具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，固定化酶往往面临酶活力降低、分离不彻底等缺陷。本发明目的在于提供一种方便快速回收的、具有更加稳定酶活的脱膜剂。

本发明第一方面，提供一种用于废纸脱墨的复合生物酶制剂，所述复合生物酶制剂包括复合酶及载体，所述载体为壳聚糖修饰的磁性纳米粒子，所述复合酶选自脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、漆酶中一种或几种的组合。

第一方面所述的技术方案中，所述磁性纳米粒子为铁元素的金属氧化物，进一步的，为ZnFe₂O₄纳米粒子、磁性Fe₃O₄纳米粒子、NiFe₂O₄磁性纳米粒子、纳米Fe₂O₃纳米粒子、纳米Fe₃S₄纳米粒子中的一种。

本发明提供的一种实施方式中，所述磁性纳米粒子为磁性Fe₃O₄，具体的实施方式中，所述磁性Fe₃O₄纳米粒子并不局限于某种特定的制备方法，本领域公知的共沉淀法、水热合成等方法制备而成的磁性Fe₃O₄纳米粒子均能够满足所述复合酶制剂催化脱墨的效果。本发明中所述复合生物酶制剂采用磁性Fe₃O₄纳米粒子与壳聚糖结合，使得所述复合酶制剂能够通过外加磁场从而进行方便的回收。

在进一步优选的实施方式中，所述磁性Fe₃O₄纳米粒子表面采用油酸处理：将磁性Fe₃O₄纳米粒子置于油酸/无水乙醇溶液中进行处理，处理完成后通过水、无水乙醇交替清洗。

第一方面优选的方案中，所述复合酶中至少含有纤维素酶，为纤维素酶与其他酶的组合形式，所述组合形式的实例包括纤维素酶与漆酶的组合、脂肪酶与纤维素酶的组合或纤维素酶与果胶酶的组合。

进一步的，所述纤维素酶选自葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶或纤维二糖酶、β-葡萄糖苷酶。

进一步的，所述半纤维素酶选自木聚糖酶、β-葡聚糖酶、半乳聚糖酶或木聚糖酶。

进一步的，所述果胶酶选自原果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶或裂解酶。

本发明第二方面，提供第一方面所述用于废纸脱墨的复合生物酶制剂的制备方法，所述制备方法的特征在于，采用聚乙烯亚胺对壳聚糖进行表面改性，向改性后的壳聚糖体系中加入磁性纳米粒子结合得到壳聚糖改性的磁性纳米粒子。

优选的，所述制备方法具体步骤如下：向壳聚糖的酸性溶液中加入聚乙烯亚胺，在隔绝氧气的条件下加热对壳聚糖表面进行改性；反应结束后加入磁性Fe₃O₄后孵育一段时间得到所述壳聚糖改性的磁性纳米粒子；将所述磁性纳米粒子加入复合酶的缓冲溶液中孵育得到所述复合生物酶制剂。

进一步的，所述壳聚糖的酸性溶液配置方式如下：采用10％的乙酸溶液溶解壳聚糖，壳聚糖与乙酸溶液的比例为3～10g：150～400mL。

上述壳聚糖的酸性溶液在配置时，可在不断搅拌的条件下，少量多次将壳聚糖固体粉末加入乙酸溶液中进行溶解；也可以将壳聚糖直接洒在乙酸溶液的表面后静置，使其充分的溶胀。

效果较好的实施方式中，所述壳聚糖的酸性溶液配置方式如下：将5g壳聚糖加入200mL 10％的乙酸溶液中静置0.8h使其充分溶胀。

进一步的，所述聚乙烯亚胺的浓度为8％～12％。

进一步的，所述壳聚糖表面改性方式如下：将壳聚糖加入乙酸溶液中溶解，加入聚乙烯亚胺溶液后将混合溶液置于惰性气体氛围中加热；所述加热温度为70～80℃，所述加热时间为1～2h。

