说明书对PCR产物进行胶回收，扩增产物链接T载体以后经过质粒测序获得抗体基因序列。

e)抗体效价测定

NT-proBNP全长原核抗原稀释至1ug/ml，按每孔100ul添加至96孔板中，4℃孵育过夜，洗板。抗体稀释至合适浓度，按照3倍比进行稀释，每孔100ul，37摄氏度孵育1h，洗板。羊抗鼠HRP酶标抗体按照1∶3000稀释，37℃孵育30min，显色3min，A450nm检测吸光度。

其中对照为4℃孵育的抗体本身。

表1 Ab21间接效价测定

表2 Ab22间接效价测定

表3 Ab23间接效价测定

表4 Ab25间接效价测定

结果表明：在较低的浓度下，检测信号已经存在较大的梯度，说明四株抗体的灵敏度均较高，适合用于后续试验。

f)抗体稳定性测定：

将抗体在既定缓冲中进行37℃热加速7天，通过SDS-PAGE及ELISA间接法对加速抗体进行评价，与4℃作对照，鉴定抗体的长期稳定性。另外通过在-20℃进行反复冻融5次，以同样的标准对抗体的冻融稳定性进行评价。

表5 Ab21稳定性数据

结果如表5和图1所示：其中最右侧为Marker，从右向左泳道内依次添加的抗体试剂是Ab21 37℃加速31d非还原，Ab21 37℃加速31d还原，Ab21 37℃加速24d非还原，Ab2137℃加速24d还原，Ab21 37℃加速10d非还原，Ab21 37℃加速10d还原，Ab21 4℃非还原，Ab21 4℃还原，Ab21冻融5次非还原，Ab21冻融5次还原。

实验结果显示Ab21可以在4℃下稳定保存，在37℃加速一个月性质依旧稳定，保证了开瓶使用试剂的性能，从而保证检测结果的准确和稳定，此外，本发明抗体还可以反复冻融，不会对抗体本身的性能产生影响，非常适合实际应用场景。

表6 AB25稳定性数据

结果如表6和图2所示：其中最右侧为Marker，从右向左泳道内依次添加的抗体试剂是Ab25冻融5次非还原，Ab25冻融5次还原。Ab25 37℃加速31d非还原，Ab25 37℃加速31d还原，Ab25 37℃加速14d非还原，Ab25 37℃加速14d还原，Ab25 37℃加速7d非还原，Ab2537℃加速7d还原，Ab25 4℃非还原，Ab25 4℃还原。

实验结果显示Ab25可以在4℃下稳定保存，在37℃加速一个月性质依旧稳定，保证了开瓶使用试剂的性能，从而保证检测结果的准确和稳定，此外，本发明抗体还可以反复冻融，不会对抗体本身的性能产生影响，非常适合实际应用场景。

表7 Ab22稳定性评价数据

结果如表7和图3所示：其中最右侧为Marker，从右向左泳道内依次添加的抗体试剂是Ab22冻融3次非还原，Ab22冻融5次非还原。Ab22 37℃加速31d非还原，Ab22 37℃加速14d非还原，Ab22 37℃加速7d非还原，Ab22 37℃加速7d还原。

实验结果显示Ab22可以在在37℃加速一个月性质依旧稳定，保证了开瓶使用试剂的性能，从而保证检测结果的准确和稳定，此外，本发明抗体还可以反复冻融，不会对抗体本身的性能产生影响，非常适合实际应用场景。

3.Ab23稳定性评价数据

结果如表8和图4所示：其中从左向右，泳道1为：Ab23 4℃还原，泳道2为Ab23 4℃非还原，泳道3为Ab23 37℃加速7d还原，泳道4为Ab23 37℃加速7d非还原，泳道5为Ab23 37℃加速14d还原，泳道6为Ab23 37℃加速14d非还原，泳道7为Ab23 37℃加速31d还原，泳道8为Ab23 37℃加速31d非还原，泳道9为Ab23冻融5次还原，泳道10为冻融5次非还原。

