一种预测用于多糖分离的大孔吸附树脂类型的方法
阅读说明：本技术 一种预测用于多糖分离的大孔吸附树脂类型的方法 (Method for predicting type of macroporous adsorption resin for polysaccharide separation ) 是由 邸多隆 孙艳艳 刘建飞 于 2021-01-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种预测用于多糖分离的大孔吸附树脂类型的方法,利用不同类型的大孔吸附树脂对不同规格的葡聚糖进行静态吸附实验从而进行数据收集,然后依次进行数据处理、数据分析、方法构建和方法验证。该模型高效节能、环保便捷、运行成本低,可以避免分离纯化多糖时筛选大孔吸附树脂的盲目性。(The invention discloses a method for predicting the type of macroporous adsorption resin for polysaccharide separation, which is characterized in that different types of macroporous adsorption resin are utilized to carry out static adsorption experiments on glucans with different specifications so as to collect data, and then data processing, data analysis, method construction and method verification are carried out in sequence. The model has the advantages of high efficiency, energy conservation, environmental protection, convenience and low operation cost, and can avoid the blindness of screening the macroporous adsorption resin during the separation and purification of the polysaccharide.)
技术领域
本发明涉及一种预测树脂类型的方法，具体涉及一种预测用于多糖分离的大孔吸附树脂类型的方法，属于化合物分离纯化技术领域。
背景技术
多糖是中药中重要的一类有效成分，在免疫调节、抗氧化、抗病毒、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、降血脂等方面展示出显著而独特的生理、药理活性，已成为中药研究的重要方向之一。多糖的分离纯化是开展多糖研究与开发的重要基础，目前用于大分子分离纯化的色谱填料和层析介质主要是天然多糖类和高分子聚合物类。基于吸附和解吸附分离纯化机制的大孔吸附树脂是一类重要的高分子聚合物分离材料，大孔吸附树脂在分离纯化中药中小分子有效成分方面取得重要的进展，但在分离纯化中药多糖方面尚处于起步阶段。近年来，大孔吸附树脂在多糖分离中的研究与应用逐渐引起国内外研究者的关注。
大孔吸附树脂是一种不含交换基团、具有孔结构的有机高聚物，具有不溶于酸、碱及各种有机溶剂，比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、节省费用等诸多优点。大孔吸附树脂技术分离纯化南瓜渣中的多糖成分，发现经大孔吸附树脂处理后，色素和蛋白质的吸附率分别为84.3％和75.9％，多糖的回收率为84.7％，为更高效利用南瓜多糖资源提供了理论依据。大孔吸附树脂技术由于其独特的吸附性质和物理化学性质，已在分离纯化中药有效成分方面被广泛应用，但由于在大孔吸附树脂与目标分子的构效关系及其分离规律的基础研究方面比较薄弱，导致无法在理论指导下进行大孔吸附树脂精准选择。面对种类繁多的大孔吸附树脂，在预测和筛选对多糖具有最佳分离效能的大孔吸附树脂时，工作量巨大，且往往出现漏筛、误筛。