进一步的，所述磁性Fe₃O₄纳米粒子加入改性的壳聚糖溶液中充分混合，所述混合方式包括震荡、搅拌、超声中的一种或其组合；本发明效果较好的实施方式中，超声一段时间后低速搅拌获得壳聚糖改性的磁性纳米粒子。

进一步的，将磁性纳米粒子加入复合生物酶的缓冲溶液中，在室温条件下震荡孵育2～3h得到所述复合生物酶制剂。

本发明第三方面，提供一种组合物，所述组合物至少包括第一方面所述用于废纸脱墨的复合生物酶制剂，还包括表面活性剂。

优选的，所述表面活性剂为阴离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂；进一步的，所述表面活性剂型为钾皂、磺化油、直链烷基苯磺酸钠、脂肪醇硫酸钠、磺基琥珀酸二锌醋钠盐、脂肪醇聚氧乙烯硫酸醋钠、烷基酚(辛基酚、壬基酚)、脂肪醇、环氧丙烷聚合物中的一种或几种的组合。

本发明第四方面，提供一种废纸脱墨的方法，所述方法包括应用第一方面所述复合生物酶制剂或第三方面所述组合物处理待脱墨的纸浆。

优选的，所述废纸脱墨方法包括如下步骤：将待脱墨的废纸破碎后加入表面活性剂溶液进行预处理，之后打浆得到废纸浆料；向废纸浆料中加入第一方面所述复合生物酶制剂进行脱墨。

进一步的，所述表面活性剂与废纸的重量比为0.1～0.5：100。

进一步的，所述废纸浆料的浓度为30～50g/L。

进一步的，所述复合酶制剂的添加量为所述废纸浆绝干浆质量的0.2％～1.5％。

进一步的，所述复合酶制剂的处理温度为30～75℃，处理时间25～120min，pH为6.0～9.0，搅拌转速为100～150rpm。

进一步的，所述脱墨工艺中还包括对脱墨浆料进行漂白的工艺，漂白可采用本领域常规方法，如过氧化氢漂白等方式进行。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

本实施例中，提供一种用于废纸脱墨的复合生物酶，所述复合生物酶包括载体及复合酶，所述载体为壳聚糖改性的磁性Fe₃O₄纳米粒子，所述复合酶为漆酶与脂肪酶，所述复合生物酶的制备方法如下：

1)共沉淀法制备磁性Fe₃O₄纳米粒子：

将2.1g FeCl₃·4H₂O和5.5g FeCl₃·6H₂O溶于100mL去离子水中，在N₂氛围下水浴加热至80℃，向混合溶液中缓慢滴加浓氨水至溶液呈弱碱性，在500rpm的转速条件下剧烈搅拌1h，反应结束后，通过外加磁铁分离，并用去离子水洗涤至溶液pH为中性，最后真空干燥得到磁性Fe₃O₄纳米粒子。

2)壳聚糖改性磁性纳米粒子：

将6g壳聚糖加入250mL10％的乙酸溶液中1h使其充分溶胀，加入20mL的15％的聚乙烯亚胺溶液，将所述反应体系置于N₂氛围中升温至80℃反应2h对壳聚糖表面进行改性，反应结束后待反应体系温度降至室温，将步骤1)中制备得到的磁性Fe₃O₄加入上述改性溶液并将该反应体系置于超声波环境中处理10min；超声波处理后的混合溶液在转速90r/min条件进行搅拌3h，搅拌过程中滴加质量分数为3％NaOH溶液，将混合溶液pH调至7.3，反应结束后通过磁性分离产物，用水和无水乙醇交替清洗产物，得到壳聚糖改性的磁性纳米粒子。

3)将漆酶、脂肪酶以质量比1：1溶于pH7.5浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液中配制成0.1mg/mL的酶缓冲液，称取10mg步骤2)中制备得到的壳聚糖改性磁性纳米粒子加入上述磷酸盐缓冲液中，混合体系置于150rpm振荡室温温育3h后进行磁分离，得到复合生物酶制剂。

