一种用于肿瘤t1-t2磁共振成像的介孔聚多巴胺纳米粒
阅读说明：本技术 一种用于肿瘤t1-t2磁共振成像的介孔聚多巴胺纳米粒 (Mesoporous polydopamine nanoparticle for tumor T1-T2 magnetic resonance imaging ) 是由 曹众 吴英健 杨茜 于 2021-02-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学材料技术领域,具体涉及一种用于肿瘤T1-T2磁共振成像的介孔聚多巴胺(MPDA)纳米粒,为制备出一种金属内掺杂且具有T1-T2双模态成像效果的介孔聚多巴胺纳米粒子,本发明采用聚合前掺杂方法,以盐酸多巴胺和Mn前体为基本原料,F127和TMB为模板制备得到一种锰-介孔聚多巴胺纳米粒,该纳米粒是一种金属锰内掺杂且具有介孔结构的聚多巴胺纳米粒,具有肿瘤微环境响应性,具有良好的光热转换能力,光热稳定性好；具有较好的生物相容性,可同时作为T1和T2造影剂用于肿瘤的磁共振成像。(The invention belongs to the technical field of biomedical materials, and particularly relates to Mesoporous Polydopamine (MPDA) nanoparticles for tumor T1-T2 magnetic resonance imaging, in order to prepare mesoporous polydopamine nanoparticles doped in metal and having a T1-T2 bimodal imaging effect, the invention adopts a doping method before polymerization, dopamine hydrochloride and Mn precursor are used as basic raw materials, F127 and TMB are used as templates to prepare manganese-mesoporous polydopamine nanoparticles, and the nanoparticles are polydopamine nanoparticles doped in metal manganese and having a mesoporous structure, have tumor microenvironment responsiveness, good photo-thermal conversion capability and good photo-thermal stability; has better biocompatibility and can be used as T1 and T2 contrast agents simultaneously for magnetic resonance imaging of tumors.)
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种用于肿瘤T1-T2磁共振成像的介孔聚多巴胺纳米粒。
背景技术
磁共振成像(MRI)由于具有高时间、空间分辨率，不受渗透深度限制且无辐射伤害等优势受到广泛关注。磁共振造影剂可以通过减少T1或T2水质子的弛豫时间增强MRI信号。T1称为纵向弛豫时间，通常用于提高可视化饱和度、抑制磁共振信号强度或成像强度，由于组织通常具有较长的纵向弛豫时间，T1加权图像适用于观察脂肪组织或解剖结构。T2称为横向弛豫时间，病变组织部位质子自旋通常具有较长的弛豫时间，因此一般用T2加权图像来辨别病变组织。
