具体实施方式

尽管以下详细描述了本公开内容，但是应理解，本公开内容不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述一些特定实施方案的目的，并且不旨在限制本公开内容的范围，本公开内容的范围将仅受所附权利要求书限制。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。

优选地，本文中使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel和H.编辑，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland，(1995)中所述进行定义。

除非另外指出，否则本公开内容的实施将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，其在本领域的文献中进行了说明(参见例如MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，J.Sambrook et al.eds.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor 1989)。

在下文中，将描述本公开内容的要素。这些要素与一些具体实施方案一起列出，然而，应理解，其可以以任何方式且以任何数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的一些实例和实施方案不应被解释为将本公开内容仅限于明确描述的一些实施方案。本说明书应理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则所有描述要素的任何排列和组合应被认为被本说明书所公开。

术语“约”意指大约或接近，并且在一个实施方案中在本文中所列的数值或范围的情况下意指所列举或要求保护的数值或范围的±20％、±10％、±5％、或±3％。

除非本文中另外指出或者与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为涵盖一个/种和/或更多个/种。本文中数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外指出，否则每个单独值均被并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。除非本文中另外指出或者另外与上下文明显矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本公开内容，而不对权利要求书的范围构成限制。本说明书中的语言均不应被解释为指示实施本公开内容所必需的任何未要求保护的要素。

除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中使用术语“包含/包括”以指示除由“包含/包括”引入的列表的成员之外还可任选地存在其他成员。然而，考虑了作为本公开内容的具体实施方案，术语“包含/包括”涵盖不存在其他成员的可能性，即，出于这个目的，实施方案“包含/包括”应理解为具有“由......组成”的含义。

在本说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文中无论是在上文还是在下文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指南等)均在此通过引用整体并入。本文中的内容均不应解释为承认本公开内容无权早于这样的公开内容。

下面将提供适用于本公开内容的所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其本领域公认的含义。

定义

本文中使用的“减少”、“降低”或“抑制”意指水平(例如，结合水平)的总体降低或导致总体降低的能力，优选5％或更大、10％或更大、20％或更大，更优选50％或更大，并且最优选75％或更大。

例如“提高”或“增强”的术语优选涉及提高或增强约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％，并且最优选至少100％，至少200％，至少500％，或甚至更多。

根据本公开内容，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且多至约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”或“多肽”是指大肽，特别是具有至少约50个氨基酸的肽，但是术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中通常作为同义词使用。

“治疗性蛋白质”当以治疗有效量提供给对象时，对该对象的状况或疾病状态具有积极或有利作用。在一个实施方案中，治疗性蛋白质具有治愈性或姑息治疗性(palliative)特性并且可被施用以改善、缓解、减轻、逆转、延迟疾病或病症发作，或者减轻疾病或病症的一种或更多种症状的严重程度。治疗性蛋白质可具有预防特性，并且可用于延迟疾病发作或减轻这样的疾病或病理状况的严重程度。术语“治疗性蛋白质”包括完整的蛋白质或肽，并且也可指其治疗活性片段。其还可包括蛋白质的治疗活性变体。治疗活性蛋白质的一些实例包括但不限于细胞因子。

对于氨基酸序列(肽或蛋白质)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即表示在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。在C端缩短的片段(N端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的3’端的截短的开放阅读框来获得。在N端缩短的片段(C端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的5’端的截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别地至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。

本文中的“变体”或“变体蛋白质”或“变体多肽”意指由于至少一种氨基酸修饰而不同于野生型蛋白质的蛋白质。亲本多肽可以是天然存在的或野生型(wild type，WT)多肽，或者可以是野生型多肽的经修饰形式。优选地，变体多肽与亲本多肽相比具有至少一种氨基酸修饰，例如与亲本多肽，具有1至约20种氨基酸修饰，并且优选1至约10或1至约5种氨基酸修饰。

本文中使用的“亲本多肽”、“亲本蛋白质”、“前体多肽”或“前体蛋白质”意指随后被修饰以产生变体的未经修饰多肽。亲本多肽可以是野生型多肽，或者野生型多肽的变体或经改造形式。

本文中的“野生型”或“WT”或“天然的”意指在自然界中存在的氨基酸序列，包括等位基因变化。野生型蛋白质或多肽具有未经有意修饰的氨基酸序列。

出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体、异构体和物种同源物，特别是由细胞天然表达的那些。

氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基被插入氨基酸序列中的特定位点中，尽管随机插入并合适筛选所得产物也是可以的。氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸的氨基和/或羧基端融合体。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如，去除1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸。缺失可在蛋白质的任何位置中。在蛋白质的N端和/或C端末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。氨基酸替换变体的特征在于除去序列中的至少一个残基，并在其位置中插入另一个残基。优先考虑的是在同源蛋白质或肽之间非保守的氨基酸序列中的位置中的修饰和/或考虑的是用具有相似特性的另一些氨基酸来替换氨基酸。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即类似带电荷或不带电荷氨基酸的替换。保守的氨基酸变化涉及在其侧链中相关联的氨基酸家族之一的替换。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸替换包括以下组内的替换：

甘氨酸、丙氨酸；

缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；

天冬氨酸、谷氨酸；

天冬酰胺、谷氨酰胺；

丝氨酸、苏氨酸；

赖氨酸、精氨酸；以及

苯丙氨酸、酪氨酸。

优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性的程度将为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。相似性或同一性的程度优选地针对为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度优选地针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选连续氨基酸给出。在一些优选实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考氨基酸序列的全长给出。用于确定序列相似性，优选序列同一性的比对可使用本领域已知的工具，优选地使用最佳序列比对，例如，使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS：：needle，矩阵：Blosum62，空位开放(Gap Open)10.0，空位延伸(Gap Extend)0.5来完成。

“序列相似性”表明相同的或表示保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表明序列之间相同氨基酸的百分比。

术语“百分比同一性”旨在表示在最佳比对之后获得的待比较的两个序列之间相同的氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异是随机分布的并且在其全长内随机分布。两个氨基酸序列之间的序列比较常规上是通过在最佳地对其比对之后对这些序列进行比较来进行的，所述比较是通过区段或通过“比较窗口”进行的，以便鉴定和比较序列相似性的局部区域。用于比较的序列的最佳比对除了人工之外，可借助于Smith and Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法、借助于Neddleman and Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法，借助于Pearson andLipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85，2444的相似性检索方法，或者借助于使用这些算法的计算机程序(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)来产生。

百分比同一性通过确定待比较的两个序列之间相同位置的数目，将该数目除以所比较的位置的数目，并将获得的结果乘以100来计算，以便获得这两个序列之间的百分比同一性。

根据本公开内容，同源氨基酸序列显示出氨基酸残基的至少40％，特别地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，并且优选地至少95％、至少98％或至少99％同一性。

本文中所述的氨基酸序列变体可由技术人员例如通过重组DNA操作来容易地制备。用于制备具有替换、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的DNA序列的操作在例如Sambrooket al.(1989)中详细描述。此外，本文中所述的肽和氨基酸变体可借助于已知的肽合成技术例如如通过固相合成和类似方法来容易地制备。

在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”涉及表现出与该片段或变体所来源的氨基酸序列的功能特性相同或相似的一个或更多个功能特性(即，其是功能等同的)的任何片段或变体。关于细胞因子，一种特定功能是由该片段或变体所来源的氨基酸序列所表现出的一种或更多种免疫调节活性和/或与该片段或变体所来源的氨基酸序列所结合的受体的结合。

“来源于”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。

术语“多核苷酸”在本文中被广泛地解释，并且包括DNA和RNA，包括经修饰的DNA和RNA。

在本公开内容中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。本文中使用的“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2’-位具有羟基的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如部分纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的RNA之经修饰的RNA。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部RNA核苷酸或RNA端。本文中还考虑了RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变的RNA被认为是天然存在RNA的类似物。

在本公开内容的某些实施方案中，RNA是与编码肽或蛋白质的RNA转录物相关的信使RNA(mRNA)。如本领域中认可的，mRNA通常包含5’非翻译区(5’-UTR)、肽编码区和3’非翻译区(3’-UTR)。在一些实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，mRNA通过使用DNA模板的体外转录产生，其中DNA是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。

在一个实施方案中，RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可通过合适DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是eDNA，并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得。cDNA可通过RNA的反转录获得。

在一个实施方案中，RNA可具有经修饰的核糖核苷酸。经修饰的核糖核苷酸的一些实例包括但不限于5-甲基胞苷、假尿苷和/或1-甲基-假尿苷。

在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5’-帽。在一个实施方案中，本公开内容的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。在一个实施方案中，RNA可被5’-帽类似物修饰。术语“5’-帽”是指见于mRNA分子的5’-端的结构，并且通常由通过5’至5’三磷酸连接与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA可通过体外转录来实现，其中5’-帽共同转录表达到RNA链中，或者可使用加帽酶转录后与RNA连接。

在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5’-UTR和/或3’-UTR。术语“非翻译区”或”UTR”涉及DNA分子中被转录但未被翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子(例如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5’-UTR)和/或开放阅读框的3’(下游)(3’-UTR)。5’-UTR(如果存在的话)位于5’端，蛋白质编码区的起始密码子的上游。5’-UTR位于5’-帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5’帽相邻。3’-UTR(如果存在的话)位于3’端，蛋白质编码区的终止密码子的下游，但是术语“3’-UTR”优选不包含poly(A)尾。因此，3’-UTR位于poly(A)序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly(A)序列相邻。

在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含3’-poly(A)序列。术语“poly(A)序列”涉及通常位于RNA分子的3’端的腺苷酸(A)残基的序列。根据本公开内容，在一个实施方案中，poly(A)序列包含至少约20、至少约40、至少约80、或至少约100，并且多至约500、多至约400、多至约300、多至约200、或多至约150个A核苷酸，并且特别是约120个A核苷酸。

在本公开内容的上下文中，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，RNA可被翻译成肽或蛋白质。

关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及通过其mRNA的链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白质的在细胞的核糖体中的过程。

根据本公开内容，术语“RNA编码”意指，如果存在于合适环境中，例如靶组织的细胞内，则RNA可在翻译过程中指导氨基酸的组装以产生其编码的肽或蛋白质。在一个实施方案中，RNA能够与细胞翻译机器相互作用，从而允许肽或蛋白质的翻译。细胞可在细胞内(例如在胞质中和/或在细胞核中)产生编码的肽或蛋白质，可分泌编码的肽或蛋白质，或者可使其在表面上产生。

本文中使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合/融合体”可互换使用。这些术语是指将两个或更多个要素或组成或结构域连接在一起。

本文中使用的“半衰期”是指例如由于天然机制的降解和/或清除或螯合而使化合物(例如肽或蛋白质)的血清或血浆浓度在体内降低50％所花费的时间。适用于本文中的PK延长的白介素(IL)在体内是稳定的，并且其半衰期通过例如与抵抗降解和/或清除或螯合的血清白蛋白(例如HSA或MSA)融合而提高。半衰期可以以本身已知的任何方式，例如通过药代动力学分析来确定。合适的技术对于本领域技术人员而言将是明显的，并且可例如通常包括以下步骤：合适地向对象施用合适剂量的氨基酸序列或化合物；定期收集来自所述对象的血液样品或其他样品；确定所述血液样品中氨基酸序列或化合物的水平或浓度；以及根据由此获得的数据(的图)计算直至氨基酸序列或化合物的水平或浓度与给药时的初始水平相比降低了50％为止的时间。在例如标准手册，例如Kenneth，A.et al.，ChemicalStability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists and in Peters et al.，Pharmacokinetic Analysis：A Practical Approach(1996)中提供另外的细节。也参考Gibaldi，M.et al.，Pharmacokinetics，2nd Rev.Edition，Marcel Dekker(1982)。

细胞因子是一类在细胞信号传导中重要的小蛋白质(约5至20kDa)。它们的释放对它们周围细胞的行为有影响。细胞因子作为免疫调节剂参与自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子，但通常不包括激素或生长因子(尽管术语有些重叠)。细胞因子由广泛多种的细胞产生，所述细胞包括免疫细胞，例如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和多种基质细胞。给定的细胞因子可由多于一种的细胞类型产生。细胞因子通过受体起作用，并且在免疫系统中尤为重要；细胞因子调节体液免疫应答和基于细胞的免疫应答之间的平衡，并且它们调节特定细胞群体的成熟、生长和反应性。一些细胞因子以复杂的方式增强或抑制另一些细胞因子的作用。

白介素-2(IL2)是一种细胞因子，其诱导抗原激活的T细胞的增殖并刺激自然杀伤(natural killer，NK)细胞。IL2的生物活性是通过跨细胞膜的以下三个多肽亚基的多亚基IL2受体复合物(IL2R)介导的：p55(IL2Rα，α亚基，在人中也称为CD25)、p75(IL2Rβ，β亚基，在人中也称为CD122)和p64(IL2Rγ，γ亚基，在人中也称为CD132)。T细胞对IL2的反应取决于多种因素，包括：(1)IL2的浓度；(2)细胞表面上IL2R分子的数目；以及(3)IL2占据的IL2R的数目(即，IL2和IL2R之间的结合相互作用的亲和力(Smith，“Cell Growth SignalTransduction is Quantal”In Receptor Activation by Antigens，Cytokines，Hormones，and Growth Factors 766：263-271，1995))。IL2：IL2R复合物在配体结合之后被内化，并且不同组分进行差异分选。当作为静脉内(intravenous，i.v.)推注施用时，IL2具有快速的全身清除(半衰期为12.9分钟的初始清除阶段，接着是半衰期为85分钟的较慢清除阶段)(Konrad et al.，Cancer Res.50：2009-2017，1990)。

在真核细胞中，人IL2被合成为153个氨基酸的前体多肽，从中去除20个氨基酸以生成成熟的分泌型IL2。重组人IL2已在大肠杆菌(E.coli)中、昆虫细胞中和哺乳动物COS细胞中产生。

