发明内容

虽然人工油体应用于固定化单酶具有成本低廉，工艺简单，固定化酶的稳定性及重复利用性得到显著提高等优点，但将人工油体固定化单酶应用于酶级联催化反应生产塔格糖体系将存在严重的缺陷。经过本发明人研究发现，多酶催化生产塔格糖途径涉及5种不同酶分子，将5种酶分别固定化混合后用于催化反应，存在严重的底物/产物传质问题，上游产物很难被下游固定化酶快速捕捉，造成级联催化反应的催化效率极大的降低。因而，本发明提出将5种酶共固定化以用于催化反应效果得到了大大的提高。

因此，本发明的目的在于降低固定化酶级联催化反应中严重的底物/产物传质问题，提高固定化多酶级联催化反应的催化效率。利用人工油体共固定化塔格糖生产过程中的5个酶分子，按照特定比例混合5种酶分子通过人工油体同步实现多酶的纯化和固定化。人工油体共固定化多酶避免了酶单独固定化引起的传质问题，提高了多酶级联催化效率，增强多酶体系的稳定性及循环使用效果。该发明提供了一种全新的酶固定化技术用于塔格糖的生产，降低了当前酶法制备塔格糖的生产成本，制备工艺简单。

本发明提供一种人工油体固定化酶，其特征在于，将α-葡聚糖磷酸化酶-油体蛋白融合蛋白，葡萄糖磷酸变位酶-油体蛋白融合蛋白，葡萄糖磷酸异构酶-油体蛋白融合蛋白，6-磷酸塔格糖4位差向异构酶-油体蛋白融合蛋白和6-磷酸塔格糖磷酸酶-油体蛋白融合蛋白混合后与油体，磷脂混合超声处理，离心收集上层物质即为人工油体固定化酶。

在

具体实施方式

中，通过基因工程的方法将油体蛋白基因分别与各酶的基因构建形成表达载体，转化重组菌并表达获得各个融合蛋白。

在具体实施方式中，所述油体蛋白基因是芝麻的olesion 蛋白基因，大豆的olesion 蛋白基因，花生的olesion 蛋白基因。更具体地，所述的油体蛋白基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在具体实施方式中，所述的各种酶是耐热型的，即耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热6-磷酸塔格糖4位差向异构酶和耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶。相对于不耐热的常温酶来说，采用耐热的酶在菌株灭活方面具有优势，即后者在发酵结束后可以通过加热处理的方式将菌株灭活，而同时塔格糖合成相关的酶仍保持活性，从而能够将灭活的菌株混合用来生产塔格糖，更适于工业应用。

具体地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将淀粉磷酸化为葡萄糖-1-磷酸（G1P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、 Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热α-葡聚糖磷酸化酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热α-葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima。

具体地，耐热葡萄糖磷酸变位酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将葡萄糖-1-磷酸（G1P）变位为葡萄糖-6-磷酸（G6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热葡萄糖磷酸变位酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、 Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热葡萄糖磷酸变位酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热葡萄糖磷酸变位酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热葡萄糖磷酸变位酶来源于Pyrococcus furiosus。

具体地，耐热葡萄糖磷酸异构酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将葡萄糖-6-磷酸（G6P）变位为果糖-6-磷酸（F6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热葡萄糖磷酸异构酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、 Caldicellulosiruptor kronotskyensis、 Clostridium thermocellum、Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热葡萄糖磷酸异构酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热葡萄糖磷酸异构酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐热葡萄糖磷酸异构酶来源于Thermus thermophilus。

具体地，耐热6-磷酸塔格糖4位差向异构酶在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有果糖-6-磷酸（F6P）异构为塔格糖-6-磷酸（T6P）功能的酶。进一步优选地，所述耐热6-磷酸塔格糖4位差向异构酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、 Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、 Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、 Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述耐热6-磷酸塔格糖4位差向异构酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热6-磷酸塔格糖4位差向异构酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述耐6-磷酸塔格糖4位差向异构酶来源于Caldicellulosiruptor kronotskyensis。

具体地，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶指在40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有塔格糖-6-磷酸（T6P）脱掉磷酸基团为产物塔格糖（Tagatose）功能的酶。进一步优选地，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶来源于嗜热微生物，例如Geobacillus kaustophilus、Geobacillus stearothermophilus、 Thermotoga maritima、Pseudothermotoga thermarum、Thermococcus kodakarensis、 Archaeoglobus fulgidus、Thermoanaerobacter indiensis、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Clostridium thermocellum、 Caldilinea aerophila、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、 Methanothermobacter marburgensis、Archaeoglobus profundus等；或所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的6-磷酸塔格糖磷酸酶具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，最优选至少95%的同一性。更优选地，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶来源于Archaeoglobus fulgidus。

在优选实施方式中，葡萄糖磷酸变位酶-油体蛋白融合蛋白：α-葡聚糖磷酸化酶-油体蛋白融合蛋白：葡萄糖磷酸异构酶-油体蛋白融合蛋白：6-磷酸塔格糖4位差向异构酶-油体蛋白融合蛋白：6-磷酸塔格糖磷酸酶-油体蛋白融合蛋白按(1-2): (1-2): (1-2):(2-4): (2-4)的质量比混合。

优选地，所述油体是甘油三酯或含有甘油三酯的动植物油；所述磷脂是如来源于动物磷脂，具体如卵磷脂，脑磷脂或心磷脂等。

在优选实施方式中，将融合蛋白的总量与甘油三酯按照质量比为0.5-3:1进行混合，甘油三酯与卵磷脂按照质量比为100:1进行混合，再利用超声处理样品。

在优选实施方式中，所述超声处理的功率20-30%，处理时间5-15分钟；所述离心是于8000-12000 rpm/min下离心5-15 min。

本发明还提供所述的人工油体固定化酶在制备塔格糖中的应用。

具体实施方式中，以淀粉或淀粉衍生物为原料，利用所述人工油体固定化多酶，通过酶催化转化法制备塔格糖。更具体步骤为：取淀粉或淀粉衍生物50~150 g/L，pH值为6.0~7.0的HEPES缓冲液80~120 mM，无机磷酸根8~12 mM，二价镁离子3~7 mM，锌离子或锰离子0.3~0.7 mM，去分支酶3~7 U/ml，所述人工油体固定化多酶1~5 mg/ml，在40~70℃进行酶催化转化反应，收集生成的塔格糖。

进一步地，在反应结束后进行固液分离，收集所述人工油体固定化多酶，循环利用于制备塔格糖，例如可以循环利用所述人工油体固定化多酶2~20次。

本发明采用人工油体共固定化多酶，避免了多酶级联催化反应中由于固定化单酶混合使用带来的传质问题，实现了多酶的纯化和固定化的同步进行，简化了固定化酶的制备工艺；人工油体作为固定化酶的基质，不仅成本低廉，而且提高了固定化酶的稳定性；人工油体固定化多酶用于塔格糖生产反应后经过简单的处理后可循环利用，降低生产成本。