磁共振成像(MRI)在肿瘤的早期诊断和精确治疗中起到了至关重要的作用。基于核磁共振原理，磁共振成像(MRI)可通过监测组织中水质子的弛豫率差异，提供软组织的高分辨率图像。目前临床上普遍采用的MRI造影剂是T1造影剂，尽管与T2造影剂相比在识别肿瘤微浸润方面具有优势，但其灵敏度远低于T2造影剂，难以检出直径小于1cm的早期肿瘤。T1-T2双模态MRI在同一台仪器上进行，操作过程中只需简单调整MRI中的采集序列，保证了两次成像时空成像参数的精确一致，可有效避免不同模式下成像结果不吻合的情况。也就是说，T1-T2双模态MRI可用于早期肿瘤、血管系统、中枢神经系统等部位的精确成像，避免了单模态下MRI伪影对诊断结果的影响。因此，构建一种具有多重抗癌效果，同时具备T1-T2双模态造影能力的多功能纳米诊疗剂对于癌症的早期诊断和精确治疗具有重大意义。
T1-T2双模态MRI造影剂的设计和应用可细分为以下几类：(1)将T1造影材料与T2造影材料结合；(2)将T1造影材料掺杂到T2造影材料中；(3)制备具有适当尺寸和磁化强度的磁性纳米粒子；(4)将T1造影材料与非磁性多孔介质复合。例如，有学者通过二氧化硅模板法，先制备了双介孔二氧化硅球体，随后在高锰酸钾参与的条件下发生氧化还原反应得到核-壳结构锰-的双介孔二氧化硅球体Mn-DMSS，锰元素主要位于壳区。由于在DMSS孔中形成超小型氧化锰纳米簇缩短了T2弛豫时间、独特的双介孔结构可以增加水分子在中孔内的扩散速率增强r1弛豫性，Mn-DMSS具有T1-T2造影效果，开发出一类具有单一成分(Mn基)且在两种功能单元之间没有冲突作用的新型双模式造影剂(DMCA)。
研究表明，几何约束作用是一种通过调整内球和外球机制以提高弛豫性的有效策略。具体而言，间隙骨架结构可以使造影剂自由旋转，并使周围水分子的扩散受限，从而显著增加造影剂的旋转相关时间(τR)和水分子的扩散相关时间(τD)，进而同时增强T1和T2造影效果。但是由于缺乏临床验证，T1-T2双模态MRI的研究目前仍处于起步阶段。由此可见，开发肿瘤微环境响应的生物可降解T1-T2双模态纳米诊疗剂可以为磁共振成像提供新的思路。
近年来，聚多巴胺(PDA)作为一种类黑色素，具有良好的生物相容性和生物可降解性，还可作为光热转换制剂用于癌症的光热治疗(PTT)，被广泛应用于癌症的诊疗体系。有研究表明，聚多巴胺(PDA)的关键环化产物，即5,6-二羟基吲哚单元可被GSH还原，且PDA对肿瘤的酸性微环境具有pH敏感性。因此，在酸性和富含GSH的肿瘤微环境下PDA可被降解，从而触发药物释放。此外，PDA中的邻苯二酚键使其可以和金属离子发生螯合作用。当前，制备金属掺杂聚多巴胺杂化材料通常包括聚合后掺杂和聚合前掺杂两种方法。其中，聚合后掺杂存在的金属离子负载效率较低，与低水溶性的金属离子不兼容等问题，而聚合前掺杂方法使PDA具有更高的金属负载量，在相同的聚多巴胺浓度下具有更好的MRI造影效果。
作为一种新型的PDA材料，介孔聚多巴胺(MPDA)由于其规则的孔道结构和较高比表面积成为了一种理想的药物载体，而纳米颗粒可通过增强的渗透和保留(EPR)效应有效地靶向肿瘤部位，从而减少药物释放过程中的药物泄漏。本课题组早期工作中，利用高孔隙率MPDA的亲疏水作用负载了羰基锰(MnCO)，通过羰基锰在酸性、H2O2的肿瘤微环境下发生类芬顿反应在原位释放一氧化碳(CO)气体，进而与血红蛋白结合产生毒副作用，与MPDA本身带有的光热效果达到协同抗癌的作用，与此同时，原位产生的Mn离子可以用作MRI的有效造影剂，结合光声成像(PAI)可以实现双峰引导的成像效果，最终构建出MRI/PAI指导下CO气体治疗与PTT协同的多模态成像抗癌诊疗剂。此抗癌诊疗剂是通过包裹金属前体制备得到，无金属掺杂，但不具有T1-T2双模态成像效果，因而限制了其在肿瘤诊疗一体化中的应用。