癌症患者全身性IL2施用的结果远非理想。尽管15％至20％的患者客观地响应于高剂量IL2，但大多数患者没有响应，并且许多患者遭受严重的、危及生命的副作用，包括恶心、意识错乱、低血压和感染性休克。已尝试了通过降低剂量和调整给药方案来降低血清浓度，并且尽管毒性较低，但是这样的治疗的效果也甚小。

根据本公开内容，在某些实施方案中，本文中所述的IL2变体多肽包含药代动力学修饰基团。在一个实施方案中，本文中所述的IL2变体部分或突变蛋白与药代动力学修饰基团连接。相对于游离IL2，所得分子(下文称为“药代动力学(PK)延长的IL2”)具有延长的循环半衰期。PK延长的IL2的延长的循环半衰期使体内血清IL2的浓度维持在治疗范围内，从而有可能导致许多类型的免疫细胞(包括T细胞)的活化增强。由于PK延长的IL2的有利药代动力学谱，其与未经修饰IL2相比可以以较低的频率给药并且持续更长的时间。

本文中使用的“人IL2”或“野生型人IL2”意指具有天然人IL2的正常存在的133个氨基酸序列(少了信号肽，其由另外的20个N端氨基酸组成)的IL2(无论是天然的还是重组的)，其氨基酸序列描述于Fujita，et.al，PNAS USA，80，7437-7441(1983)中，具有或不具有另外的N端甲硫氨酸，当蛋白质在大肠杆菌中表达为细胞内部分时，必须包含所述甲硫氨酸。在一个实施方案中，人IL2包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列。在一个实施方案中，人IL2的功能性变体包含与SEQ ID NO：17具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，人IL2的功能性变体与IL2受体，特别是IL2受体的α亚基结合。

在本文中所述的某些实施方案中，IL2变体部分或突变蛋白与异源多肽(即，不是IL2且优选地不是IL2的变体的多肽)融合。异源多肽可提高IL2的循环半衰期。如下文进一步详细讨论的，提高循环半衰期的多肽可以是血清白蛋白，例如人或小鼠血清白蛋白。

本文中使用的“IL2突变蛋白”意指IL2的变体(包括其功能性变体)，特别是其中已对IL2蛋白进行特异性替换的多肽。在一个实施方案中，至少在与αβγ IL2受体复合物(IL2Rαβγ)的α亚基接触的位置处对人IL2蛋白进行替换。在一个实施方案中，这样的位置具有野生型人IL2中的酸性或碱性氨基酸残基，其中如果所述氨基酸残基是野生型人IL2中的酸性氨基酸残基，则所述替换是被碱性氨基酸残基替换，并且如果所述氨基酸残基是野生型人IL2中的碱性氨基酸残基，则所述替换是被酸性氨基酸残基替换。一些特别优选的实施方案包括以下：相对于野生型人IL2并根据野生型人IL2进行编号的在第35位的赖氨酸(Lys)残基、在第43位的赖氨酸(Lys)残基、在第61位的谷氨酸(Glu)残基和在第62位的谷氨酸(Glu)残基，或其任意组合。

IL2突变蛋白可在其他未替换残基处具有与野生型IL2相同的氨基酸序列(即，IL2突变蛋白包含“mutCD25”突变，例如其中SEQ ID NO：2至6中任一个的序列与SEQ ID NO：17的序列不同的那些突变)。然而，IL2突变蛋白的特征还可在于在天然IL2多肽链的其他残基中或处的一个或更多个位点处的氨基酸插入、缺失、替换和修饰。根据本发明，任何这样的插入、缺失、替换和修饰可产生IL2突变蛋白，其保留了对IL2Rβγ的亲和力同时对IL2Rαβγ具有降低的亲和力。

例如，IL2突变蛋白的特征还可在于在天然IL2多肽链的其他残基中或处的一个或更多个位点处的氨基酸替换，这样的氨基酸替换导致例如与野生型IL2相比对IL2Rβγ的亲和力相对提高，使得IL2介导的刺激不再需要IL2Rα的参与(即，IL2突变蛋白除mutCD25突变之外还包含“mutβγ”突变，例如，其中SEQ ID NO：18的序列与SEQ ID NO：17的序列不同的那些突变)。这样的突变体是强效的IL2信号传导激动剂。这些突变可在与IL2Rβ和/或IL2Rγ接触的氨基酸残基处。

在多个实施方案中，本文中所述的IL2突变蛋白可通过替换野生型IL2的第24、65、74、80、81、85、86、89、92和93位的残基中的一个或更多个而与野生型IL2不同。替换的氨基酸残基可以是但不一定是保守替换。

例如，突变可以是：I24V、P65H、Q74R、Q74H、Q74N、Q74S、L80F、L80V、R81I、R81T、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F、V93I。

在一个实施方案中，提供了IL2突变蛋白，其中所述突变蛋白包含以下的氨基酸替换组：80F/81D/85V/86V/92F。所述突变蛋白还可包含氨基酸替换42A。所述突变蛋白还可包含以下氨基酸替换中的一种或更多种：24V、65H、74R、74H、74N、74S、89V、93I。

在一些实施方案中，提供了IL2突变蛋白，其中所述突变蛋白包含选自以下的氨基酸替换组：

(i)74N，80F，81D，85V，86V，89V，92F；

(ii)74H，80F，81D，85V，86V，92F；

(iii)74S，80F，81D，85V，86V，92F；

(iv)74N，80F，81D，85V，86V，92F；

(v)80F，81D，85V，86V，92F；

(vi)80F，81D，85V，86V，89V，92F，93I；

(vii)18R，22E，80F，81D，85V，86V，89V，92F，93I，126T；

(viii)18R，22E，74S，80F，81T，85V，86V，89V，92F，93I，126T。

“根据野生型IL2进行编号”我们意指参照该氨基酸在野生型IL2的成熟序列中正常存在的位置来鉴定所选氨基酸。在对IL2突变蛋白进行插入或缺失的情况下，本领域技术人员将理解，在特定位置正常存在的氨基酸可在突变蛋白中移动位置。然而，通过检查和将侧翼氨基酸与位于野生型IL2中氨基酸的侧翼的那些相关联，可容易地确定移动的氨基酸的位置。

本文中所述的IL2变体多肽及编码其的多核苷酸可通过本领域已知的任何合适方法来产生。这样的方法包括将适当的核苷酸变化引入到编码IL2的核酸中或通过IL2多核苷酸或蛋白质的体外合成。例如，可构建编码本文中所述的IL2变体多肽的DNA序列，并且那些序列可在适当转化的宿主中或在任何其他合适的表达系统中表达。该方法将产生本文中所述的IL2变体多肽和/或编码其的RNA。然而，本文中所述的IL2变体多肽及编码其的多核苷酸也可通过化学合成来产生，尽管不太优选。

本文中所述的IL2变体多肽可以以比野生型IL2结合IL2Rαβγ的亲和力更低的亲和力结合IL2Rαβγ。在一个实施方案中，本文中所述的IL2变体多肽可以以比野生型IL2结合IL2Rβγ的亲和力更大的亲和力结合IL2Rβγ。

本文中所述的IL2变体多肽对IL2Rαβγ的亲和力可以比野生型IL2结合IL2Rαβγ的亲和力低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。此外，本文中所述的IL2变体多肽与IL2Rβγ的亲和力可以比野生型IL2结合IL2Rβγ的亲和力大至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。

本文中所述的IL2变体多肽对IL2Rβγ的亲和力可以比对IL2Rαβγ的亲和力高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。

与野生型IL2相比，本文中所述的IL2变体多肽刺激调节性T细胞的能力可能降低，特别是当与刺激效应T细胞和/或NK细胞的能力相比时。

相对于野生型IL2，本文中所述的IL2变体多肽可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸残基的突变(例如，缺失、添加或替换)。

本文中所述的IL2变体多肽可包含与野生型IL2具有至少约50％、至少约65％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本文中所述的IL2变体多肽具有一种或更多种，优选所有以下特性：

1)对IL2Rβγ的激动剂作用。该特性可在依赖于IL2的细胞系的体外增殖测定中直接评价。

2)与野生型IL2相比，丧失了刺激体外和/或体内调节性T细胞群的能力。该特性可例如通过研究该突变蛋白与野生型IL2的突变蛋白相比诱导调节性T细胞扩增的能力来评估。

3)在动物模型中相对于天然IL2提高了治疗性作用。该特性可例如通过比较本文中所述的IL2变体多肽与野生型IL2作为单一治疗在可移植肿瘤模型(例如，B16黑素瘤)中的抗肿瘤或抗转移作用来评估。其也可通过对目的疫苗的细胞和/或体液应答的增强作用来评价。

在激发(mount)免疫应答(包括引发CD8 T细胞)时，许多免疫细胞在活化之后瞬时上调IL2Rαβγ以提高IL2敏感性。由于一些IL2Rαβγ通过IL2结合可能是必须的，因此本发明预想使用本文中所述的IL2Rβγ选择性IL2变体多肽与对IL2Rβγ不表现出优先亲和力的IL2(包括其功能性变体)(例如野生型IL2)组合的混合物。在某些实施方案中，本文中所述的IL2Rβγ-选择性IL2变体多肽与对IL2Rβγ不表现出优先亲和力的IL2的摩尔比为50∶1至1∶1、20∶1至2∶1、10∶1至5∶1、或5∶1至3∶1。

本文中所述的IL2变体多肽可制备为融合多肽或嵌合多肽，其包含IL2变体部分和异源多肽(即，不是IL2或其变体的多肽)。IL2变体可与PK延长的基团融合，这提高了循环半衰期。下文描述了PK延长的基团的一些非限制性实例。应理解，提高细胞因子或其变体的循环半衰期的其他PK基团也适用于本公开内容。在某些实施方案中，PK延长的基团是血清白蛋白结构域(例如，小鼠血清白蛋白、人血清白蛋白)。

本文中使用的术语“PK”是“药代动力学”的首字母缩略词，并且涵盖化合物的包括以下的特性：例如由对象进行的吸收、分布、代谢和清除。本文中使用的“PK延长的基团”是指当与生物活性分子融合或一起施用时提高生物活性分子的循环半衰期的蛋白质、肽或部分。PK延长的基团的一些实例包括：血清白蛋白(例如，HSA)、Fc或Fc片段及其变体、转铁蛋白及其变体和人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)结合剂(如美国公开No.2005/0287153和2007/0003549中所公开的)。另一些示例性PK延长的基团在Kontermann，CurrentOpinion in Biotechnology 2011；22：868-876和Kontermann，Expert Opin BiolTher.2016；16：903-15中公开，其通过引用整体并入本文。本文中使用的“PK延长的IL”是指与PK延长的基团组合的白介素(IL)部分(包括IL变体部分)。在一个实施方案中，PK延长的IL是其中IL部分与PK延长的基团连接或融合的融合蛋白。一个示例性的融合蛋白是其中IL2部分与HSA融合的HSA/IL2融合体。

在某些实施方案中，相对于单独的IL(即，不与PK延长的基团融合的IL)，PK延长的IL的血清半衰期提高。在某些实施方案中，相对于单独的IL的血清半衰期，PK延长的IL的血清半衰期为至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、150％、180％、200％、400％、600％、800％或1000％更长。在某些实施方案中，PK延长的IL的血清半衰期比单独的IL的血清半衰期长至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍或50倍。在某些实施方案中，PK延长的IL的血清半衰期为至少10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时或200小时。

在某些实施方案中，PK延长的基团包括血清白蛋白或其片段或者血清白蛋白或其片段的变体(出于本公开内容的目的，所有这些均由术语“白蛋白”包括)。本文中所述的多肽可以与白蛋白(或其片段或变体)融合以形成白蛋白融合蛋白。这样的白蛋白融合蛋白在美国公开No 20070048282中描述。

本文中使用的“白蛋白融合蛋白”是指通过将至少一个白蛋白分子(或其片段或变体)与至少一个蛋白质分子(例如治疗性蛋白质，特别是IL2(或其变体))融合而形成的蛋白质。白蛋白融合蛋白可通过翻译核酸来产生，其中编码治疗性蛋白质的多核苷酸与编码白蛋白的多核苷酸框内连接。治疗性蛋白质和白蛋白(曾经是白蛋白融合蛋白的一部分)可各自被称为白蛋白融合蛋白的“部分(portion)”、“区域”或“部分(moiety)”(例如“治疗性蛋白质部分”或“白蛋白蛋白质部分”)。在一个高度优选的实施方案中，白蛋白融合蛋白包含至少一个治疗性蛋白质分子(包括但不限于治疗性蛋白质的成熟形式)和至少一个白蛋白分子(包括但不限于白蛋白的成熟形式)。在一个实施方案中，白蛋白融合蛋白由用于所施用RNA的宿主细胞(例如靶器官的细胞(例如肝细胞))加工并被分泌到循环中。在用于表达RNA的宿主细胞分泌途径中发生的新生白蛋白融合蛋白的加工可包括但不限于：信号肽切割；二硫键形成；适当折叠；碳水化合物的添加和加工(例如如N-和O-连接糖基化)；特定的蛋白水解切割；和/或组装成多聚体蛋白质。白蛋白融合蛋白优选由RNA以特别地在其N端具有信号肽的非加工形式编码，并且在由细胞分泌之后优选以加工的形式存在，其中特别地信号肽已被切割掉。在一个最优选的实施方案中，“白蛋白融合蛋白的加工形式”是指已经经历了N端信号肽切割的白蛋白融合蛋白产物，在本文中也称为“成熟的白蛋白融合蛋白”。

在一些优选实施方案中，包含治疗性蛋白质的白蛋白融合蛋白与不与白蛋白融合的相同治疗性蛋白质的血浆稳定性相比，具有更高的血浆稳定性。血浆稳定性通常是指当体内施用治疗性蛋白质并带入血流中与当治疗性蛋白质被降解并从血流中被清除至器官(例如肾或肝)(最终从身体清除治疗性蛋白质)之间的时间段。根据治疗性蛋白质在血流中的半衰期来计算血浆稳定性。治疗性蛋白质在血流中的半衰期可通过本领域已知的常规测定法容易地确定。