因此，构建一种预测用于多糖分离的大孔吸附树脂类型的方法，将其用于分离食品、保健食品、特殊医疗用途食品和药品的主要原料，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种预测用于多糖分离的大孔吸附树脂类型的方法；本发明的方法，经验证准确、可靠，从而弥补现有技术的缺陷和不足。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种预测用于多糖分离的大孔吸附树脂类型的方法，包括以下步骤：利用不同类型的大孔吸附树脂对不同规格的葡聚糖进行静态吸附实验从而进行数据收集，然后依次进行数据处理、数据分析、构建预测用的模型方程和准确性验证。
上述技术方案中，所述的方法，具体包括以下步骤：
(1)数据收集：准备不同类型的大孔吸附树脂，每种类型大孔吸附树脂准备N份，每份0.5g；准备不同分子量的葡聚糖对照品的多糖溶液，每种分子量的葡聚糖对照品的多糖溶液准备M份，每份40mL、多糖浓度4mg·mL-1；将0.5g大孔吸附树脂加入到40mL葡聚糖对照品的多糖溶液中，于30℃、100r·min-1条件下恒温振荡吸附24h，然后测定滤液中的多糖含量，得到不同类型的大孔吸附树脂对不同分子量的葡聚糖对照品的吸附量；
(2)数据处理：分别计算出一种分子量的葡聚糖对照品、一种类型的大孔吸附树脂的分子量/孔隙率、分子量/比表面积、分子量/孔容、分子量/孔径后得到的数值；一种类型的大孔吸附树脂对一种分子量葡聚糖对照品的吸附量，以及该种分子量葡聚糖对照品和该种类型的大孔吸附树脂的分子量/孔隙率、分子量/比表面积、分子量/孔容、分子量/孔径，这五个参数构成一组数据，对每组数据进行处理，取自然对数，得到W组数据；W组数据中，吸附量作为因变量参数待用，其他参数的自然对数作为自变量参数待用；
(3)数据分析：采取随机不放回抽样模式，从W组数据中依次抽取几组数据作为训练集建立模型，其余数据作为测试集验证；随机重复W次，计算不同模型的R2和均方根误差RMSE，综合考虑R2和RMSE值，筛选出训练集和测试集的组数；
(4)构建预测用的模型方程：利用步骤(3)筛选出的训练集数据建立多源信息模型方程，依次重复，计算每次模型的拟合方程参数，综合考虑P值和R2值，筛选预测模型方程；利用步骤(3)筛选出的测试集数据对预测模型进行验证，预测效果准确则应用该预测模型方程；
(5)准确性验证：利用步骤(4)得到的预测模型方程预测某一种多糖的吸附量，同时按照步骤(1)的操作利用静态吸附实验进行验证，静态吸附实验的结果与预测值基本吻合，表明该方法可以应用于大孔吸附树脂分离多糖的研究。
上述技术方案中，所述的N为整数，≥2；所述的M为整数，≥2，所述的W为整数，≥2。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的不同类型的大孔吸附树脂，指的是LX-1180大孔吸附树脂、LX-20大孔吸附树脂、LX-T81大孔吸附树脂、LX-T19大孔吸附树脂和D101大孔吸附树脂。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的不同规格的葡聚糖对照品，指的是分子量1000、5000、10000、40000和100000的葡聚糖对照品。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的测定滤液中的多糖含量，采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，操作条件为：TSKgel G3000PWxl色谱柱(7.8mm i.d.×30cm，7μm)；流动相：100％水；流速：1mL·min-1；检测器：蒸发光检测器；检测温度：80℃；进样量：20μL。
上述技术方案中，步骤(3)中，所述的数据分析，具体操作为：Rstudio软件，采取随机不放回抽样模式，从W组数据中依次抽取几组数据作为训练集建立模型，其余数据作为测试集验证；随机重复W次，计算不同模型的R2和均方根误差RMSE，综合考虑因变量受到不同自变量之间的交互作用，利用Rstudio软件进行拟合方程，综合考虑R2和RMSE值，筛选出训练集和测试集的组数。
上述技术方案中，步骤(3)中，综合考虑R2和RMSE值时，RMSE值越小越好，R2越接近1越好。
上述技术方案中，步骤(4)中，所述的构建多源信息模型，具体操作为：利用Rstudio软件将训练集数据建立多源信息模型方程，依次重复，计算每次模型的拟合方程参数，综合考虑P值和R2值，筛选预测模型方程；利用Rstudio软件将测试集数据对预测模型进行验证，预测效果准确则应用该预测模型方程。
上述技术方案中，步骤(4)中，综合考虑P值和R2值时，P值越小越好，R2值越接近1越好。
上述技术方案中，步骤(5)中，所述的某一种多糖，指的是中药材或天然植物中的某一种多糖；优选枸杞多糖LBP-009。