因此迫切需要制备出一种金属内掺杂且具有T1-T2双模态成像效果的纳米粒子。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明采用聚合前掺杂方法，以盐酸多巴胺和Mn前体为基本原料，F127和TMB为模板制备得到一种具有肿瘤微环境响应、T1-T2双模磁共振成像效果以及光热转化性质的锰-介孔聚多巴胺纳米粒。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种锰-介孔聚多巴胺纳米粒的制备方法，即采用聚合前掺杂方法，先将盐酸多巴胺与Mn2+螯合产生配合物，然后以锰螯合-多巴胺为基本原料，F127和TMB为模板制备得到锰-介孔聚多巴胺纳米粒。
作为本发明的一个优选实施方式，上述的一种锰-介孔聚多巴胺纳米粒的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、将盐酸多巴胺、水合硫酸锰溶于水中，经避光搅拌制备得到锰螯合-多巴胺溶液；
S2、将F127和步骤S1的锰螯合-多巴胺溶液加入到乙醇与水的混合溶液中，避光搅拌至混匀；
S3、在水浴超声中边摇晃边加入TMB溶液(1,3,5-三甲苯)，持续超声分散至乳白色；
S4、在搅拌下逐滴加入Tris(三羟甲基氨基甲烷)水溶液，避光搅拌；
S5、对步骤S4搅拌后的溶液进行离心、重悬和洗涤后制备得到锰-介孔聚多巴胺纳米粒(简称Mn-MPDA)。
本发明采用聚合前掺杂方法，在盐酸多巴胺聚合前使其与Mn2+螯合产生配合物，随后以锰螯合-多巴胺为基本原料，F127和TMB为模板制备得到Mn-MPDA。该Mn-MPDA是一种金属锰内掺杂且具有介孔结构的聚多巴胺纳米粒，Mn-MPDA保留了MPDA良好的光热效果。此外，由于Mn2+的内掺杂以及几何约束构象作用，可使Mn-MPDA附近水分子的自由旋转及近端水分子的扩散受限，进而缩短T2弛豫时间并增加r1弛豫率，从而赋予其T1-T2双模态成像功能；Mn-MPDA具有肿瘤微环境响应性，可实现药物的靶向释放，且具有较好的生物相容性，可实现T1-T2双模态磁共振成像。该Mn-MPDA有望实现T1-T2双模态磁共振成像引导光热治疗，为临床癌症诊疗提供新思路。
从原理上而言，本发明中的Mn2+可以替换成其它金属元素如Fe2+，即采用本发明方法，能达到与本发明相同或相似效果的金属元素均在本发明的保护范围内。
优选地，步骤S1所述盐酸多巴胺与水合硫酸锰的质量比为(30-35):1。该配比下，可以使Mn-MPDA取得最佳的掺杂效果。
优选地，步骤S1所述水合硫酸锰与水(一般为超纯水)的质量体积比为1mg:(1-1.5)mL。
优选地，步骤S2所述F127与锰螯合-多巴胺溶液的质量体积比为(100-150)mg:1mL。
优选地，步骤S2所述乙醇、水(一般为超纯水)与锰螯合-多巴胺溶液的体积比为20:20:(1-1.5)。
优选地，步骤S3所述TMB溶液与锰螯合-多巴胺溶液的体积比为(2-4):3。进一步的，所述TMB溶液与锰螯合-多巴胺溶液的体积比为1:1.5。
优选地，步骤S4所述Tris水溶液的浓度为20mg/mL，所述Tris水溶液与TMB溶液的体积比为5:(1-2)。
优选地，步骤S1所述搅拌为150-200rpm搅拌22-26h。
优选地，步骤S2所述搅拌为150-200rpm搅拌15-25min。
优选地，步骤S3所述超声的频率为(3-5)kHz，时间为2-5min。进一步地，所述超声的频率为4kHz，时间为3.5min。
优选地，步骤S4所述搅拌为150-200rpm搅拌5-8h。
优选地，步骤S5所述离心为13000rpm离心7min。
优选地，步骤S5所述重悬所用的溶剂为无水乙醇，重悬过程中采用水浴超声处理，至少重复2次，所述水浴超声的频率为(3-5)kHz，时间为25-30min；进一步地，所述水浴超声的频率为4kHz，时间为28min。