本文中使用的“白蛋白”统指具有白蛋白的一种或更多种功能活性(例如，生物活性)的白蛋白蛋白质或氨基酸序列，或白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段或变体，特别是人白蛋白的成熟形式，或者来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子的变体。白蛋白可来源于任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人、牛、绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于母鸡和鲑鱼。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可来自与治疗性蛋白质部分不同的动物。

在某些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白(HSA)或其片段或变体，例如在US 5,876,969、WO 2011/124718、WO 2013/075066和WO 2011/0514789中公开的那些。

术语人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)在本文中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”更广泛，并且涵盖人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。

本文中使用的足以延长治疗性蛋白质的治疗活性或血浆稳定性的白蛋白片段是指这样的白蛋白片段：长度或结构足以稳定或延长蛋白质的治疗活性或血浆稳定性，使得白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的血浆稳定性与非融合状态下的血浆稳定性相比延长或延伸。

白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含白蛋白序列的全长，或者可包含其一个或更多个能够稳定或延长治疗活性或血浆稳定性的片段。这样的片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可包含来自白蛋白序列的约15、20、25、30、50或更多个连续氨基酸，或者可包含白蛋白的特定结构域的一部分或全部。例如，可使用跨越前两个免疫球蛋白样结构域的HSA的一个或更多个片段。在一个优选实施方案中，HSA片段是HSA的成熟形式。

一般而言，白蛋白片段或变体将是至少100个氨基酸长，优选至少150个氨基酸长。

根据本公开内容，白蛋白可以是天然存在的白蛋白或其片段或变体。白蛋白可以是人白蛋白，并且可来源于任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。在一个实施方案中，白蛋白包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

优选地，白蛋白融合蛋白包含白蛋白作为N端部分并且包含治疗性蛋白质作为C端部分。或者，也可使用包含白蛋白作为C端部分并且包含治疗性蛋白质作为N端部分的白蛋白融合蛋白。在另一些实施方案中，白蛋白融合蛋白具有与白蛋白的N端和C端二者融合的治疗性蛋白质。在一个优选实施方案中，在N端和C端融合的治疗性蛋白质是相同的治疗性蛋白质。在另一个优选实施方案中，在N端和C端融合的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质。在一个实施方案中，不同的治疗性蛋白质可用于治疗或预防相同或相关的疾病、障碍或病症。在一个实施方案中，不同的治疗性蛋白质都是细胞因子，其中不同的治疗性蛋白质之一是IL2变体，并且另一个优选地是干扰素，例如IFNβ。在一个实施方案中，白蛋白融合蛋白具有与白蛋白的N端融合的IFNβ和与白蛋白的C端融合的IL2变体。

在一个实施方案中，治疗性蛋白质通过肽接头与白蛋白连接。融合的部分之间的接头肽可在部分之间提供更大的物理分离，并因此使治疗性蛋白质部分的可及性最大化，例如，用于与其结合受体结合。接头肽可由氨基酸组成使得它是柔性的或更刚性的。接头序列可被蛋白酶或化学地切割。

本文中使用的术语“Fc区”是指天然免疫球蛋白的由其两条重链的各自的Fc结构域(或Fc部分)形成的部分。本文中使用的术语“Fc结构域”是指单个免疫球蛋白(Ig)重链的部分或片段，其中Fc结构域不包含Fv结构域。在某些实施方案中，Fc结构域在正好位于木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区中开始，并终止于抗体的C端。因此，完整的Fc结构域包含至少铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方案中，Fc结构域包含以下至少之一：铰链(例如，上部、中间和/或下部铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，CH4结构域，或者其变体、部分或片段。在某些实施方案中，Fc结构域包含完整的Fc结构域(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在某些实施方案中，Fc结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)。在某些实施方案中，Fc结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)。在某些实施方案中，Fc结构域由CH3结构域或其部分组成。在某些实施方案中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，Fc结构域由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在某些实施方案中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，Fc结构域缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。本文中的Fc结构域通常是指包含免疫球蛋白重链的Fc结构域的全部或部分的多肽。这包括但不限于包含完整的CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域的多肽，以及仅包含例如铰链、CH2和CH3结构域的这样的肽的片段。Fc结构域可来源于任何物种和/或任何亚型的免疫球蛋白，包括但不限于：人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体。Fc结构域涵盖天然Fc和Fc变体分子。如本文中所述，本领域普通技术人员将理解，任何Fc结构域可被修饰，使得其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子的天然Fc结构域不同。在某些实施方案中，Fc结构域具有降低的效应子功能(例如，FcγR结合)。

本文中所述的多肽的Fc结构域可来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的Fc结构域可包含来源于IgG1分子的CH2和/或CH3结构域和来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，Fc结构域可包含部分地来源于IgG1分子且部分地来源于IgG3分子的嵌合铰链区。在另一个实例中，Fc结构域可包含部分地来源于IgG1分子且部分地来源于IgG4分子的嵌合铰链。

在某些实施方案中，PK延长的基团包含Fc结构域或其片段或者Fc结构域或其片段的变体(出于本公开内容的目的，所有这些均由术语“Fc结构域”包括)。Fc结构域不包含与抗原结合的可变区。适用于本公开内容的Fc结构域可获自许多不同的来源。在某些实施方案中，Fc结构域来源于人免疫球蛋白。在某些实施方案中，Fc结构域来自人IgG1恒定区。然而，应理解，Fc结构域可来源于其他哺乳动物物种的免疫球蛋白，所述物种包括例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类(例如，黑猩猩、猕猴)物种。

此外，Fc结构域(或其片段或变体)可来源于任何免疫球蛋白种类，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，并且可来源于任何免疫球蛋白同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

多种Fc结构域基因序列(例如，小鼠和人恒定区基因序列)均可以以公共可获得的保藏物的形式得到。可选择缺乏特定效应子功能和/或具有特定修饰以降低免疫原性的包含Fc结构域序列的恒定区结构域。许多抗体和抗体编码基因的序列已被公布，并且可使用本领域公认的技术从这些序列中得到合适的Fc结构域序列(例如，铰链、CH2和/或CH3序列或其片段或变体)。

在某些实施方案中，PK延长的基团是血清白蛋白结合蛋白，例如在US2005/0287153、US2007/0003549、US2007/0178082、US2007/0269422、US2010/0113339、WO2009/083804和WO2009/133208中描述的那些，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，PK延长的基团是转铁蛋白，如在US 7,176,278和US 8,158,579中公开的，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，PK延长的基团是血清免疫球蛋白结合蛋白，例如在US2007/0178082中公开的那些，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，PK延长的基团是与血清白蛋白结合的基于纤连蛋白(Fn)的支架结构域蛋白，例如US2012/0094909中公开的那些，其通过引用整体并入本文。在US2012/0094909中还公开了制备基于纤连蛋白的支架结构域蛋白的方法。基于Fn3的PK延长的基团的一个非限制性实例是Fn3(HSA)，即与人血清白蛋白结合的Fn3蛋白。

在某些方面中，适合于根据本公开内容使用的PK延长的IL，可采用一种或更多种肽接头。本文中使用的术语“肽接头”是指在多肽链的线性氨基酸序列中连接两个或更多个结构域(例如，PK延长的部分和IL部分，例如IL2)的肽或多肽序列。例如，肽接头可用于将IL2部分与HSA结构域连接。

适合于将PK延长的基团与例如IL2融合的接头是本领域公知的。一些示例性的接头包括甘氨酸-丝氨酸-多肽接头、甘氨酸-脯氨酸-多肽接头和脯氨酸-丙氨酸多肽接头。在某些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸-多肽接头，即由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。

除上述异源多肽之外或代替上述异源多肽，本文中所述的IL2变体多肽可包含编码“标志物”或“报道子”的序列。标志物或报道子基因的一些实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(thymidine kinase，TK)、β-半乳糖苷酶以及黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。

适合于根据本公开内容使用的肽和蛋白质抗原通常包括包含用于诱导免疫应答的表位的肽或蛋白质。肽或蛋白质或表位可来源于靶抗原，即针对其引起免疫应答的抗原。例如，肽或蛋白质抗原或该肽或蛋白质抗原中包含的表位可以是靶抗原或靶抗原的片段或变体。

根据本公开内容施用的肽和蛋白质抗原(本身或作为编码所述肽和蛋白质抗原的RNA)，即疫苗抗原，优选在施用该抗原的对象中导致T细胞的刺激、引发和/或扩增。所述刺激、引发和/或扩增的T细胞优选针对靶抗原，特别是由病变细胞、组织和/或器官表达的靶抗原，即疾病相关抗原。因此，疫苗抗原可包含疾病相关抗原或其片段或变体。在一个实施方案中，这样的片段或变体与疾病相关抗原免疫学上等同。在本公开内容的上下文中，术语“抗原的片段”或“抗原的变体”意指导致T细胞的刺激、引发和/或扩增的试剂，该刺激、引发和/或扩增的T细胞靶向抗原，即疾病相关抗原，特别是当由病变细胞、组织和/或器官呈递时。因此，根据本公开内容施用的疫苗抗原可对应于或可包含疾病相关抗原，可对应于或可包含疾病相关抗原的片段，或者可对应于或可包含与疾病相关抗原或其片段同源的抗原。如果根据本公开内容施用的疫苗抗原包含疾病相关抗原的片段或与疾病相关抗原的片段同源的氨基酸序列，则所述片段或氨基酸序列可包含表位(例如疾病相关抗原的T细胞表位)或与表位(例如疾病相关抗原的T细胞表位)同源的序列。因此，根据本公开内容施用的抗原可包含疾病相关抗原的免疫原性片段或与疾病相关抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开内容的“抗原的免疫原性片段”优选地涉及当在MHC分子的情况下存在时能够刺激、引发和/或扩增T细胞的抗原的片段。优选的是疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)可由细胞例如抗原呈递细胞呈递，从而提供相关的表位用于被T细胞结合。根据本公开内容施用的疫苗抗原可以是重组体抗原。

术语“免疫学上等同的”意指例如关于免疫效应类型表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学效应的免疫学上等同的分子，例如免疫学上等同的氨基酸序列。在本公开内容的上下文中，术语“免疫学上等同的”优选地关于抗原或抗原变体用于免疫接种的免疫学效应或特性使用。例如，如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统(例如与参考氨基酸序列结合的T细胞或表达该参考氨基酸序列的细胞)时诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫应答，则所述氨基酸序列与该参考氨基酸序列免疫学上等同。因此，在免疫学上等同于抗原的分子在T细胞的刺激、引发和/或扩增方面表现出与T细胞所靶向的抗原相同或基本上相同的特性和/或发挥相同或基本上相同的作用。

术语“引发”是指其中T细胞首次与其特异性抗原接触并导致分化为效应T细胞的过程。

术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体扩增的过程。在本公开内容的上下文中，该术语优选在免疫应答的情况下使用，在所述免疫应答中淋巴细胞被抗原刺激，增殖，并且扩增识别所述抗原的特异性淋巴细胞。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞分化。

术语“抗原”涉及包含这样的表位的物质：针对该表位可产生免疫应答。特别地，术语“抗原”包含蛋白质和肽。在一个实施方案中，抗原由免疫系统的细胞(例如抗原呈递细胞如树突细胞或巨噬细胞)呈递。在一个实施方案中，抗原或其加工产物例如T细胞表位，通过T或B细胞受体或通过免疫球蛋白分子例如抗体结合。因此，抗原或其加工产物可与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应。在一个实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位来源于这样的抗原。

术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是这样的分子：其包含刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。因此，疾病相关抗原或其表位可用于治疗性目的。疾病相关抗原可与微生物(通常是微生物抗原)感染相关或者与癌症(通常是肿瘤)相关。

术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的成分，其可来源于细胞质、细胞表面和细胞核。特别地，它是指在细胞内产生或在肿瘤细胞上作为表面抗原产生的那些抗原。肿瘤抗原通常优先地由癌细胞表达(例如，与非癌细胞相比，在癌细胞中其以更高的水平表达)，并且在一些情况下，其仅由癌细胞表达。肿瘤抗原的一些实例包括但不限于：p53，ART-4，BAGE，β-联蛋白/m，Bcr-abL CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK4/m，CEA，密蛋白家族的细胞表面蛋白例如密蛋白-6、密蛋白-18.2和密蛋白-12，c-MYC，CT，Cyp-B，DAM，ELF2M，ETV6-AML1，G250，GAGE，GnT-V，Gap 100，HAGE，HER-2/neu，HPV-E7，HPV-E6，HAST-2，hTERT(或hTRT)，LAGE，LDLR/FUT，MAGE-A，优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12，MAGE-B，MAGE-C，MART-1/Melan-A，MC1R，肌球蛋白/m，MUC1，MUM-1，MUM-2，MUM-3，NA88-A，NF1，NY-ESO-1，NY-BR-1，p190小BCR-abL，Pml/RARa，PRAME，蛋白酶3，PSA，PSM，RAGE，RU1或RU2，SAGE，SART-1或SART-3，SCGB3A2，SCP1，SCP2，SCP3，SSX，存活蛋白，TEL/AML1，TPI/m，TRP-1，TRP-2，TRP-2/INT2，TPTE，WT和WT-1。

术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。

术语“细菌抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何细菌成分。细菌抗原可来源于细菌的细胞壁或细胞质膜。

术语“表位”是指分子(例如抗原)被免疫系统识别的部分或片段。例如，表位可以被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包含T细胞表位。

术语“T细胞表位”是指当在MHC分子的情况下存在时被T细胞识别的蛋白质的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex)”和缩写“MHC”包括I类MHC和II类MHC分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白或分子对于免疫应答中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被T细胞上的T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入的微生物的片段)二者展示给T细胞。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约8至约10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约10至约25个氨基酸，并且特别地长约13至约18个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。

术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和包括细胞裂解性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)。术语“抗原特异性T细胞”或类似术语涉及识别T细胞靶向的抗原的T细胞，特别是当在MHC分子的情况下呈现在抗原呈递细胞或病变细胞(例如癌细胞)的表面上时，并且优选发挥T细胞的效应功能。如果T细胞杀伤表达抗原的靶细胞，则认为T细胞对抗原具有特异性。可使用多种标准技术中的任何一种来评价T细胞特异性，例如，在铬释放分析或增殖测定中。或者，可测量淋巴因子(例如干扰素-γ)的合成。