实施例2

本实施例中，提供一种用于废纸脱墨的复合生物酶，所述复合生物酶包括载体及复合酶，所述载体为壳聚糖改性的磁性Fe₃O₄纳米粒子，所述复合酶为果胶酶与脂肪酶，所述复合生物酶的制备方法如下：

1)微波水热法制备磁性Fe₃O₄纳米粒子：

以FeSO₄·H₂O、Fe(NO₃)₃·H₂O作为原料制备磁性Fe₃O₄纳米粒子，并采用油酸的乙醇对产物进行表面改性，之后采用蒸馏水和无水乙醇对产物进行洗涤、离心及干燥得到所述磁性Fe₃O₄纳米粒子。

2)壳聚糖改性磁性纳米粒子：

将5g壳聚糖加入200mL 10％的乙酸溶液中0.8h使其充分溶胀，加入15mL的10％的聚乙烯亚胺溶液，将所述反应体系置于N₂氛围中升温至75℃反应1.5h对壳聚糖表面进行改性，反应结束后待反应体系温度降至室温将步骤1)中制备得到的磁性Fe₃O₄加入上述改性溶液并将该反应体系置于超声波环境中处理15min；超声波处理后的混合溶液在转速50r/min条件进行搅拌4h，滴加质量分数为2％NaOH溶液，将混合溶液pH调至7.0，反应结束后通过磁性分离产物，用水和无水乙醇交替清洗产物，得到壳聚糖改性的磁性纳米粒子。

3)将纤维素酶、脂肪酶以质量比0.5：1溶于pH7.0浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液中配制成0.05mg/mL的酶缓冲液，称取8mg步骤2)中制备得到的壳聚糖改性磁性纳米粒子加入上述磷酸盐缓冲液中，混合体系置于100rpm振荡室温温育2.5h后进行磁分离，得到复合生物酶制剂。

实施例3

本实施例中，提供一种用于废纸脱墨的复合生物酶，所述复合生物酶包括载体及复合酶，所述载体为壳聚糖改性的磁性Fe₃O₄纳米粒子，所述复合酶为纤维素酶与脂肪酶，所述复合生物酶的制备方法如下：

1)氨水共沉淀法制备磁性Fe₃O₄纳米粒子：

配置0.5mol/LFeCl₃和FeSO₄溶液，按照Fe³⁺:Fe²⁺＝1.75：1的比例混合原料并加入分析纯氨水，继续搅拌并缓慢滴加氨水至pH＝8.5，得到所述黑色溶胶状物质通过磁场分离、洗涤后加入油酸/无水乙醇溶液中进行处理。之后采用蒸馏水和无水乙醇对产物进行洗涤、离心及干燥得到所述磁性Fe₃O₄纳米粒子。

2)壳聚糖改性磁性纳米粒子：

将8g壳聚糖加入300mL 10％的乙酸溶液中1.5h使其充分溶胀，加入25mL的20％的聚乙烯亚胺溶液，将所述反应体系置于N₂氛围中升温至85℃反应2.5h对壳聚糖表面进行改性，反应结束后待反应体系温度降至室温将步骤1)中制备得到的磁性Fe₃O₄加入上述改性溶液，之后将混合溶液在转速80r/min条件进行搅拌8h，滴加质量分数为3％NaOH溶液，将混合溶液pH调至7.3，反应结束后通过磁性分离产物，用水和无水乙醇交替清洗产物，得到壳聚糖改性的磁性纳米粒子。

3)将纤维素酶、果胶酶以质量比0.5：1溶于pH7.0浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液中配制成0.2mg/mL的酶缓冲液，称取15mg步骤2)中制备得到的壳聚糖改性磁性纳米粒子加入上述磷酸盐缓冲液中，混合体系置于100rpm振荡室温温育3.5h后进行磁分离，得到复合生物酶制剂。