优选地，步骤S5所述洗涤所用的溶剂为水(一般为超纯水)，洗涤的次数不少于2次。
本发明还提供了采用上述的制备方法制备得到的锰-介孔聚多巴胺纳米粒。
本发明还提供了上述的锰-介孔聚多巴胺纳米粒在肿瘤T1-T2磁共振成像中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供一种锰-介孔聚多巴胺纳米粒的制备方法，即采用聚合前掺杂方法，先将盐酸多巴胺与Mn2+螯合产生配合物，然后以锰螯合-多巴胺为基本原料，F127和TMB为模板制备得到锰-介孔聚多巴胺纳米粒(Mn-MPDA)。该Mn-MPDA粒径均一，呈现均匀分布的介孔结构，水中分散性良好，Mn元素掺杂效率和螯合作用高；具有肿瘤微环境响应性，可实现药物的靶向释放；具有良好的光热转换能力，光热稳定性好；具有较好的生物相容性，可同时作为T1和T2造影剂用于磁共振成像。
由于Mn-MPDA具有高掺杂效率和螯合作用、水中分散性良好、造影效果良好，从而解决了利用聚合后掺杂金属盐制备金属负载聚多巴胺杂化材料存在的金属离子负载效率较低、与低水溶性的金属离子不兼容的问题。同时，本发明的Mn-MPDA可实现T1-T2双模态磁共振成像，使MRI结果更加精确，解决了磁共振成像中单模态存在的MRI伪影对诊断结果的影响问题；此外，本发明的Mn-MPDA是一种具有肿瘤微环境响应、生物相容性良好、具有光热能力、可以进行T1-T2双模态成像的一体化纳米诊疗剂(造影剂)，可以为癌症治疗提供新思路，解决了常规化疗、放疗、手术等疗法靶向性差、副作用大、需辅助仪器进行诊断的问题。
附图说明
图1为Mn-MPDA纳米粒子制备过程中混合溶液的变化图；
图2为实施例1制备的Mn-MPDA纳米粒子的透射电镜图；
图3为实施例2制备的Mn-MPDA纳米粒子的透射电镜图；
图4为实施例3制备的Mn-MPDA纳米粒子的透射电镜图；
图5为Mn-MPDA纳米粒子的粒径分布图；
图6为Mn-MPDA纳米粒子的扫描电镜图像(A为纳米粒子的电镜图；B为纳米粒子中各元素的电镜分析图[O、N、Mn、C])；
图7为Mn-MPDA纳米粒子的X射线能谱(EDS)分析图；
图8为Mn-MPDA纳米粒子的(A)X射线光电子能谱和(B)氮气吸脱附等温线；
图9为Mn-MPDA纳米粒子在不同pH值和GSH含量的PBS溶液中孵育24h后的透射电镜图像(A:pH＝7.4,GSH＝0mM；B:pH＝5.0,GSH＝0mM；C:pH＝7.4,GSH＝10mM；D:pH＝5.0,GSH＝10mM)；
图10为近红外激光照射下(A)不同浓度和(B)不同激光功率Mn-MPDA溶液的升温曲线；(C)近红外激光照射下Mn-MPDA溶液温度随时间的变化曲线；(D)Mn-MPDA溶液在近红外激光照射下的光热效果图(插入图为冷却时间与温度的负对数曲线图)；
图11为Mn-MPDA的(A)纵向弛豫速率(1/T1)和(B)横向弛豫速率(1/T2)与载体浓度的关系；MPDA-Mn的(C)纵向弛豫速率(1/T1)和(D)横向弛豫速率(1/T2)与载体浓度的关系；
图12不同浓度的Mn-MPDA与HUVEC细胞孵育24h和48h后的细胞存活率。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1聚合前掺杂法制备锰-介孔聚多巴胺纳米粒
(1)将90mg盐酸多巴胺、3mg水合硫酸锰溶解于3mL超纯水中(盐酸多巴胺与水合硫酸锰的质量比为30:1；水合硫酸锰与超纯水的质量体积比为1mg:1mL),180rpm避光搅拌24h，得到锰螯合-多巴胺溶液；
(2)将36mg表面活性剂F127与步骤(1)的0.3mL锰螯合-多巴胺溶液加入到6mL乙醇与6mL超纯水的混合溶液中(F127与锰螯合-多巴胺溶液的质量体积比为120mg:1mL，乙醇、超纯水与锰螯合-多巴胺溶液的体积比为20:20:1)，180rpm避光搅拌20min；如图1(1)所示，锰螯合-多巴胺溶液、F127分散在乙醇和水的混合溶液中呈白色透明溶液；