“调节性T细胞”或“Treg”是调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性以及预防自身免疫病的T细胞亚群。Treg是免疫抑制的，并且通常抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。Treg表达生物标志物CD4、FoxP3和CD25。

本文中使用的术语“初始T细胞”是指不同于活化T细胞或记忆T细胞，在外周内未接触其同源抗原的成熟T细胞。初始T细胞的特征通常在于L-选择素(CD62L)的表面表达，不存在活化标志物CD25、CD44或CD69，以及不存在记忆CD45RO同种型。

本文中使用的术语“记忆T细胞”是指先前已接触并响应于其同源抗原的T细胞亚组或亚群。在与抗原第二次接触时，记忆T细胞可复制以产生比第一次免疫系统响应于抗原更快且更强的免疫应答。记忆T细胞可以是CD4⁺或CD8⁺并且通常表达CD45RO。

本文中使用的术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指由CD56或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的缺失定义的外周血淋巴细胞亚群。如本文提供的，NK细胞也可由干细胞或祖细胞分化。

在一个实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原，并且包含表位或其片段(例如，表位)的肽或蛋白质来源于肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是“标准”抗原，通常已知其在多种癌症中表达。肿瘤抗原也可以是“新抗原”，其对个体的肿瘤具有特异性，并且先前未被免疫系统识别。新抗原或新表位可以是由癌细胞基因组中导致氨基酸变化的一种或更多种癌症特异性突变导致的。如果肿瘤抗原是新抗原，则包含表位的肽或蛋白质优选包含含有一个或更多个氨基酸变化的所述新抗原的表位或片段。

癌症突变因个体而异。因此，编码的新的表位(新表位)的癌症突变在疫苗组合物和免疫治疗的开发中代表有吸引力的靶标。肿瘤免疫治疗的效力取决于能够在宿主内诱导强效免疫应答的癌症特异性抗原和表位的选择。RNA可用于将患者特异性肿瘤表位递送至患者。存在于脾中的树突细胞(DC)代表对免疫原性表位或抗原(例如肿瘤表位)的RNA表达特别感兴趣的抗原呈递细胞。已示出多种表位的使用促进肿瘤疫苗组合物中的治疗效力。肿瘤突变组的快速测序可为个体化疫苗提供多个表位，其可由本文中所述的RNA编码，例如作为单一多肽，在其中表位任选地被接头分开。在本公开内容的某些实施方案中，RNA编码至少一个表位、至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。一些示例性的实施方案包括编码至少五个表位(称为“五表位(pentatope)”)的RNA和编码至少十个表位(称为“十表位(decatope)”)的RNA。

肽和蛋白质抗原可以是2至100个氨基酸，包括例如长度为5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸或50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于100个氨基酸。

肽或蛋白质抗原可以是可诱导或提高免疫系统产生响应于所述肽或蛋白质的抗体和T细胞的能力的任何肽或蛋白质。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂与本文中所述的其他治疗剂(例如，编码白介素(IL)-2变体多肽的RNA和任选地编码包含表位的肽或蛋白质的RNA)组合使用。

本文中使用的“免疫检查点”是指调节抗原的T细胞受体识别的幅度和质量的共刺激和抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检查点是抑制性信号。在某些实施方案中，抑制性信号是PD-1与PD-L1之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是CTLA-4与CD80或CD86之间的相互作用以取代CD28结合。在某些实施方案中，抑制性信号是LAG3与II类MHC分子之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是TIM3与半乳糖凝集素9之间的相互作用。

本文中使用的“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分降低、抑制、干扰或调节一种或更多种检查点蛋白质的分子。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止与免疫检查点相关的抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏与免疫检查点相关的抑制性信号传导的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏抑制性信号传导的小分子。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止检查点阻断剂蛋白质之间的相互作用的抗体、其片段或抗体模拟物，例如，阻止PD-1与PD-L1之间的相互作用的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止CTLA-4与CD80或CD86之间的相互作用的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止LAG3与其配体或TIM-3与其配体之间的相互作用的抗体或其片段。检查点抑制剂也可以以分子(或其变体)自身的可溶性形式的形式，例如可溶性PD-L1或PD-L1融合。

“程序性死亡-1(Programmed Death-1，PD-1)”受体是指属于CD28家族的免疫抑制性受体。PD-1主要在体内先前活化的T细胞上表达，并且与两个配体(PD-L1和PD-L2)结合。本文中使用的术语“PD-1”包含人PD-1(hPD-1)、hPD-1的变体、同工型和物种同源物，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。

“程序性死亡配体-1(Programmed Death Ligand-1，PD-L1)”是PD-1(另一个是PD-L2)的两个细胞表面糖蛋白配体之一，其与PD-1结合时下调T细胞活化和细胞因子分泌。本文中使用的术语“PD-L1”包含人PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1的变体、同工型和物种同源物，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。

“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)”是T细胞表面分子并且是免疫球蛋白超家族的成员。该蛋白质通过与CD80和CD86结合而下调免疫系统。本文中使用的术语“CTLA-4”包含人CTLA-4(hCTLA-4)、hCTLA-4的变体、同工型和物种同源物，以及与hCTLA-4具有至少一个共同表位的类似物。

“淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte Activation Gene-3，LAG3)”是通过与II类MHC分子结合而与淋巴细胞活性的抑制相关的抑制性受体。该受体增强Treg细胞的功能并抑制CD8+效应T细胞功能。本文中使用的术语“LAG3”包含人LAG3(hLAG3)、hLAG3的变体、同工型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。

“T细胞膜蛋白-3(TIM3)”是通过抑制TH1细胞应答而参与淋巴细胞活性的抑制的抑制性受体。其配体是在多种类型的癌症中均被上调的半乳糖凝集素9。本文中使用的术语“TIM3”包含人TIM3(hTIM3)、hTIM3的变体、同工型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。

“B7家族”是指具有未定义受体的抑制性配体。B7家族涵盖B7-H3和B7-H4，二者在肿瘤细胞和肿瘤浸润细胞上均上调。

在某些实施方案中，适用于本文所公开的方法的免疫检查点抑制剂是抑制性信号的拮抗剂，例如靶向例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、B7-H3、B7-H4或TIM3的抗体。这些配体和受体在Pardoll，D.，Nature.12：252-264，2012中综述。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏或抑制来自抑制性免疫调节剂的信号传导的抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏或抑制来自抑制性免疫调节剂的信号传导的小分子。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是PD-1/PD-L1信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用破坏PD-1受体与其配体PD-L1之间的相互作用的抗体或其抗原结合部分。与PD-1结合并破坏PD-1与其配体PD-L1之间的相互作用的抗体是本领域中已知的。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与PD-L1特异性结合并抑制其与PD-1的相互作用，从而提高免疫活性。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是CTLA4信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向CTLA4并破坏其与CD80和CD86的相互作用的抗体或其抗原结合部分。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是LAG3(淋巴细胞活化基因3)信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向LAG3并破坏其与II类MHC分子的相互作用的抗体或其抗原结合部分。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是B7家族信号传导途径的组分。在某些实施方案中，B7家族成员是B7-H3和B7-H4。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向B7-H3或H4的抗体或其抗原结合部分。B7家族没有任何定义的受体，但是这些配体在肿瘤细胞或肿瘤浸润细胞上均被上调。临床前小鼠模型已示出这些配体的阻断可增强抗肿瘤免疫。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是TIM3(T细胞膜蛋白3)信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向TIM3并破坏其与半乳糖凝集素9的相互作用的抗体或其抗原结合部分。

本领域普通技术人员将理解，其他免疫检查点靶标也可被拮抗剂或抗体靶向，条件是这种靶向导致刺激免疫应答，例如抗肿瘤免疫应答，如反映在例如，T细胞增殖的提高、T细胞活化的增强和/或细胞因子(例如，IFN-γ、IL2)产生的提高。

根据本公开内容，术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。术语“抗体”包含单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(omplementarity determining region，CDR)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(framework region，FR)。每个VH和VL由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包含免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。

抗体可来源于不同物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。

本文中所述的抗体包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM和IgD抗体。在多个实施方案中，抗体是IgG1抗体，更特别地是IgG1，κ或IgG1，λ同种型(即IgG1，κ、λ)；IgG2a抗体(例如IgG2a，κ、λ)；IgG2b抗体(例如IgG2b，κ、λ)；IgG3抗体(例如IgG3，κ、λ)或IgG4抗体(例如IgG4，κ、λ)。

术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“结合部分”)或抗体的“抗原结合片段”(或简称为“结合片段”)或者类似的术语是指抗体中保留与抗原特异性结合之能力的一个或更多个片段。已表明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段进行。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的一些实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的互补性决定区(CDR)和(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但是其可使用重组方法通过合成接头连接，使得其能够作为单个蛋白质链制成，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(single chain Fv，scFv)；参见例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体还旨在涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”内。另一个实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽，(ii)与所述铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，以及(iii)与所述CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。所述结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。结合结构域免疫球蛋白融合蛋白在US2003/0118592和US 2003/0133939中进一步公开。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式针对用途对片段进行筛选。

根据本发明，特别优选的是，本文中所述的肽、蛋白质或多肽，特别是IL2变体多肽和/或抗原，以编码本文中所述的肽、蛋白质或多肽的RNA的形式施用。在一个实施方案中，不同的本文中所述的肽、蛋白质或多肽由不同的RNA分子编码。

根据本公开内容，在施用本文中所述的RNA之后，至少一部分RNA被递送至靶细胞。在一个实施方案中，至少一部分RNA被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，RNA被靶细胞翻译以产生所编码的肽或蛋白质。

本公开内容的一些方面涉及将本文中所公开的RNA(编码IL-2变体多肽的RNA和任选地编码包含表位的肽或蛋白质的RNA)靶向递送至某些组织。

在一个实施方案中，本公开内容涉及靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别地是脾。如果施用的RNA是编码包含表位的肽或蛋白质的RNA，则特别优选靶向淋巴系统，特别是次要淋巴器官，更特别地是脾。

在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。

“淋巴系统”是循环系统的一部分并且是免疫系统的重要部分，包含运送淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的传导网络和循环淋巴组成。原发性或中央淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成原发性淋巴器官。次级或外周淋巴器官(包括淋巴结和脾)维持成熟的初始淋巴细胞并启动适应性免疫应答。

RNA可通过所谓的脂质复合物制剂递送至脾，其中RNA与包含阳离子脂质和任选地另外的或辅助脂质(helper lipid)的脂质体结合以形成可注射的纳米粒制剂。脂质体可通过将乙醇中的脂质溶液注入到水或合适的水相中而获得。RNA脂质复合物颗粒可通过将脂质体与RNA混合来制备。靶向RNA脂质复合物颗粒的脾在WO 2013/143683中描述，其通过引用并入本文。已发现具有净负电荷的RNA脂质复合物颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在施用RNA脂质复合物颗粒之后，在脾中发生RNA积聚和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA脂质复合物颗粒可用于在脾中表达RNA。在一个实施方案中，在施用RNA脂质复合物颗粒之后，在肺和/或肝中没有或基本上没有RNA积聚和/或RNA表达发生。在一个实施方案中，在施用RNA脂质复合物颗粒之后，在脾中在抗原呈递细胞(例如专职抗原呈递细胞)中发生RNA积聚和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA脂质复合物颗粒可用于在这样的抗原呈递细胞中表达RNA。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。

在本公开内容的上下文中，术语“RNA脂质复合物颗粒”涉及包含脂质(特别是阳离子脂质)和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNA脂质复合物颗粒的络合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可使用阳离子脂质(例如DOTMA)和另外的脂质(例如DOPE)合成。在一个实施方案中，RNA脂质复合物颗粒是纳米粒。

本文中使用的“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过静电相互作用与脂质基质与带负电荷的RNA结合。通常来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头基通常携带正电荷。阳离子脂质的一些实例包括但不限于：1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基双二十八烷基铵(DDAB)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、1，2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1，2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、2，3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基铵(DMRIE)、1，2-二豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1，2-二豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1，2-二油氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)、和2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(DOSPA)。优选的是DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在一些具体实施方案中，所述阳离子脂质是DOTMA和/或DOTAP。

可并入另外的脂质以调整总的正负电荷比和RNA脂质复合物颗粒的物理稳定性。在某些实施方案中，所述另外的脂质是中性脂质。本文中使用的“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的一些实例包括但不限于1，2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在一些具体实施方案中，另外的脂质是DOPE、胆固醇和/或DOPC。

在某些实施方案中，RNA脂质复合物颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是DOTMA，并且另外的脂质是DOPE。

在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、或约3∶1至约1∶1。在一些具体实施方案中，摩尔比可以为约3∶1、约2.75∶1、约2.5∶1、约2.25∶1、约2∶1、约1.75∶1、约1.5∶1、约1.25∶1、或约1∶1。在一个示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约2∶1。

在一个实施方案中，本文中所述的RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm。在一些具体实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm、或约1000nm。在一个实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约250nm至约700nm。在另一个实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约300nm至约500nm。在一个示例性实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约400nm。

本公开内容的RNA脂质复合物颗粒的电荷是至少一种阳离子脂质中存在的电荷与RNA中存在的电荷的总和。电荷比是至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的比。至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的电荷比通过以下方程来计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中正电荷总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中负电荷总数)]。

本文中所述的靶向脾的RNA脂质复合物颗粒在生理pH下优选具有净负电荷，例如正电荷与负电荷的电荷比为约1.9∶2至约1∶2。在一些具体实施方案中，在生理pH下RNA脂质复合物颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.9∶2.0、约1.8∶2.0、约1.7∶2.0、约1.6∶2.0、约1.5∶2.0、约1.4∶2.0、约1.3∶2.0、约1.2∶2.0、约1.1∶2.0或约1∶2.0。