实验结果显示Ab23可以在在37℃加速一个月性质依旧稳定，保证了开瓶使用试剂的性能，从而保证检测结果的准确和稳定，此外，本发明抗体还可以反复冻融，不会对抗体本身的性能产生影响，非常适合实际应用场景。

综上，本发明的四株抗体检测相近，在低值都能够拉开测量的梯度，灵敏度均较高。

此外，可以反复冻融使用，且能在37℃稳定的保存，性能十分稳定，可以适用于实际操作环境，因为试剂无法一次用完，多次冻存，然后溶解使用的需求，同时在37℃使用环境中稳定保存，对于检测的结果的准确性十分重要。

实施例3：Ab21和Ab25应用到胶体金免疫层析检测中

1)检测装置的准备

检测装置包括检测试纸、卡壳和配套的免疫层析结果读取记录仪。其中检测试纸包含胶体金垫、NC膜、样品垫、吸样垫和塑料底板。其中，胶体金垫上含有胶体金标记的Ab25抗体，会结合样品中的NT-proBNP蛋白，形成抗原-抗体-胶体金复合物。NC膜上设置了T线(包被Ab21抗体，用于捕获抗原-抗体-胶体金复合物)和C线(包被抗鼠IgG的抗体)。检测时，将样本加入样品孔，血液中的NT-proBNP与胶体金标记的Ab25结合，然后抗原-抗体-胶体金复合物沿硝酸纤维素膜层析至检测区，与检测区所包被的Ab21抗体结合，从而在检测区形成色带，通过中元Zybio-Q7免疫层析检测仪对此色带信号的强度进行分析，根据预置的分析模块，计算出标本中NT-proBNP的浓度。

2)标曲的建立

取上述制备的检测试纸5个，分别将5个浓度(10ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)的校准品加入试纸条的样品垫上，每个浓度点进行三次重复测试，加样量为70μl，反应3分钟后再中元汇吉Q7上检测，以校准品浓度为X轴。每个点测试所得3此信号值平均值为Y轴，绘制标准曲线，如图5。

依据该标准曲线进行罗氏样本的检测，结果如图6所示。

实验结果表明Ab21和Ab25两株抗体应用于免疫层析胶体金检测时，与38株罗氏样本的符合率达到0.99，且低值和高值样本均能准确检测，对于最容易产生假阳性实验结果的200-400ng/mL范围的样本也能准确检测，不会出现假阳性或者假阴性结果。说明这两株抗体在免疫层析胶体金层析卡检测中效果优异，临床符合率高，可应用于该方法学。

实施例4：Ab23和Ab25应用到荧光免疫层析检测中

1)检测装置的准备

检测装置包括检测试纸、卡壳和配套的免疫层析结果读取记录仪。其中检测试纸包含NC膜、样品垫、吸样垫和塑料底板。其中，NC膜上包含所述生物素标记线、荧光微球标记线、链酶亲和素检测线(T线)和质控线(C线)，述生物素标记线包含生物素标记的Ab25，会结合样品中的NT-proBNP蛋白，形成抗原-Ab25抗体-生物素复合物，荧光微球标记线包含荧光标记的Ab23抗体，Ab23抗体与抗原结合，形成：荧光微球-Ab23抗体-抗原-Ab25抗体-生物素。链霉亲和素检测线用于捕获：荧光微球-Ab23抗体-抗原-Ab25抗体-生物素复合物)和C线(包被抗鼠IgG的抗体)。加入样本后，通过中元Zybio-Q8 Pro免疫荧光分析仪检测信号强度，根据预置的分析模块，计算出标本中NT-proBNP的浓度。

2)标曲的建立

取上述制备的检测试纸10个，分别将10个浓度(5pg/mL、142pg/mL、314pg/mL、545pg/mL、936pg/mL、1884pg/mL、3122pg/mL、5793pg/mL、11692pg/mL、22766pg/mL、)的校准品加入试纸条的样品垫上，每个浓度点进行三次重复测试，加样量为120μl，反应10秒后上机检测，以校准品浓度为X轴。每个点测试所得3此信号值平均值为Y轴，绘制标准曲线，如图7所示。