(3)在25℃水浴超声(4kHz)中边摇晃边加入0.2mL 1,3,5-三甲苯(TMB)溶液，持续超声分散3.5min至乳白色；如图1(2)所示，在水浴超声下逐步加入有机模板剂TMB后，溶液逐渐变为乳白色；
(4)在180rpm磁力搅拌下逐滴加入1mL浓度为20mg/mL的Tris水溶液，180rpm避光搅拌6h；如图1(3)所示，加入碱性的Tris缓冲液后，由于Mn2+的存在，溶液迅速变为粉红色并逐渐加深；
(5)最后将所得溶液分装于2mL离心管中，13000rpm离心7min，所得沉淀重悬于无水乙醇中，25℃水浴超声(4kHz)28min，重复2次，随后在相同条件下用超纯水洗涤2次，所得产物即为锰-介孔聚多巴胺纳米粒(简称Mn-MPDA)。如图1(4)所示，反应6h后，最终形成黑色的纳米粒子分散液，经过离心清洗之后即可得到产物Mn-MPDA纳米粒子。
实施例2聚合前掺杂法制备锰-介孔聚多巴胺纳米粒
(1)将99mg盐酸多巴胺、3mg水合硫酸锰溶解于3.75mL超纯水中(盐酸多巴胺与水合硫酸锰的质量比为33:1；水合硫酸锰与超纯水的质量体积比为1mg:1.25mL),150rpm避光搅拌26h，得到锰螯合-多巴胺溶液；
(2)将30mg表面活性剂F127与0.3mL步骤(1)的锰螯合-多巴胺溶液加入到4.8mL乙醇与4.8mL超纯水的混合溶液中(F127与锰螯合-多巴胺溶液的质量体积比为100mg:1mL，乙醇、超纯水与锰螯合-多巴胺溶液的体积比为20:20:1.25)，150rpm避光搅拌25min；
(3)在25℃水浴超声(4kHz)中边摇晃边加入0.3mL 1,3,5-三甲苯(TMB)溶液，持续超声分散2min至乳白色；
(4)在180rpm磁力搅拌下逐滴加入1mL浓度为20mg/mL的Tris水溶液，150rpm避光搅拌8h；
(5)最后将所得溶液分装于2mL离心管中，13000rpm离心7min，所得沉淀重悬于无水乙醇中，25℃水浴超声(4kHz)25min，重复3次，随后在相同条件下用超纯水洗涤3次，所得产物即为锰-介孔聚多巴胺纳米粒(简称Mn-MPDA)。
实施例3聚合前掺杂法制备锰-介孔聚多巴胺纳米粒
(1)将105mg盐酸多巴胺、3mg水合硫酸锰溶解于4.5mg超纯水中(盐酸多巴胺与水合硫酸锰的质量比为35:1；水合硫酸锰与超纯水的质量体积比为1mg:1.5mL),200rpm避光搅拌22h，得到锰螯合-多巴胺溶液；
(2)将45mL表面活性剂F127与步骤(1)的0.3mL锰螯合-多巴胺溶液加入到4mL乙醇与4mL超纯水的混合溶液中(F127与锰螯合-多巴胺溶液的质量体积比为150mg:1mL，乙醇、超纯水与锰螯合-多巴胺溶液的体积比为20:20:1.5)，150-200rpm避光搅拌25min；
(3)在25℃水浴超声(4kHz)中边摇晃边加入0.4mL 1,3,5-三甲苯(TMB)溶液，持续超声分散5min至乳白色；
(4)在180rpm磁力搅拌下逐滴加入1mL浓度为20mg/mL的Tris水溶液，200rpm避光搅拌5h；
(5)最后将所得溶液分装于2mL离心管中，13000rpm离心7min，所得沉淀重悬于无水乙醇中，25℃水浴超声(4kHz)30min，重复2次，随后在相同条件下用超纯水洗涤2次，所得产物即为锰-介孔聚多巴胺纳米粒(简称Mn-MPDA)。
对比例1聚合后掺杂法制备锰的介孔聚多巴胺纳米粒(MPDA-Mn)
(1)将90mg盐酸多巴胺、36mg表面活性剂F127溶解于6mL乙醇与6mL超纯水的混合溶液中(盐酸多巴胺与表面活性剂F127的质量比为1:4；盐酸多巴胺与超纯水的质量体积比为3mg:2mL),180rpm避光搅拌20min至混匀；