RNA递送系统对肝具有固有的偏好。这涉及基于脂质的颗粒、阳离子和中性纳米粒，特别是生物缀合物中的脂质纳米粒，例如脂质体、纳米胶束和亲脂性配体。肝积聚是由肝血管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。

在本文中所述的IL2变体多肽的靶向递送的一个实施方案中，靶器官是肝并且靶组织是肝组织。特别地，如果期望在该器官或组织中存在IL2变体多肽和/或如果期望表达大量IL2变体多肽和/或如果期望或需要IL2变体多肽的全身性存在，特别是以显著量全身性存在，则优选递送至这样的靶组织。

在一个实施方案中，编码IL2变体多肽的RNA以用于靶向肝的制剂施用。这样的制剂在上文中进行了描述。

为了在体内将RNA递送至肝，可使用药物递送系统通过防止其降解将RNA运送到肝中。例如，由聚(乙二醇)(PEG)包被的表面和包含mRNA的核心组成的复合纳米胶束是有用的系统，因为纳米胶束在生理条件下提供了优异的体内RNA稳定性。此外，由密集的PEG栅栏构成的复合纳米纳米胶束表面所提供的隐身特性有效地规避了宿主免疫防御。

本文中所述的肽、蛋白质、多肽、RNA、RNA颗粒和另一些试剂(例如，免疫检查点抑制剂)，可以以药物组合物或药物施用用于治疗性或预防性治疗，并且可以以任何合适的药物组合物的形式施用。

术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的制剂。通过将所述药物组合物施用于对象，所述药物组合物可用于治疗、预防或者减轻疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。在本公开内容的上下文中，药物组合物包含本文中所述的肽、蛋白质、多肽、RNA、RNA颗粒和/或另一些试剂。

本公开内容的药物组合物可包含一种或更多种佐剂或可与一种或更多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包括化合物例如油乳剂(例如，弗氏佐剂(Freund’s adjuvant))、矿物质化合物(例如明矾)、细菌产品(例如百日咳鲍特菌毒素)或免疫刺激复合物的非均质组。佐剂的一些实例包括但不限于：LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。趋化因子可以是IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-a。另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油类，例如ISA51。用于本公开内容的另一些合适的佐剂包括脂肽，例如Pam3Cys。

根据本公开内容的药物组合物通常以“药学有效量”和“可药用制剂”施加。

术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。

术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及对疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应还可以是延迟所述疾病或所述病症的发生或预防其发生。本文中所述的组合物的有效量将取决于：待治疗的病症，疾病的严重程度，患者的个体参数包括年龄、生理状况、身材大小和体重，治疗持续时间，伴随治疗(如果存在的话)的类型，具体施用途径以及类似因素。因此，本文中所述的组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在采用初始剂量患者的反应不足的情况下，可使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现有效地更高的剂量)。

本公开内容的药物组合物可包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选地其他治疗剂。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。

用于本公开内容的药物组合物中的合适的防腐剂包括但不限于：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。

本文中使用的术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的一些实例包括但不限于：载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。

术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或冲淡剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬剂和/或混合介质中的任何一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。

术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。本文中使用的载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于：无菌水、林格液(Ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含等张盐水。

用于治疗用途的可药用载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R Gennaroedit.1985)中。

可根据预期的施用途径和标准药物实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。

在一个实施方案中，本文中所述的药物组合物可静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内施用。在某些实施方案中，将药物组合物配制成用于局部施用或全身性施用。全身性施用可包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。本文中使用的“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道之外的任何方式的施用，例如通过静脉内注射。在一个优选实施方案中，将药物组合物配制成用于全身性施用。在另一个优选实施方案中，全身性施用通过静脉内施用。

本文中使用的术语“共施用”意指其中将不同的化合物或组合物(例如，编码IL2变体多肽的RNA、编码包含表位的肽或蛋白质的RNA以及任选地免疫检查点抑制剂)施用于同一患者的过程。编码IL2变体多肽的RNA和编码包含表位的肽或蛋白质的RNA可同时、基本上同时或依次施用。如果施用依次进行，则可在施用编码包含表位的肽或蛋白质的RNA之前或之后施用编码IL2变体多肽的RNA。如果施用同时进行，则不需要在同一组合物中施用编码IL2变体多肽的RNA和编码包含表位的肽或蛋白质的RNA。编码IL2变体多肽的RNA和编码包含表位的肽或蛋白质的RNA可施用一次或更多次，并且每种组分的施用次数可以相同或不同。另外，不需要在同一部位施用编码IL2变体多肽的RNA和编码包含表位的肽或蛋白质的RNA。

本文中所述的IL2变体多肽、编码IL2变体多肽的多核苷酸、包含编码IL2变体多肽的多核苷酸的宿主细胞、药物组合物和治疗方法可用于多种疾病，特别是其中向对象提供IL2，特别是本文中所述的IL2变体多肽会产生治疗性或预防性作用的疾病(例如癌症、自身免疫病、感染性疾病)的治疗性或预防性治疗，癌症疫苗和常规疫苗治疗中的疫苗佐剂以用于在年长个体或其他免疫受损个体以及HIV或人SCID患者中进行免疫刺激，或者需要在任何合适的动物(优选哺乳动物，最优选人)中一般地刺激免疫系统的其他治疗应用。IL2具有许多作用。这些中的一些是刺激T细胞，特别是记忆T细胞、初始T细胞和/或效应T细胞和/或NK细胞。本文中所述的IL2变体多肽将对仅表达中等亲和力IL2受体的细胞类型(例如记忆T细胞、初始T细胞和/或效应T细胞)而不是表达高亲和力IL2受体的细胞类型(例如调节性T细胞)具有活性。因此，考虑了本文中所述的IL2变体多肽、编码IL2变体多肽的多核苷酸、包含编码IL2变体多肽的多核苷酸的宿主细胞、药物组合物和治疗方法在治疗其中预期IL2由于其T细胞活性而提供有效治疗的那些疾病中的用途。

作为替代，或除直接向患者施用的方法之外，在一些实施方案中，IL2变体多肽可用于离体方法中。例如，可在培养基中体外培养细胞(例如，从患者分离并放置或维持在培养物中的外周血淋巴细胞或纯化的淋巴细胞群)，并且可通过向培养基添加IL2变体多肽和/或编码其的多核苷酸来影响接触步骤。培养步骤可包括另一些步骤，其中用其他试剂刺激或处理细胞，例如以刺激增殖或扩增对目的抗原(例如，癌症抗原或病毒抗原)具有反应性的细胞群。然后在对细胞进行处理之后将其施用于患者。

术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于是指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡或者与该个体接触的那些的类似问题的任何病症。在此更广泛的意义上，疾病有时包括损伤、失能、障碍、综合征、感染、孤立症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下和出于另一些目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上而且在情感上影响个体，因为对许多疾病的感染和经历可改变个体对生活的看法和个体的性格。

在本发明背景下，术语“治疗”或“治疗性干预”涉及出于对抗病症例如疾病或障碍目的的对对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病症或障碍目的的对个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防症状或并发症的发作。

术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可在个体中消除疾病、在个体中阻止或减缓疾病的发生、在个体中抑制或减缓疾病的发生，在个体中降低症状的频率或严重程度，和/或在目前患有或以前曾患有疾病的个体中降低复发。

术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。

术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可受疾病或病症(例如，癌症)折磨或易于患有疾病或病症(例如，癌症)但是可患有或可未患有疾病或病症的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。

术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。

在本公开内容的一个实施方案中，目的是提供针对表达抗原的病变细胞(例如表达肿瘤抗原的癌细胞)的免疫应答，并且治疗涉及表达抗原例如肿瘤抗原的细胞的疾病例如癌症疾病。

可将包含编码包含表位的肽或蛋白质的RNA的药物组合物施用于对象以在对象中引发针对包含所述表位的抗原的免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。本领域技术人员将知道免疫治疗和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用抗原或表位对对象进行免疫接种来产生针对疾病的免疫保护性反应，所述抗原或表位在免疫学上与待治疗的疾病相关。因此，本文中所述的药物组合物可应用于诱导或增强免疫应答。因此，本文中所述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。

本文中使用的“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的整合的身体应答，并且是指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。细胞免疫应答包括但不限于针对表达抗原并且以用I类或II类MHC分子呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答与T淋巴细胞相关，T淋巴细胞可归类为辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)，其通过调节免疫应答或杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞，CD8+T细胞或CTL)发挥主要作用，在感染的细胞或癌细胞中诱导凋亡。在一个实施方案中，施用本公开内容的药物组合物涉及刺激针对表达一种或更多种肿瘤抗原的癌细胞的抗肿瘤CD8+T细胞应答。在一个具体实施方案中，肿瘤抗原与I类MHC分子一起呈递。

本公开内容考虑了可以是保护性、防止性、预防性和/或治疗性的免疫应答。本文中使用的“诱导免疫应答”可指示在诱导之前不存在针对特定抗原的免疫应答，或者可指示在诱导之前存在针对特定抗原的基础水平的免疫应答，其在诱导之后增强。因此，“诱导免疫应答”包括“增强免疫应答”。

术语“免疫治疗”涉及通过诱导或增强免疫应答来治疗疾病或病症。术语“免疫治疗”包括抗原免疫接种或抗原疫苗接种。

术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了以诱导免疫应答为目的例如出于治疗性或预防性的原因而向个体施用抗原的过程。

本文中所述的肽、蛋白质、多肽、RNA、RNA颗粒和另一些试剂(例如，免疫检查点抑制剂)可用于治疗性或预防性治疗这样的疾病，其中向对象提供包含用于在所述对象中诱导针对抗原之免疫应答的表位的肽或蛋白质会产生治疗性或预防性作用。例如，提供来源于病毒的抗原或表位可用于治疗由所述病毒引起的病毒性疾病。提供肿瘤抗原或表位可用于治疗其中癌细胞表达所述肿瘤抗原的癌症疾病。

在一个实施方案中，本公开内容设想了这样的实施方案，其中施用靶向脾组织的本文中所述的RNA制剂(例如RNA脂质复合物颗粒)。RNA编码例如包含例如本文中所述表位的肽或蛋白质。RNA被脾中的抗原呈递细胞(例如树突细胞)摄取以表达肽或蛋白质。在抗原呈递细胞进行任选的加工和呈递之后，可产生针对表位的免疫应答，从而导致对涉及表位或包含所述表位的抗原的疾病的预防性和/或治疗性治疗。在一个实施方案中，由本文中所述的RNA诱导的免疫应答包括抗原呈递细胞例如树突细胞和/或巨噬细胞对抗原或其片段例如表位的呈递，以及由于该呈递而引起的细胞毒性T细胞的活化。例如，由RNA或其加工产物编码的肽或蛋白质可由在抗原呈递细胞上表达的主要组织相容性复合体(MHC)蛋白来呈递。然后，MHC肽复合物可被免疫细胞(例如T细胞或B细胞)识别，从而导致其活化。

因此，本公开内容涉及本文中所述的RNA，其用于预防性和/或治疗性治疗涉及抗原的疾病，优选癌症疾病。

术语“巨噬细胞”是指通过单核细胞的分化产生的吞噬细胞的亚组。被炎症、免疫细胞因子或微生物产物活化的巨噬细胞在巨噬细胞内通过水解和氧化攻击非特异性地吞噬并杀伤外来病原体，从而导致病原体的降解。来自降解的蛋白质的肽显示在巨噬细胞表面上，在这里其可被T细胞识别，并且其可直接与B细胞表面上的抗体相互作用，从而导致T细胞和B细胞活化并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。

术语“树突细胞”(DC)是指吞噬细胞的另一亚型，其属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，树突细胞来源于造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征在于高吞噬活性和低T细胞活化潜能。未成熟的树突细胞不断采样周围环境中的病原体，例如病毒和细菌。一旦其与可呈递的抗原接触，其就被活化成为成熟的树突细胞，并且开始迁移至脾或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解为小块(piece)，并且在成熟之后，这些片段使用MHC分子呈现在其细胞表面处。同时，其上调了在T细胞活化中充当共受体的细胞表面受体，例如CD80、CD86和CD40，极大地增强了其活化T细胞的能力。其还上调了CCR7，所述CCR7是诱导树突细胞穿过血流到达脾，或穿过淋巴系统到达淋巴结的趋化性受体。在此其充当抗原呈递细胞，并通过与非抗原特异性共刺激信号一起呈递其抗原来活化辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。因此，树突细胞可主动诱导T细胞或B细胞相关的免疫应答。在一个实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。

术语“抗原呈递细胞”(antigen presenting cell，APC)是能够在其细胞表面上(或在其表面处)展示、获得和/或呈递至少一种抗原或抗原性片段的多种细胞中的细胞。抗原呈递细胞可以区分为专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。

术语“专职抗原呈递细胞”涉及组成性表达与初始T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合体II类(II类MHC)分子的抗原呈递细胞。如果T细胞与抗原呈递细胞膜上的II类MHC分子复合物相互作用，则抗原呈递细胞产生诱导T细胞活化的共刺激分子。专职抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。

术语“非专职抗原呈递细胞”是指不组成性表达II类MHC分子，但是在受到某些细胞因子例如干扰素-γ刺激之后组成性表达II类MHC分子的抗原呈递细胞。一些示例性的非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。

“抗原加工”是指抗原降解为加工产物，其是所述抗原的片段(例如，蛋白质降解为肽)，并且是指这些片段中的一个或更多个与MHC分子的缔合(例如，通过结合)用于由细胞例如抗原呈递细胞呈递到特定的T细胞。

术语“涉及抗原的疾病”或“涉及表位的疾病”是指与抗原或表位相关的任何疾病，例如以抗原或表位的存在为特征的疾病。涉及抗原或表位的疾病可以是感染性疾病、或癌症疾病或仅是癌症。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位可来源于这样的抗原。

术语“感染性疾病”是指可在个体之间或生物体之间传播并且由微生物原(microbial agent)引起的任何疾病(例如，普通感冒)。感染性疾病是本领域中已知的，并且包括例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生物性疾病，这些疾病分别由病毒、细菌和寄生物引起。在这方面中，感染性疾病可以是例如肝炎、性传播疾病(例如衣原体或淋病)、结核病、HIV/获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、禽流感和流感。