本发明的技术优点在于：中药多糖具有修复肝损伤、降血糖、抗凝血、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒和免疫调节等多种生物活性，不同分子量段的多糖，生物活性有所差异。本发明以收集数据中的变量为基础，通过考察因变量受不同自变量之间的交互作用，构建MAR吸附多糖的多源信息融合模型，本发明的模型经验证准确、可靠，利用该模型预测MAR对中药多糖的吸附作用，可避免多糖分离过程中树脂选择的盲目性。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为本发明实施例1中划分训练集和测试集时的R2值。
图3为本发明实施例1中划分训练集和测试集时的RMSE值。
具体实施方式
以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：
下面结合具体的实施例，对本发明进行阐述：
实施例1：
一种预测用于多糖分离的大孔吸附树脂类型的方法，流程图如图1所示，包括以下步骤：
(1)数据收集：
1.1仪器、试剂与材料
Agilent 1260液相色谱仪(美国Agilent Technologies)，包括：G1312A恒流泵、2200蒸发光检测器、G1328B手动进样器和Agilent Chemstation software工作站；TSKgelG3000PWxl色谱柱(7.8mm i.d.×30cm，7μm)；KQ-250DE型数控超声清洗机(昆山超声仪器有限公司)；BSA224S-CW型万分之一电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；THZ-320台式恒温振荡器(上海精宏实验设备有限公司)。
无水乙醇(分析纯，利安隆博华医药化学有限公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；葡聚糖系列对照品(分子量分别为1000、5000、10000、40000和100000，上海麦克林生化科技有限公司)；枸杞多糖(由中科院兰州化学物理研究所中科院西北特色植物资源化学重点实验室制备、提供)；LX-1180、LX-20、LX-T81、LX-T19和D101型MAR(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)。
1.2对照品溶液的制备
分别称取不同规格的葡聚糖对照品(分子量1000、5000、10000、40000和100000)40mg，加水溶解并定容至10mL，摇匀，即得质量浓度为4mg·mL-1的系列对照品储备溶液，备用。
1.3色谱条件
TSKgel G3000PWxl色谱柱(7.8mm i.d.×30cm，7μm)；流动相：100％水；流速：1mL·min-1；检测器：蒸发光检测器；检测温度：80℃；进样量：20μL。
1.4方法学考察
1.4.1线性关系
分别称取不同规格的葡聚糖对照品(分子量1000、5000、10000、40000和100000)80mg，加水溶解并定容至10mL，即得质量浓度为8mg·mL-1的对照品储备液，各加水稀释制备成0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg·mL-1的葡聚糖对照品溶液，按照“1.3”色谱条件进行测定。以不同分子量的葡聚糖质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，得到上述5种葡聚糖的线性范围均为0.125～8mg·mL-1。同一种分子量的葡聚糖在一定浓度范围内，峰面积与葡聚糖质量浓度呈线性关系。
1.4.2精密度实验
取“1.2”制备的对照品溶液，按照“1.3”色谱条件测定多糖含量，重复进样6次，色谱峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.95％～4.1％，表明仪器精密度良好。
1.4.3稳定性实验
取“1.2”制备的对照品溶液，按照“1.3”色谱条件分别于0、3、6、9、12、24h进样检测，色谱峰面积的RSD为3.2％～4.8％，表明不同分子量的葡聚糖溶液在24h内稳定。
1.4.4重复性实验
精密称取不同分子量的葡聚糖40mg各6份，按照“1.2”方法制备样品溶液6份，按照“1.3”色谱条件测定多糖含量，色谱峰面积的RSD为3.1％～4.8％，表明方法重复性良好。
1.5吸附实验
1.5.1静态吸附实验