(2)在25℃水浴超声(4kHz)中边摇晃边加入0.2mL 1,3,5-三甲苯(TMB)溶液，持续超声分散4min至乳白色；
(3)将步骤(2)所述溶液在180rpm磁力搅拌下逐滴缓慢加入1mL三羟甲基氨基甲烷(Tris)水溶液(20mg/mL)(步骤(2)所述溶液与三羟甲基氨基甲烷(Tris)水溶液的体积比为12.3:1)，180rpm避光搅拌6h；
(4)将所得溶液分装于2mL离心管中，13000rpm离心7min，所得沉淀重悬于无水乙醇中25℃水浴超声(4kHz)28min，重复洗涤2次，随后在相同条件下用超纯水洗涤2次，所得产物即MPDA纳米粒子；
(5)将以上MPDA纳米粒子重悬于5mL超纯水中，加入0.3mL水合硫酸锰水溶液(1mg/mL)在避光条件下180rpm磁力搅拌24h，最后分装于2mL离心管中，13000rpm离心7min，所得沉淀重悬于超纯水中，25℃水浴超声(4kHz)28min，洗涤2次，即可得到MPDA-Mn纳米粒子。
实验例1Mn-MPDA形貌与粒径表征
将实施例1-3制备得到的Mn-MPDA配制成100μg/mL样品溶液，取10μL滴加于碳支持膜铜网的正面，置于干燥器中室温条件下自然风干后于120KV电压条件下，使用透射电子显微镜观察Mn-MPDA的微观形态(形貌、粒径与分散情况)。
由图2-4可见，制得的Mn-MPDA粒径分布范围较窄，为球形，粒径均一，约为130nm，呈现均匀分布的介孔结构。
同时，将实施例1制备的Mn-MPDA纳米粒子在超纯水中重悬，稀释至50μg/mL后超声均匀，利用动态光散射法检测该纳米粒子样品的水合粒径、多分散性系数和Zeta电位。
如表1、图5所示，Mn-MPDA纳米粒子分散性良好，水合粒径约为201.4nm，且处于电中性。透射电镜与动态光散射法(DLS)测量结果有所差异，原因是后者得到的是纳米粒子为水合状态下的粒径，溶剂效应使得纳米颗粒显示出更大的水合粒径。
表1Mn-MPDA纳米粒子的分散性、粒径与Zeta电位
此外，实施例2-3的实验结果与实施例1类似，此处不再赘述。
实验例2Mn-MPDA的SEM扫描电镜表征与EDS能谱分析
将实施例1制备得到的Mn-MPDA配制成50μg/mL的Mn-MPDA乙醇溶液，取少量一定浓度的Mn-MPDA纳米粒子的乙醇溶液滴于铝箔上，晾干后置于G500高分辨场发射扫描电镜(Gemini500，Zeiss/Bruker)下观察粒子形貌，并通过X射线能谱分析(EDS)测定Mn-MPDA中各元素的相对含量。
如图6所示，可以直观地观察到Mn-MPDA纳米粒子为粒径均匀的立体圆球形，并具有与透射电镜图像一致的表面介孔结构。如图7所示，通过EDS分析得到Mn-MPDA纳米粒子的元素映射图，可以观察到C、O、N、Mn各元素的均匀分布，表明Mn元素均匀的掺杂在了Mn-MPDA纳米粒子的内部。
此外，实施例2-3的实验结果与实施例1类似，此处不再赘述。
实验例3Mn-MPDA的X射线光电子能谱分析与氮气吸附曲线表征
取适量实施例1制备的Mn-MPDA样品冻干后均匀铺在贴有双面胶(约2mm×2mm)的铝箔上，压片机压平后用X-射线光电子能谱仪(Nexsa，Thermo Fisher)测定样品中Mn元素的含量与价态。
如图8A所示，与Mn元素的标准谱图对比发现Mn-MPDA样品中的Mn价态为Mn2+。氮气吸脱附等温线如图8B所示，计算得到Mn-MPDA的BET比表面积为42.2571m2/g，约为粒径为200nm左右的MPDA的两倍，表明粒径较小的Mn-MPDA具有更高的比表面积。
此外，实施例2-3的实验结果与实施例1类似，此处不再赘述。
实验例4Mn-MPDA的pH与谷胱甘肽(GSH)响应性研究