术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的一些实例包括但不限于：上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的一些实例包括骨癌、血癌肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin′s Disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervous system，CNS)赘生物、神经外胚层癌症、脊椎轴肿瘤(spinalaxis tumor)、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本公开内容的术语“癌症”还包括癌症转移。

由于产生的协同作用，在癌症治疗中的组合策略可以是理想的，其可比单一治疗方法的影响要强得多。在一个实施方案中，药物组合物与免疫治疗剂一起施用。本文中使用的“免疫治疗剂”涉及可参与激活特异性免疫应答和/或免疫效应功能的任何试剂。本公开内容考虑了抗体作为免疫治疗剂的用途。不希望受到理论的束缚，抗体能够通过多种机制实现针对癌细胞的治疗效果，包括诱导凋亡、阻断信号转导途径的组分或抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)诱导细胞死亡，或结合补体蛋白，导致直接的细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(complement dependentcytotoxicity，CDC)。可与本公开内容组合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标(在括号里)的一些非限制性实例包括：阿巴伏单抗(CA-125)、阿昔单抗(CD41)、阿达木单抗(EpCAM)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)(CD20)、培化阿珠单抗(Alacizumab pegol)(VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(CEA)、阿麦妥昔单抗(Amatuximab)(MORAb-009)、马安那莫单抗(TAG-72)、阿泊珠单抗(HLA-DR)、阿昔莫单抗(CEA)、阿特珠单抗(Atezolizumab)(PD-L1)、巴维昔单抗(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(CD22)、贝利木单抗(BAFF)、贝伐珠单抗(VEGF-A)、莫比伐单抗(Bivatuzumab mertansine)(CD44v6)、博纳吐单抗(Blinatumomab)(CD 19)、布妥昔单抗(CD30TNFRSF8)、莫坎妥珠单抗(黏蛋白CanAg)、雷坎妥珠单抗(MUC1)、卡罗单抗喷地肽(前列腺癌细胞)、卡鲁单抗(Carlumab)(CNT0888)、卡妥索单抗(EpCAM、CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)(EpCAM)、西妥木单抗(IGF-1受体)、克劳西单抗(Claudiximab)(密蛋白)、替坦司可利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)(MUC1)、西他土珠单抗(TRAIL-R2)、达西珠单抗(CD40)、达罗土珠单抗(Dalotuzumab)(胰岛素样生长因子I受体)、地诺单抗(RANKL)、地莫单抗(B-淋巴瘤细胞)、多兹图单抗(Drozitumab)(DR5)、依美昔单抗(GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(EpCAM)、埃罗妥珠单抗(SLAMF7)、依那妥珠单抗(PDL192)、恩司昔单抗(Ensituximab)(NPC-1C)、依帕珠单抗(CD22)、厄妥索单抗(HER2/neu、CD3)、伊瑞西珠单抗(整合素αvβ3)、法勒珠单抗(Farletuzumab)(叶酸受体1)、FBTA05(CD20)、芬克拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)(SCH 900105)、芬妥木单抗(Figitumumab)(IGF-1受体)、弗拉伏妥单抗(Flanvotumab)(糖蛋白75)、夫苏木单抗(Fresolimumab)(TGF-β)、加利昔单抗(Galiximab)(CD80)、盖尼塔单抗(IGF-I)、吉妥单抗奥唑米星(CD33)、吉伏珠单抗(Gevokizumab)(ILIβ)、吉瑞妥昔单抗(Girentuximab)(碳酸酐酶9(CA-IX))、格莱木单抗维多汀(Glembatumumab vedotin)(GPNMB)、替伊莫单抗(CD20)、依库单抗(Icrucumab)(VEGFR-1)、伊戈伏单抗(CA-125)、依坦希单抗(Indatuximab ravtansine)(SDC1)、英妥木单抗(Intetumumab)(CD51)、奥英妥珠单抗(CD22)、伊匹单抗(CD 152)、伊妥木单抗(Iratumumab)(CD30)、拉贝珠单抗(CEA)、来沙木单抗(TRAIL-R2)、利韦单抗(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(CD33)、洛妥珠单抗(Lorvotuzumab mertansine)(CD56)、鲁卡木单抗(CD40)、鲁昔单抗(CD23)、马帕木单抗(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(EGFR)、美泊利单抗(IL5)、米拉珠单抗(Milatuzumab)(CD74)、米妥莫单抗(GD3神经节苷脂)、莫加珠单抗(Mogamulizumab)(CCR4)、莫妥莫单抗(Moxetumomab pasudotox)(CD22)、他那可单抗(C242抗原)、他那莫单抗(5T4)、纳那妥单抗(Namatumab)(RON)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(EGFR)、尼妥珠单抗(EGFR)、纳武单抗(IgG4)、奥法木单抗(CD20)、奥拉单抗(Olaratumab)(PDGF-R a)、奥纳珠单抗(Onartuzumab)(人分散因子受体激酶)、莫奥珠单抗(Oportuzumabmonatox)(EpCAM)、奥戈伏单抗(CA-125)、欧西鲁单抗(Oxelumab)(OX-40)、帕尼单抗(EGFR)、帕曲妥单抗(Patritumab)(HER3)、培妥莫单抗(Pemtumomab)(MUC1)、帕妥珠单抗(HER2/neu)、平妥单抗(腺癌抗原)、普托木单抗(波形蛋白)、雷妥莫单抗(Racotumomab)(N-羟乙酰神经氨酸)、雷德图单抗(Radretumab)(纤连蛋白额外结构域-B)、雷韦单抗(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(VEGFR2)、利妥木单抗(Rilotumumab)(HGF)、利妥昔单抗(CD20)、罗妥木单抗(Robatumumab)(IGF-1受体)、沙玛立珠单抗(Samalizumab)(CD200)、西罗珠单抗(FAP)、司妥昔单抗(IL6)、他贝鲁单抗(Tabalumab)(BAFF)、他珠单抗(甲胎蛋白)、帕他普莫单抗(CD 19)、替妥莫单抗(Tenatumomab)(生腱蛋白C)、替妥木单抗(Teprotumumab)(CD221)、西木单抗(CTLA-4)、替加珠单抗(TRAIL-R2)、TNX-650(IL13)、托西莫单抗(CD20)、曲妥珠单抗(HER2/neu)、TRBS07(GD2)、替西木单抗(CTLA-4)、西莫白介素图考珠单抗(tucotuzumab celmoleukin)(EpCAM)、优利妥昔单抗(Ublituximab)(MS4A1)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)(4-1 BB)、伏洛昔单抗(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(肿瘤抗原CTAA 16.88)、扎妥木单抗(EGFR)和扎木单抗(CD4)。

本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。

呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用多种实施方案。特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述的实施例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多种实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实施例和应用。因此，多种实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实施例，而是与符合权利要求书的范围相一致。

实施例

实施例1：构建体设计和mRNA产生

细胞因子编码mRNA的体外转录基于pST1-T7-AGA-dEarI-hAg-MCS-FI-A30LA70质粒-骨架和衍生的DNA-构建体。这些质粒构建体包含5’UTR(非翻译区，智人(Homo sapiens)血红蛋白亚基α1(hAg)的5’-UTR的衍生物)、3’FI元件(其中F是分裂的氨基端增强子的136个核苷酸长3’-UTR片段，mRNA和I是线粒体编码的12S RNA的142个核苷酸长片段，二者均在智人中鉴定；WO 2017/060314)和100个核苷酸的poly(A)尾，在70个核苷酸之后有一个接头。细胞因子和血清白蛋白(hAlb)编码序列来源于智人，并且除以下所述的mutIL2变体中的预期突变之外，未在所得氨基酸序列中引入变化(hIL2：NP_000577.2；NCBI蛋白质资源；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)。在IL2变体的N端或C端添加hAlb，其中这两种定向在体外和体内均同样有效(数据未示出)。编码的蛋白质配备有N端信号肽(signalpeptide，SP)，即相应蛋白质的天然SP。在融合蛋白的情况下，仅N端部分的SP被维持，对于其他部分，仅成熟部分(不具有SP的蛋白质)被编码。仅对大多数C端部分引入终止密码子。细胞因子和hAlb融合构建体中的不同蛋白质部分被编码甘氨酸和丝氨酸残基的30个核苷酸长的接头序列隔开。引入hIL2序列中的突变以改变CD25结合(称为“mutCD25”突变，相应的构建体称为hIL2_Ax，其中x如下定义)以及与IL2Rβγ的结合(称为“mutβγ”突变，相应的构建体用另外的“s”标记，例如hIL2s或hIL2_A4s)。在hIL2_A1的情况下，在成熟结构域中引入四个氨基酸残基替换，将第38位的精氨酸改变为丙氨酸(R38A)，第42位的苯丙氨酸改变为丙氨酸(F42A)，第45位的酪氨酸改变为丙氨酸(Y45A)以及第62位的谷氨酸改变为丙氨酸(E62A)(Carmenate，T.et al.J.Immunol.190，6230-6238(2013).)。对于hIL2_A2，成熟结构域的氨基酸残基替换为K35A、K43A和E61A。对于hIL2_A3，引入替换K35E、K43E和E61K；对于hIL2_A4，引入K43E和E61K；对于hIL2_A5，引入E61K；并且对于hIL2_A6，引入E62K突变。为了产生hIL2 mutβγ变体，以L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的方式替换相应hIL2变体的成熟结构域的氨基酸残基(Levin，A.M.et al.Nature 484，529-533(2012))。如Kreiter et al.所述(Kreiter，S.et al.Cancer Immunol.Immunother.56，1577-87(2007))通过体外转录产生mRNA，其中用1-甲基-假尿苷替换正常核苷尿苷。所得mRNA配备有Cap1结构并且耗尽了双链(dsRNA)分子。纯化的mRNA在H₂O中洗脱，并在-80℃下储存直至进一步使用。所有描述的mRNA构建体的体外转录均在BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH进行。表1中示出了用于后续实验的所有构建体的列表。

表1：mRNA编码和表达的蛋白质的氨基酸序列。

实施例2：RNA编码的IL2变体的体外表达和IL2Rβγ结合

通过将mRNA脂质体转染到HEK293T/17细胞中，并随后通过IL2mutCD25变体分析IL2Rβγ表达报道细胞的CD25依赖性活化来分析所产生的mRNA的体外表达(图1)。脂质体转染前一天，将1.2×10⁶个HEK293T/17细胞接种在6孔板中的3mL DMEM(Life TechnologiesGmbH，目录号31966-021)+10％胎牛血清(FBS，Biochrom GmbH，目录号S0115)中。对于脂质体转染，在无菌且无RNA酶的条件下，使用400ng mRNA/μL Lipofectamine MessengerMax(Thermo Fisher Scientific，目录号LMRNA015)配制3μg mRNA，并且将其以每10cm²培养皿应用于约80％汇合的HEK293T/17细胞。表达20小时之后，在无菌条件下收集上清液并在-20℃下储存直至进一步使用。IL2 mutCD25变体的IL2Rβγ依赖性生物活性通过测量中等亲和力IL2受体(IL2Rβγ)表达TF-1_IL2Rβγ细胞的特异性增殖响应来评估。该细胞系由TF-1细胞系(ATCC CRL-2003)通过用编码类似于Farner，N.L.et al.Blood 86，4568-4578(1995)的人IL2Rβ链的序列(基因ID：3560)的逆转录病毒载体进行转导而产生，所述TF-1细胞系是自然表达IL2R共同γ链的人红白血病细胞系。简言之，将TF-1_IL2Rβγ细胞用D-PBS洗涤两次，并重悬于补充有10％胎牛血清(FBS；Biochrom GmbH，目录号S0115)和1mM丙酮酸钠(Life Technologies GmbH，目录号11360070)的RPMI 1640(Life Technologies GmbH，目录号61870010)中。将总共5,000个细胞/孔接种在白色96孔平底板(Fisher ScientificGmbH，目录号10072151)中，并与含IL2变体上清液的四倍系列稀释液一起孵育。培养三天之后，通过使用测定(Promega，目录号G9242)通过ATP量对活细胞进行定量来测量增殖。在TecanF200 PRO读取器(Tecan Deutschland GmbH)上记录发光，并在GraphPad Prism 6.04版本(GraphPad Software，Inc.)中绘制剂量-响应曲线。

实施例3：RNA编码的IL2 mutCD25变体与重组CD25(IL2Rα)的结合

mRNA编码的IL2 mutCD25变体与重组CD25的结合通过ELISA进行分析(图2)。在此，将1μg/mL重组人或小鼠CD25(C-Fc，Novoprotein目录号CJ78，CK32)在100μL DPBS中包被到高蛋白结合96孔板(Nunc MaxiSorp^TM，Thermo Fisher Scientific，目录号439454)中。将通过HEK-293-T-17的脂质体转染产生的含IL2变体上清液(如实施例2中所述)应用于经包被的CD25，并通过HRP缀合的抗人血清白蛋白抗体(Abcam，目录号ab8941)检测结合的蛋白质。根据DuoSet ELISA辅助试剂盒2(R&D Systems，目录号DY008)的方案应用常规ELISA试剂和程序。

如图2中所示，野生型hAlb-hIL2与人和小鼠CD25二者均强烈结合。就人CD25而言，对mutCD25变体A1、A3、A4和A6的结合完全丧失，而变体A2和A5显示出一些剩余的与人CD25的结合(图2A)。相比之下，所有mutCD25变体均失去了与小鼠CD25结合的能力(图2B)。