称取5种MAR(LX-1180、LX-20、LX-T81、LX-T19和D101)各0.5g，分别置于具塞锥形瓶中，加入4mg·mL-1的多糖溶液40mL，于30℃100r·min-1下恒温振荡吸附24h后，测定滤液中的多糖含量，按公式(1)计算吸附量。
式中，Q为吸附量(mg·g-1)，C0为吸附前多糖的质量浓度(mg·mL-1)，C1为吸附残液中多糖的质量浓度(mg·mL-1)，V1为提取液体积(mL)，W为树脂质量(g)。按照上式计算得到5种大孔吸附树脂对不同分子量葡聚糖的吸附量见表1。
表1大孔吸附树脂静态吸附实验结果
(2)数据处理：
多糖吸附效果的影响因素主要包括分子量和MAR的孔隙率、比表面积、孔容、孔径，分别考察分子量/孔隙率、分子量/比表面积、分子量/孔容、分子量/孔径对多糖吸附量的影响。随着分子量/孔隙率、分子量/比表面积、分子量/孔容、分子量/孔径的不断增加，不同MAR对葡聚糖的吸附量均表现为先增加后降低，推测是由于随着分子量的增加，葡聚糖无法进入MAR内部，导致吸附量下降。
采用“1.5.1”静态吸附实验数据，分别计算出一种分子量的葡聚糖对照品、一种类型的大孔吸附树脂的分子量/孔隙率、分子量/比表面积、分子量/孔容、分子量/孔径后得到的数值；一种类型的大孔吸附树脂对一种分子量葡聚糖对照品的吸附量，以及该种分子量葡聚糖对照品和该种类型的大孔吸附树脂的分子量/孔隙率、分子量/比表面积、分子量/孔容、分子量/孔径，这五个参数构成一组数据，对每组数据进行处理，取自然对数，得到25组数据，结果见表4；对采集的数据取自然对数，其特点归纳如下：数据集包含25组数据，每组数据包括4个自变量和1个因变量，其中因变量“吸附量”受其他4个自变量的影响(表2)。
表2大孔吸附树脂数据分析
中药多糖具有修复肝损伤、降血糖、抗凝血、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒和免疫调节等多种生物活性，不同分子量段的多糖，生物活性有所差异。本研究以25组数据中的变量为基础，通过考察因变量受不同自变量之间的交互作用，构建MAR吸附多糖的多源信息融合模型。利用该模型预测MAR对中药多糖的吸附作用，可避免多糖分离过程中树脂选择的盲目性。
(3)数据分析：
3.1训练集与测试集划分
利用Rstudio软件，采取随机不放回抽样模式，从25组数据中依次抽取17、18、19、20、21、22、23、24组数据作为训练集建立模型，其余数据作为测试集验证。随机重复25次，计算不同模型的R2和均方根误差(RMSE)(见图2和图3)。综合R2和RMSE值的大小，选取23组数据作为训练集建立的模型拟合度和预测能力较好。
(4)利用训练集建立预测模型方程
表3模型方程的参数
利用Rstudio软件，采取随机不放回抽样，从25组数据中抽取23组数据作为训练集建立模型，依次重复20次，计算每次模型的拟合方程参数(见表3)。综合R2和P值大小，选择表3中序号6拟合方程作为预测模型方程(2)。
Y＝5.94X1-25.15X2+6.93X3+17.91X4+5.03X1×X2-23.13X1×X3+25.68X2×X3+8.81X1×X4-15.55X2×X4+11.1X3×X4-18.89X1×X2×X3+1.97X1×X2×X4-10.93X1×X3×X4+14.23X2×X3×X4-6.96X1×X2×X3×X4-8.04
R2＝0.9012
利用Rstudio软件将2组测试集数据对上述预测模型进行验证，模型预测吸附量为36和97.3mg·g-1，RMSE值为19.89，测试集的吸附量数据为7.85和96.85mg·g-1，表明模型预测效果准确。
(5)准确性验证：
枸杞多糖LBP-009是本实验室筛选出具有修复和预防药物性肝损伤的枸杞多糖部位，根据枸杞多糖LBP-009分子量，利用多源信息模型预测MAR对枸杞多糖的吸附效果。结果表明，LX-T19、LX-T81、LX-20、LX-1180和D101型树脂对枸杞多糖的吸附量分别为114.13、112.03、117.40、98.27、72.18mg·g-1，其中吸附效果最好的MAR为LX-20，其吸附量为117.40mg·g-1。利用MAR静态吸附实验进行验证，发现LX-20型MAR对枸杞多糖LBP-009的吸附量为111.23mg·g-1，其结果与预测值基本吻合。由此可见，利用Rstudio软件建立的多源信息融合模型是准确可靠的。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
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