实施例4

本实施例中，还提供一种废纸脱墨方法，将待处理的办公废纸碎成纸片后加水浸泡，然后进行脱水至含水量约30％，向脱水后的办公废纸中加入脂肪醇硫酸钠的水溶液，其中脂肪醇硫酸钠与废纸的重量比为0.5：100，浸泡2h。

浸泡完成后，将上述废纸及溶液分批加入打浆机中打成纸浆，加入绝干质量1％的实施例1-3任一项制备的中复合生物酶制剂混合均匀，继续加水至浆料浓度降低至8g/L，奥驰反应体系的温度为37℃，处理1.5h，处理搅拌转速为100rpm。

对比例1

本发明研究过程中，为了增强壳聚糖与金属粒子的配位能力，还针对其他提供配位氨基基团的制备方法进行了研究。包括采用乙二胺接枝壳聚糖的制备方法，与实施例1不同之处在于：将8g壳聚糖加入300mL 10％的乙酸溶液中1.5h使其充分溶胀，加入25mL的20％的乙二胺的甲醇溶液在67℃水浴反应。

其他的实施例中，还包括采用三乙烯四胺进行上述壳聚糖的改性。

对比例2

本实施例中，提供一种包覆不同生物酶的复合生物酶制剂，与实施例1不同之处在于，本实施例中的步骤3)中，所述复合酶为漆酶、纤维素酶；所述漆酶与纤维素酶以质量比0.5：1混合溶于缓冲液中，并与壳聚糖改性的纳米粒子进行混合孵育。

对比例3

本实施例中，提供一种包覆不同生物酶的复合生物酶制剂，与实施例1不同之处在于，本实施例中的步骤3)中，所述复合酶为果胶酶、纤维素酶；所述果胶酶与纤维素酶以质量比0.5：1混合溶于缓冲液中，并与壳聚糖改性的纳米粒子进行混合孵育。

对比例4

本实施例中，提供有一种废纸脱墨方法，与实施例4不同之处在于，采用阳离子型表面活性剂对破碎后的废纸进行预处理。

本发明针对上述实施例1-3及对比例1-3中制备得到的复合酶制剂进行了酶活力测定，所述酶活测试采用沃辛顿(Worthington)法评定

酶活性计算公式如下：

其中：

E₅₁₀：酶催化反应过程中在510nm处每分钟吸光度的增大值；

V：反应溶液的总体积，3.0mL；

ΔA：产物的特定吸收系数，6.58cm²(μmol·dye)^-1；

v：加入酶溶液的体积，数值为0.1mL。

实施例及对比例中所述酶活力测试结果，及脱墨处理后的酶活力结果如下表1所示：

表1

从上述表1的数据中可以看出，实施例1-3中制备得到的复合生物酶在多次使用之后仍然具有较高的酶活力，而对比例1-3中所述复合酶制剂酶活力相比更低，这可能说明了纤维素酶对本发明提供的载体具有更好的亲和效果，能够实现更高的稳定性。

本发明中，还针对实施例及对比例中所述复合生物酶制剂处理后纸浆的性能进行了测试，将上述实施例中脱墨后的纸浆抄片制成浆片，风干干燥并定量60g/m²的纸片。其中，纸片白度测试方法参考GB/T 7974-2002规定，不透明度根据QB/T1548检测，纸片撕裂强度测试参考GB/T 455-2002中的规定，测定结果如下表2所示：

表2

从上述数据中可以看出，采用实施例1-3中所述复合生物酶制剂处理后的废纸浆具有更好的白度，证明其脱墨效果更好。特别的，对比例4中采用阳离子型表面活性剂处理后，纸浆白度相比其他组具有明显的不足，这可能说明阳离子型表面活性剂会降低所述复合生物酶制剂的催化效率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。