实施例4：RNA编码的IL2 mutCD25变体对CD25依赖性CTLL-2增殖的生物活性。

IL2 mutCD25变体的生物活性通过分析高度表达CD25的鼠CTLL-2细胞(小鼠C57BL/6 T细胞系，ATCC TIB-214)的细胞因子依赖性增殖来评估(图3)。简言之，收获CTLL-2细胞，用DPBS洗涤两次以除去任何剩余的IL2并重悬于补充有10％胎牛血清(FBS；Biochrom GmbH，目录号S0115)和1mM丙酮酸钠(Life Technologies GmbH，目录号11360070)的RPMI 1640(Life Technologies GmbH，目录号61870010)中。将总共5,000个细胞/孔接种在白色96孔平底板(Fisher Scientific GmbH，目录号10072151)中，并与四倍系列稀释的含IL2变体上清液一起孵育(如实施例2中所述)。培养三天之后，通过使用测定(Promega，目录号G9242)通过ATP量对活细胞进行定量来测量增殖。在Tecan F200PRO读取器(Tecan Deutschland GmbH)上记录发光，并在GraphPad Prism 6.04版本(GraphPad Software，Inc.)中绘制剂量-响应曲线。

野生型hALb-hIL2以剂量依赖性方式诱导CTLL-2细胞的增殖，其中半最大有效浓度(EC50)为0.2144％-上清液(图3)。mutCD25变体A2和A5与野生型hAlb-hIL2表现相当，这也由EC50值分别为0.1933％-上清液至0.2127％-上清液得到反映。相比之下，IL2变体A1显示出EC50值降低约1000倍，从而导致对CTLL-2细胞几乎没有任何生物活性。然而，变体A3、A4和A6诱导CTLL-2细胞的增殖，其中A3的EC50值为15.10％-上清液，A4的为11.43％-上清液并且A6的为7.785％-上清液，从而特征在于与野生型hAlb-hIL2相比降低约50倍的中等生物活性(图3)。

实施例5：RNA编码的IL2变体对人PBMC增殖的生物活性。

为了测量外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)增殖，将PBMC与次佳浓度的抗CD3抗体(克隆UCHT1)和来源于用编码IL2变体的mRNA对HEK293T/17进行的脂质体转染的上清液或对照上清液一起孵育。简言之，通过Ficoll-Paque(VWRinternational，目录号17-1440-03)密度梯度分离从健康供体的血沉棕黄层中获得PBMC。使用1.6μM羧基萤光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Thermo Fisher，目录号C34564)标记PBMC。在补充有5％血浆来源的人血清(PHS；One Lambda lnc.，目录号A25761)的lscove改良Dulbecco培养基(lscove′s Modified Dulbecco′s Medium，IMDM；Life Technologies GmbH，目录号12440-053)中在96孔圆底板(Costar，目录号734-1797)中，每孔接种75,000个CFSE标记的PBMC，并与针对每种供体预先确定的次佳浓度的抗CD3抗体(克隆UCHT1；R&D Systems，目录号MAB100；0.03至0.09μg/mL终浓度)一起孵育。并行地，在补充有5％PHS的IMDM中产生含IL2变体上清液的四倍系列稀释液(参见实施例2)。将接种的细胞与IL2变体上清液1∶1(是指接种细胞的培养基的体积)混合，并在37℃，5％CO₂下刺激四天。收获PBMC并通过流式细胞术分析。用全部均在FACS缓冲液(包含5％FBS和5mM EDTA的D-PBS)中1∶100稀释的以下试剂对细胞进行染色：抗人CD4-PE(TONBO Bioscience，目录50-0049)、抗人CD8-PE(TONBOBioscience，目录50-0088)、抗人CD56-APC(eBioscience，目录号17-0567-42)和7-AAD(Beckman Coulter，目录号A07704)。在BD FACSCanto^TM II流式细胞仪(Becton Dickinson)上进行流式细胞术分析，其中CFSE稀释作为增殖读出。使用FlowJo 10.4软件分析获得的增殖数据，并使用导出的扩增指数值在GraphPad Prism 6.04版本(GraphPad Software，Inc.)中绘制剂量-响应曲线。

除在高亲和力IL2Rαβγ依赖性CTLL-2增殖测定中与野生型IL2表现相同的变体hAlb-hIL2_A2和hAlb-hIL2_A5之外，所有其他突变体均在抗原非特异性增殖测定中用人本体PBMC进行分析。与所有其他IL2变体相比，野生型hAlb-hIL2通过强烈增强CD3诱导的CD4+T细胞(图4A)、CD8+T细胞(图4B)和CD56+NK细胞(图4C)的增殖而显示出优越的生物活性。具有降低的CD25结合能力的所有受试变体均显示出中间表型。变体hAlb-hIL2_A4与hAlb-hIL2_A6表现相当，与野生型hAlb-hIL2相比效力降低约50倍，而hAlb-hIL2_A1和hAlb-hIL2_A3显示出可叠加的剂量-响应曲线以及甚至更强烈地转向降低生物活性，即比hAlb-hIL2的生物活性低约75倍。在所有三个评价的淋巴细胞亚群之间，针对所述变体观察到的差异相当，但是NK细胞增殖通常不如T细胞增殖明显。

将具有中间表型的hAlb-hIL2_A4和hAlb-hIL2_A6进一步与另外包含mutβγ突变的变体进行比较，所述突变被描述为提高与IL2Rβγ复合物的结合(另见实施例1)。在CD4+和CD8+T细胞二者上，hAlb-hIL2均显示出优越的生物活性，所述生物活性不能通过添加mutβγ突变而增强，这也反映在计算的EC50值中(表2)。与hAlb-hIL2相比，mutCD25变体hAlb-hIL2_A4显示出在CD4+T细胞上生物活性降低约50倍，并且在CD8+T细胞上生物活性降低100倍。与hAlb-hIL2_A4相比，其他mutCD25变体hAlb-hIL2_A6的效力甚至在两种T细胞亚群上进一步降低2倍。然而，mutβγ突变的添加增强了两种mutCD25变体(即hAlb-hIL2_A4和hAlb-hIL2_A6)在CD4+和CD8+T细胞上的生物活性，结果导致与hAlb-hIL2和hAlb-hIL2s相比，hAlb-hIL2_A4s的生物活性仅降低4至7倍以及hAlb-hIL2_A6s的生物活性降低9至16倍(图4D和E，表2)。在CD56+NK细胞上，mutβγ变体hAlb-hIL2s表现出最高的生物活性，略超过野生型hAlb-hIL2的生物活性(EC50值分别为0.6084％和1.662％-上清液，参见表2)。与CD4+和CD8+T细胞相反，在CD56+NK细胞上，mutCD25变体hAlb-hIL2_A4和hAlb-hIL2_A6与hAlb-hIL2相比效力仅降低3至8倍。向hAlb-hIL2_A4和hAlb-hIL2_A6添加mutβγ突变将变体hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s的生物活性恢复至野生型hAlb-hIL2的水平(图4F)。

表2：来源于人PBMC增殖剂量-响应的整个PBMC淋巴细胞亚群中hAlb-hIL2变体的EC50值[％-上清液]。

实施例6：中等亲和力IL2受体(IL2Rβγ)与高亲和力IL2受体(IL2Rαβγ)表达IL2依赖性报道子细胞系中不同IL2变体的相对生物活性的比较。

为了剖析IL2Rα链(CD25)作为不同IL2变体生物活性的决定因素的作用，将高亲和力IL2受体(IL2Rαβγ)表达小鼠T细胞系CTLL-2的特异性增殖响应与中等亲和力IL2受体(IL2Rβγ)表达TF-1_IL2Rβγ细胞的特异性增殖响应进行比较，所述TF-1_IL2Rβγ细胞是天然表达IL2R共同γ链、被转导时也表达IL2Rβ链的人红白血病细胞系(参见实施例2)。简言之，将CTLL-2以及TF-1_IL2Rβγ细胞用D-PBS洗涤两次，并重悬于补充有10％胎牛血清(FBS；Biochrom GmbH，目录号S0115)和1mM丙酮酸钠(Life Technologies GmbH，目录号11360070)的RPMI 1640(Life Technologies GmbH，目录号61870010)中。将总共5,000个细胞/孔接种在白色96孔平底板(Fisher Scientific GmbH，目录号10072151)中，并与含IL2变体上清液的五种四倍系列稀释液一起孵育(如实施例2中所述)。培养三天之后，通过使用测定(Promega，目录号G9242)通过ATP量对活细胞进行定量来测量增殖。在PRO读取器(Tecan Deutschland GmbH)上记录发光，并在GraphPad Prism6.04版本(GraphPad Software，Inc.)中绘制剂量-响应曲线并计算EC50值。

hAlb-hIL2以及具有降低的CD25结合亲和力的hAlb-hIL2 mutCD25变体(即hAlb-hIL2_A4和_A6)与CD25非依赖性IL2Rβγ表达TF-1_IL2Rβγ细胞表现相当，具有几乎可叠加的剂量-响应曲线(图5A、B)。这也反映在计算的EC50值上，其范围为对于hAlb-hIL2为2.352％-上清液至对于hAlb-hIL2_A6为3.657％-上清液(表3)。此外，如预期的，对IL2Rβ具有增强的结合亲和力的mutβγ变体(即hAlb-hIL2s、hAlb-hIL2_A4s、hAlb-hIL2_A6s)显示出朝生物活性提高的方向转变了10至30倍，对于hAlb-hIL2s和hAlb-hIL2_A4s，EC50值相当(分别为0.080％和0.107％-上清液)，以及略低的hAlb-hIL2_A6s活性(EC50＝0.338％-上清液)。

与之形成鲜明对比的是，可在CD25依赖性IL2Rαβγ表达CTLL-2培养物中看到hAlb-hIL2和hAlb-hIL2变体之间的强烈差异(图5C、D)。在此，hAlb-hIL2表现出不能通过添加mutβγ突变来进一步增强的最高的生物活性(表4；hAlb-hIL2和hAlb-hIL2s的EC50为0.115％相对于0.240％-上清液)。与hAlb-hIL2相比，hAlb-hIL2_A4的活性降低了19倍(EC50＝2.19％上清液)，而对于hAlb-hIL2_A6，活性降低了约300倍(EC50＝33.72％上清液)。相应的mutβγ变体hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s显示出增强的生物活性，但仍比hAlb-hIL2活性低，EC50值分别为0.517和1.575。

表3：来源于人TF-1_IL2Rβγ增殖剂量-响应的中等亲和力IL2受体(IL2Rβγ)依赖性细胞培养物中hAlb-hIL2变体的EC50值[％-上清液]。计算获得与hAlb-hIL2相比EC50倍数降低和倍数提高数据的比率。

表4：来源于小鼠CTLL-2增殖剂量-响应的高亲和力IL2受体(IL2Rαβγ)依赖性细胞培养物中hAlb-hIL2变体的EC50值[％-上清液]。计算获得与hAlb-hIL2相比EC50倍数降低和倍数提高数据的比率。

实施例7：使用STAT5磷酸化作为读出比较hAlb-hIL2变体在人PBMC中不同T细胞亚群上的活性。

为了评估hAlb-hIL2变体在缺乏或表达CD25的不同T细胞亚群上的活性，用hAlb-hIL2变体刺激全部人PBMC，并在一系列细胞因子稀释度下测定STAT5磷酸化。简言之，通过Ficoll-Paque(VWR international，目录号17-1440-03)密度梯度分离从健康供体的血沉棕黄层中获得PBMC。将PBMC用D-PBS(Life Technologies GmbH，目录号14190250)洗涤两次，并通过在室温下300×g离心5分钟来收集。将PBMC重悬于补充有10％胎牛血清(FBS；Biochrom GmbH，目录号S0115)的lscove改良Dulbecco培养基(IMDM；Life TechnologiesGmbH，目录号12440-053)中，并在37℃和5％CO₂下静置1小时。接下来，将100，000个PBMC/96孔V底板(Greiner Bio-One GmbH，目录号651101)的孔接种在补充有10％FBS和2倍PhosSTOP^TM磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich，目录号04906845001)的IMDM中。并行地，在补充有10％FBS的IMDM中产生含hAlb-hIL2变体上清液的五种四倍系列稀释液(如实施例2中所述)。接种的细胞与hAlb-hIL2变体上清液1∶1(是指接种细胞的培养基的体积)混合，并在37℃和5％CO₂下刺激10分钟。接下来，添加1∶1,000可固定活力染料eFluor^TM 780，并将细胞在37℃和5％CO₂下刺激另外5分钟。通过添加甲醛(Carl Roth GmbH+Co.KG，目录号P087.4)至2％将细胞固定，并在冰上孵育10分钟。固定的PBMC用冰冷的D-PBS洗涤，并在冰上用100％冰冷的甲醇透化30分钟。将透化的PBMC用1倍透化缓冲液(eBioscience Inc.，目录号00-8333-56)洗涤两次，并随后在2至8℃下避光在1倍透化缓冲液中用1∶5Anti-Stat5(pY694)(Becton Dickinson GmbH，录号612598)、1∶25PerCP-Cy^TM5.5小鼠抗人CD25(Becton Dickinson GmbH，目录号560503)、1∶25 APC大鼠抗FOXP3(eBioscienceInc.，17-4776-41)、1∶25 BV421小鼠抗人CD4(Becton Dickinson GmbH，目录号565997)和1∶25 BV510小鼠抗人CD8(Becton Dickinson GmbH，目录号563256)染色30分钟。将经染色的PBMC用冰冷的1倍透化缓冲液洗涤两次，并最终重悬于补充有2％FBS和2 mM EDTA(Sigma-Aldrich，目录号03690-100ML)的D-PBS中。在BD FACSCanto^TM II流式细胞仪(BectonDickinson GmbH)上进行流式细胞术分析，并使用FlowJo软件10.3版本分析所获得的数据。在GraphPad Prism6.04版本(GraphPad Software，Inc.)中计算剂量-响应曲线和EC50值。

在CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞上，相对于所有具有降低的CD25结合亲和力的IL2 mutCD25变体(hAlb-hIL2_A4/_A6)及其各自的mutβγ变体(hAlb-hIL2_A4s，hAlb-hIL2_A6s)，hAlb-hIL2表现出优越的效力(图6和表5、6)。具体而言，与hAlb-hIL2相比，hAlb-hIL2_A6的生物活性强烈降低了约320倍，而hAlb-hIL2_A4表现出中间表型(与hAlb-hIL2相比活性降低约170倍)。两种mutCD25变体的生物活性可通过添加mutβγ突变来增强，其中hAlb-hIL2_A4s优于hAlb-hIL2_A6s，显示出与hAlb-hIL2相比活性分别降低了约6倍和约21倍。最具活性的变体是hAlb-hIL2s，其与hAlb-hIL2相比生物活性甚至增强了约15倍。在不存在CD25表达的情况下，hAlb-hIL2效力强烈降低＞40倍(参见图6、表5，与CD4+CD25+FoxP3+T_reg相比的CD4+CD25-T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞)，然而，它仍然优于mutCD25变体hAlb-hIL2_A4和hAlb-hIL2_A6。对于相应的包含mutβγ突变的变体也是如此：hAlb-hIL2s在CD25阴性CD4+和CD8+T细胞亚群二者中均表现出最高的生物活性(参见表7至8；与hAlb-hIL2相比效力提高了约5至10倍)，随后是hAlb-hIL2_A4s，其在CD4+CD25-T辅助细胞中与hAlb-hIL2表现相当，并且在CD8+细胞毒性T细胞中甚至优于hAlb-hIL2(参见表7至8；与hAlb-hIL2相比，生物活性提高约2倍)。当与hAlb-hIL2_A4s相比，hAlb-hIL2_A6s伴随着略微降低的生物活性，在CD8+细胞毒性T细胞中仍表现得几乎与hAlb-hIL2一样好，但在CD4+CD25-T辅助细胞中的活性较低。最重要的是，使用按照个体hAlb-hIL2变体在CD4+CD25-T辅助细胞或CD8+细胞毒性T细胞上确定的EC₅₀值与在CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞上确定的EC₅₀值的比率(表5)，允许计算出每个hAlb-hIL2变体的‘调节性T细胞偏倚’(表9)。与其在CD4+CD25-T辅助细胞或CD8+细胞毒性T细胞上的效力相比，hAlb-hIL2对调节性CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞表现出40至60倍的偏倚。与之形成鲜明对比的是，当着眼于mutCD25变体hAlb-hIL2_A4和hAlb-hIL2_A6时，这种调节性T细胞偏倚降低至仅1.2至1.9倍。相应的mutβγ变体hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s伴随着略微提高的调节性T细胞偏倚，为4.4至7.1倍。当与其在CD4+CD25-T辅助细胞或CD8+细胞毒性T细胞上的效力相比，hAlb-hIL2s对CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞显示出最强的偏倚，为63至182倍。

表5：基于针对不同人T细胞亚群中hAlb-hIL2变体的STAT5磷酸化剂量-响应计算出的EC50值[％-上清液]。

表6：基于针对人CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞中hAlb-hIL2变体的STAT5磷酸化剂量-响应计算出的EC50值[％-上清液]。计算获得与hAlb-hIL2相比EC50倍数降低和倍数提高数据的比率。

表7：基于针对人CD4+CD25-T辅助细胞中hAlb-hIL2变体的STAT5磷酸化剂量-响应计算出的EC50值[％-上清液]。计算获得与hAlb-hIL2相比EC50倍数降低和倍数提高数据的比率。

表8：基于针对人CD8+细胞毒性T细胞中hAlb-hIL2变体的STAT5磷酸化剂量-响应计算出的EC50值[％-上清液]。计算获得与hAlb-hIL2相比EC50倍数降低和倍数提高数据的比率。

表9：每种hAlb-hIL2变体的‘调节性T细胞偏倚’作为与CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞相比在CD4+CD25-T辅助细胞或CD8+细胞毒性T细胞上的倍数降低的效力给出。倍数降低的效力计算为每种hAlb-hIL2变体在CD4+CD25-T辅助细胞或CD8+细胞毒性T细胞上确定的个体EC50值与在CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞上确定的EC50值的比率。

实施例8：在体内IL2 mutCD25变体对T细胞疫苗接种的作用

随后，我们表征了在体内IL2 mutCD25变体hIL2_A4和hIL2_A6对RNA疫苗诱导的T细胞应答的作用。如Kranz，L.M.et al.Nature 534，396-401(2016)中所述，用20μg编码CD8+T细胞抗原gp70(SPSYAYHQF)的RNA-LPX对BALB/c小鼠(每组n＝5)进行i.v.疫苗接种。gp70是一种肿瘤抗原，其可见于例如结肠癌细胞系CT26中。gp70靶向疫苗的抗肿瘤效力随诱导的gp70特异性T细胞数目的增加而提高(Kranz，L.M.et al.Nature 534，396-401(2016)以及未发表过的)。在疫苗接种之后三天，如图7中所示i.v.施用配制成LNP的hAlb(阴性对照)或递增剂量的hAlb-hIL2、hAlb-hIL2_A4、hAlb-hIL2_A6 RNA。在第7天进行分析，包括通过流式细胞术(BD FACSCelesta)对血液淋巴细胞亚群和gp70特异性T细胞(MHC四聚体，MBL)进行免疫分型(如Kranz，L.M.et al.Nature 534，396-401(2016)中所述进行染色)。

如实施例4和实施例6中所述，mutCD25变体刺激IL2Rαβγ阳性CTLL-2细胞的效力降低。出于该原因，我们测试了比野生型hAlb-hIL2高约三倍剂量的mutCD25变体，以便能够诱导与hAlb-hIL2相当的对gp70特异性效应T细胞的作用，同时提高CD8与Treg比率。尽管剂量更高，但只有hAlb-hIL2而非hAlb-hIL2 mutCD25变体显示出作为IL2介导毒性的指标的肝重量的显著提高(图7B)。类似地，未观察到血清天冬氨酸-氨基转移酶(ASAT)(图7C)、丙氨酸-氨基转移酶、乳酸-脱氢酶、淀粉酶或脂肪酶活性(Indiko^TM，Thermo FischerScientific)以及肺重量的提高(数据未示出)。野生型hAlb-hIL2以及两种hAlb-hIL2mutCD25变体均导致血液中gp70特异性T细胞的剂量依赖性提高，如通过流式细胞术确定的，其中在最高剂量的hAlb-hIL2_A4的情况下观察到最强的增强并且在hAlb-hIL2_A6的情况下观察到最弱的增强(图7D)。令人感兴趣地，特别是hAlb-hIL2_A4导致CD8+T细胞以及CD45+白细胞非常强烈的提高(图7E、F)。与hAlb-hIL2和hAlb-hIL2_A4相比，hAlb-hIL2_A6的施用未导致Treg的提高(图7G)。重要的是，两种hAlb-hIL2变体均介导了CD8+T细胞与Treg比率的提高，这表明相对于肿瘤促进Treg优先扩增CD8+T细胞(图7H)。相比之下，hAlb-hIL2以剂量依赖性方式降低CD8+T细胞与Treg比率。当比较gp70特异性或非特异性CD8+T细胞相对于hAlb对照的倍数变化时，hAlb-hIL2和hAlb-hIL2_A4而非hAlb-hIL2_A6导致gp70特异性T细胞的优先扩增(图7I)。综上所述，这些结果表明，hAlb-hIL2_A6和hAlb-hIL2_A4变体不具有或具有降低的CD25结合能力，从而导致对癌症免疫治疗的有益作用，例如提高CD8+T细胞与Treg比率。

实施例9：通过添加mutβγ突变来提高IL2 mutCD25变体效力

尽管变体hAlb-hIL2_A4和hAlb-hIL2_A6强烈提高了CD8+T细胞与Treg比率，但由于与活化的T细胞上的高亲和力IL2Rαβγ的结合降低，与hAlb-hIL2相比，抗原特异性T细胞的强烈扩增需要高得多的剂量。因此，我们测试了hAlb-hIL2_A4和hAlb-hIL2_A6在体内的效力是否可通过引入mutβγ突变来进一步提高，所述突变被证明可在体外提高与所有IL2Rβγ阳性细胞的结合(实施例5至7；Levin，A.M.et al.Nature 484，529-533(2012))。对于实施例8，用20μg gp70 RNA-LPX对BALB/c小鼠(每组n＝5)进行i.v.疫苗接种，随后在三天之后进行细胞因子RNA-LNP注射(图7A)。在该实验中，我们大幅度降低了细胞因子RNA-LNP剂量，以确保可良好覆盖mutβγ突变引起的提高，并测试处理剂量的下限。在疫苗接种之后7天，对gp70特异性T细胞、NK细胞以及CD25 FoxP3阳性Treg进行分析(图8)。

如实施例8中所示，通过施用hAlb-hIL2_A4而非hAlb-hIL2_A6提高了抗原特异性T细胞和Treg频率(图8A、B)。引人注目的是，包含变体hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s的两种mutβγ突变均进一步提高了抗原特异性T细胞频率，而没有任何可检测的Treg频率(或细胞计数，数据未示出)的提高。hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s导致抗原特异性T细胞相对于非特异性CD8 T细胞的优先提高，这超过了hAlb-hIL2_A4和hAlb-hIL2_A6(图8C)。此外，所有构建体均强烈扩增NK细胞频率(和计数，数据未示出)多至外周淋巴细胞的几乎50％(图8D)。在此，hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s在高剂量下显示出与hAlb-hIL2_A4类似的效力，但在低剂量下显示出优势。总之，这表明mutβγ突变可进一步提高hAlb-hIL2mutCD25变体的效力，而不提高Treg频率。

实施例10：包含mutCD25和mutβγ突变二者的hAlb-hIL2变体比包含IL2和野生型hAlb-hIL2的mutβγ突变更优越

在实施例9中，我们示出将mutβγ突变引入mutCD25变体提高了它们刺激抗原特异性T细胞的效力而不提高Treg频率。接下来，我们要测试包含mutCD25和mutβγ突变二者的IL2变体是否优于包含IL2变体的mutβγ(hAlb-hIL2s)。在第0天和第7天用20μg gp70 RNA-LPX以及在第3天和第10天用细胞因子RNA-LNP(图中所示的剂量)对BALB/c小鼠(每组n＝5)进行i.v.疫苗接种。在第7天和第14天通过流式细胞术(参见实施例8)进行血液淋巴细胞分析(图9A)。与hAlb对照相比，所有IL2变体的抗原特异性T细胞数目均提高(图9B)。重要的是，尽管hAlb-hIL2和较低程度的hAlb-hIL2s扩增了Treg，但在经hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s处理组中未提高Treg计数(图9C)。hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s缺乏Treg扩增，可解释第二次处理之后超过hAlb-hIL2和hAlb-hIL2s变体之作用的抗原特异性T细胞的强烈增强(图9B)。相比之下，对于hAlb-hIL2和hAlb-hIL2s，抗原特异性T细胞的扩增在第二次处理之后减慢，可能是由于诱导的Treg对效应T细胞的抑制(图9B、C)。类似地，CD8+T细胞数目通过包含hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s变体的mutCD25和mutβγ突变最强烈地提高(图9D)。因此，与hAlb-hIL2和hAlb-hIL2s相比，通过施用hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s变体，抗原特异性T细胞与Treg比率(图9E)和CD8+T细胞与Treg比率二者均显著提高。与非特异性CD8+(四聚体-/CD8+)T细胞相比，所有hAlb-hIL2变体并且特别是hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s优先扩增抗原特异性T细胞(四聚体+/CD8+)(图9G)。令人感兴趣地，hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s比hAlb-hIL2和hAlb-hIL2s诱导更低的KLRG1+CD127-短寿命效应T细胞(SLEC)的频率(图9H)。由于记忆形成的可能性降低，高SLEC频率负面影响T细胞应答的寿命(Joshi，N.S.et al.Immunity 27，281-295(2007))。另外，hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s变体扩增NK细胞比hAlb-hIL2强得多，并且略强于hAlb-hIL2s(图9I)。与hAlb-hIL2相比，所有包含变体的mutβγ突变均导致KLRG1表达NK细胞的分数显著更高，表明效应子表型已活化(图9J)。KLRG1阳性NK细胞已显示出保护免受肺转移性疾病(Renner，P.etal.Oncoimmunology 3，e28328(2014))。由于活化的NK细胞的短寿命性质，NK细胞计数在第一次处理之后在所有包含变体的mutβγ突变中均下降，但仍保持高于hAlb对照组(图9I)。

总之，mutCD25和mutβγ突变的组合显著增强了hAlb-hIL2提高抗原特异性T细胞和NK细胞的效力而不扩增Treg，从而导致(抗原特异性)CD8+T细胞与Treg的比率强烈提高。

实施例11：hAlb-hIL2_A4s施用增强了CD4+T细胞应答

在先前的实验中，我们已证明施用包含mutCD25和mutβγ突变二者的IL2变体增强了抗原特异性CD8+T细胞的诱导。为了进一步测试CD4+T细胞是否将受益于这些IL2变体，在第0、7和14天用20μg B16_M30(Kreiter，S.et al.Nature 520，692-696(2015))RNA-LPX和3μg hAlb、hAlb-hIL2或hAlb-hIL2_A4s RNA-LNP对C57BL/6小鼠(每组n＝7)进行i.v.处理。在第19天通过流式细胞术(参见实施例8)进行血液淋巴细胞分析(图10A)。B16_M30是由CD4+T细胞识别的B16F10肿瘤细胞系的II类MHC限制性新表位(Kreiter，S.et al.Nature 520，692-696(2015))。

如图10B和10C中所示，仅共施用hAlb-hIL2_A4而非hAlb-hIL2分别提高了CD4+效应T细胞/非Treg(CD25-FoxP3-CD4+)和B16_M30特异性四聚体+CD4+T细胞的数目。

实施例12：具有组合的mutCD25和mutβγ突变的IL2变体增强了癌症疫苗接种的抗肿瘤效力

由疫苗接种诱导的肿瘤抗原特异性T细胞可控制肿瘤生长，而Treg抑制效应T细胞的作用(Kreiter，S.et al.Nature 520，692-696(2015).)。我们先前已表明，hAlb-hIL2能够显著提高gp70 RNA疫苗接种在CT26荷瘤小鼠中的抗肿瘤效力。因此，预期不提高Treg的hAlb-hIL2的改善变体，例如hAlb-hIL2_A4s和hAlb-hIL2_A6s是治疗上甚至更有效的。