取适量实施例1制备的Mn-MPDA样品分别分散于不同pH值与GSH含量的PBS缓冲液中，稀释至200μg/mL。具体分组如下：A:pH＝7.4,GSH＝0mM(对照组)；B:pH＝5.0,GSH＝0mM；C:pH＝7.4,GSH＝10mM；D:pH＝5.0,GSH＝10mM。将以上溶液避光置于恒温摇床孵育(37℃，100rpm)24h后各取10μL滴于铜网上，晾干后用透射电镜观察形态变化。
如图9中所示，对照组A中的Mn-MPDA样品形貌未发生改变；B/C组样品可观察到纳米颗粒的部分降解；同时施加pH值为5.0的酸性条件和10mM还原型谷胱甘肽的D组样品已经完全降解，说明Mn-MPDA具有肿瘤微环境响应性，为随后实现药物的靶向释放奠定了基础。
此外，实施例2-3的实验结果与实施例1类似，此处不再赘述。
实验例5Mn-MPDA的体外光热性质研究
将实施例1制备得到的Mn-MPDA配制成不同浓度(0ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、400ug/mL)的Mn-MPDA水溶液，然后置于2mL比色皿中，用808nm近红外激光照射(0.5W/cm2、1.0W/cm2、1.5W/cm2、2.0W/cm2)，对Mn-MPDA纳米粒子的升温曲线、光热稳定性以及光热转换效率进行表征。
如图10A/B所示，Mn-MPDA材料展现出浓度、激光功率依赖的升温变化，该结果表明Mn-MPDA仍具有良好的光热转换能力，可以有效地将近红外光能转化为热能。如图10C所示，四次升降温循环中Mn-MPDA溶液温度变化(ΔT)差别不大，表明Mn-MPDA具有良好的光热稳定性。随后计算Mn-MPDA的光热转换效率(η)，如图10D所示，通过公式(1)计算得到其具有高的光热转换率，η值为67.97％，公式中的τs经线性拟合为256.44。
此外，实施例2-3的实验结果与实施例1类似，此处不再赘述。
实验例6Mn-MPDA的磁共振成像研究
将实施例1制备得到的Mn-MPDA和对比例1制备得到的MPDA-Mn配制成水溶液，然后分别进行梯度稀释(0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mM)，各取150μL加入96孔板中，在1.5T核磁共振成像仪下进行扫描，表征其T1加权和T2加权MRI成像效果。
如图11A/B，与MPDA-Mn相比(图11C/D)，Mn-MPDA具有更高的纵向弛豫速率(147.27mM-1S-1)和横向弛豫速率(63.67mM-1S-1)。如图11中的map图像显示，随着Mn浓度的升高，Mn-MPDA的T1加权信号逐渐降低、T2加权信号逐渐升高，说明Mn-MPDA可同时作为T1和T2造影剂用于磁共振成像。
此外，实施例2-3的实验结果与实施例1类似，此处不再赘述。
实验例7Mn-MPDA的体外生物相容性研究
通过噻唑蓝(MTT)比色法探究不同浓度(9.375、18.75、37.5、75、150、300μg/mL)的Mn-MPDA(以实施例1为例)对HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)活力的影响。用酶标仪检测570nm处的吸光值A。按照公式(2)计算细胞存活率：
如图12所示，随着样品浓度的升高，HUVEC细胞的存活率基本保持不变，均接近100％。当Mn-MPDA浓度高达300μg/mL，共孵育48h后HUVEC细胞是存活率仍超过80％，表明Mn-MPDA具有较好的生物相容性。
此外，实施例2-3的实验结果与实施例1类似，此处不再赘述。
综合实验例1-7可见，本发明制备得到的Mn-MPDA粒径分布在较窄的球形范围内，粒径均一，呈现均匀分布的介孔结构，水中分散性良好，Mn元素掺杂效率和螯合作用高；具有肿瘤微环境响应性，可实现药物的靶向释放；具有良好的光热转换能力，光热稳定性好；具有较好的生物相容性；可同时作为T1和T2造影剂用于磁共振成像。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。