3)NT-proBNP含量检测试剂盒的假阳性实验

表9 NT-proBNP含量检测试剂盒的假阳性实验

实施例5：Ab21和Ab22应用到化学发光试剂盒检测中

1)检测试剂盒的制备

本试剂盒包含R1、R2、磁微粒、校准品和质控品。

其中R1包含生物素标记的NT-proBNP，R2包含碱性磷酸酶标记的Ab21，磁微粒上标记Ab22

具体的本发明R1：50mM PBS、100mM NaCl、1％BSA、0.1％Tween20、0.1％PC300；

R2：50mM PBS、100mMNaCl、1％BSA、1mM MgCl2、1mM ZnCl2

2)标曲的建立

NT-proBNP校准品的制备：用pH＝7.4的PBS缓冲液将制备的NT-proBNP溶液配制成浓度为(0ng/ml、116.5ng/ml、436.9ng/ml、1103.9ng/ml、2446.6ng/ml、16662.5ng/ml和45510.0ng/ml。

结果如图8所示。

3)NT-proBNP含量检测试剂盒的假阳性实验

表10 NT-proBNP含量检测试剂盒的假阳性实验

4)临床检测评价

临床符合率如图9和10所示，结果显示，检测结果都在20％的偏差之类，大部分值落在置信区间，说明检测结果准确有效。

评价结果表明Ab21和Ab22在应用于化学发光临床评价中，借助标曲进行浓度会算后，187例临床样本的检测，其符合率达到0.99，说明这两株抗体适用于化学发光的检测。

综上所述，本发明的抗体，适合应用在NT-ProBNP的检测试剂盒中，可以应用在胶体金免疫层析、荧光免疫层析及化学发光等多种检测方法学中，因为其性能稳定、优良，使其可以匹配各种检测试剂盒，并呈现出优良的检测性能，实现对于NT-ProBNP的高灵敏、高特异性及准确的检测。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 重庆中元汇吉生物技术有限公司

<120> N-末端脑钠肽前体多肽、抗体及试剂盒

<130> 2020.12.30

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> human

<400> 1

Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys

1 5 10 15

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> human

<400> 2

Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln

1 5 10 15

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> human

<400> 3

Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp

1 5 10 15

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> human

<400> 4

Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met

1 5 10 15

Val Leu Tyr Thr

20

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> goat

<400> 5

Thr Tyr Tyr Val Asp

1 5

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> goat

<400> 6

Gln Met Thr Lys Asp Gly Asn Ala Val His Asn Pro Thr Leu Arg Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> goat

<400> 7

Gly Leu Ile Asp

1

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> goat

<400> 8

Ser Gly Ser Ser Asp Asn Val Gly Phe Gly Asp Tyr Val Asn

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> goat

<400> 9

Gly Ala Thr Ser Arg Val Arg

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> goat

<400> 10

Gly Ser Gly Asn Ser Arg Gly Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> mouse

<400> 11

Asp Phe Ala Ile His

1 5

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> mouse

<400> 12

Trp Ile Asn Thr Arg Asn Asn Lys Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> mouse

<400> 13

Ser Arg His Asp Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> mouse

<400> 14

Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> mouse

<400> 15

Val Glu Lys Asp Gly Ser Leu Ser Thr Gly Asp

1 5 10

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> mouse

<400> 16

Gly Val Gly Asp Thr Ile Glu Glu Gln Phe Val Tyr Val

1 5 10

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> mouse

<400> 17

Ser Tyr Asp Leu Asn

1 5

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> mouse

<400> 18

Trp Ile Tyr Pro Gly Glu Asp Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> mouse

<400> 19

Gly Gly Gly Arg Gly Ala Trp Leu Ala Tyr

1 5 10

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> mouse

<400> 20

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> mouse

<400> 21

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> mouse

<400> 22

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> mouse

<400> 23

Asn Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> mouse

<400> 24

Thr Ile Ser Gly Ala Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> mouse

<400> 25

Pro Ser Thr Gly Asp Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> mouse

<400> 26

Lys Ser Ser Gln Ser Ile Val Phe Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> mouse

<400> 27

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> mouse

<400> 28

Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Trp Thr

1 5