脐带间充质干细胞提取物、应用及检测方法
阅读说明：本技术 脐带间充质干细胞提取物、应用及检测方法 (Umbilical cord mesenchymal stem cell extract, application and detection method ) 是由 王锐 周豫生 许依林 于 2021-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种脐带间充质干细胞提取物、应用及检测方法,化妆品技术领域,其中脐带间充质干细胞提取物,其由下述步骤提取得到,(1)从脐带组织块或脐血中分离得到脐带间充质干细胞；(2)将步骤(1)得到的脐带间充质干细胞定向分化为皮肤干细胞；(3)将步骤(2)得到的皮肤干细胞收集和裂解,并通过分子筛将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物；本发明的这类小分子物质在常温可以保存比较长的时间,并且对皮肤屏障的修复能力明显增强。(The invention provides an umbilical cord mesenchymal stem cell extract, an application and a detection method, belonging to the technical field of cosmetics, wherein the umbilical cord mesenchymal stem cell extract is obtained by the following steps of (1) separating umbilical cord mesenchymal stem cells from umbilical cord tissue blocks or umbilical cord blood; (2) directionally differentiating the umbilical cord mesenchymal stem cells obtained in the step (1) into skin stem cells; (3) collecting and cracking the skin stem cells obtained in the step (2), and enriching active small molecular substances through a molecular sieve to obtain an umbilical cord mesenchymal stem cell extract; the small molecular substance can be stored for a long time at normal temperature, and the repair capability to the skin barrier is obviously enhanced.)
技术领域
本发明涉及化妆品
技术领域
，尤其涉及一种脐带间充质干细胞提取物、应用及检测方法。背景技术
随着生活水平的提高与科技的进步，以往的美白、保湿等基本功能已不能满足人们对化妆品的需求，抗衰老逐渐成为大家关心的方面。在皮肤老化的过程中，活性氧是皮肤老化的重要诱因，且内源性老化和外源性老化是同时作用的。内源性老化主要是随着年龄的增长，氧化及糖化的蛋白质逐渐累积，使得真皮中胶原蛋白和弹性蛋白损失，皮肤变薄，角质形成细胞变性。外源性老化则是因为紫外线损伤、环境损害、发炎等，导致表皮组织的恶化和损伤。
间充质干细胞是来源于早期中胚层的成体干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是造血微环境中的一种重要的细胞成分，可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质细胞增殖分化，而且免疫原性弱，是组织工程立项的种子细胞来源。人脐带间充质干细胞相比于其他来源的间充质干细胞，还具有提取方便，含量丰富，细胞纯净，免疫原性更低，细胞原始、分化能力更强，无伦理限制等优势，可为实验和临床提供充足的细胞来源，具有广阔的临床应用前景。研究发现人脐带间充质干细胞的培养上清中含有多种细胞因子，如血管内皮生长因子，肝细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，表皮生长因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，转化生长因子β，神经生长因子等。而这些因子对于皮肤伤口的愈合及细胞外基质的重建，胶原和弹性蛋白的稳定生产及分布具有重要作用。
目前市场上传统的精华液主要是利用外源性物质，如通过植物成分提取或精细化工制作工艺加工而成的，虽然对肌肤能产生短暂的改善效果，但并未从根本上改变皮肤的衰老和修复问题。申请号为CN201910177644.0，发明名称为一种用于常规抗衰老治疗的人源脐带间充质干细胞制剂的制备方法公开了包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤和人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤；所述人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤包括采用5%葡萄糖注射液重悬传代培养至Pe代人源脐带间充质干细胞，本发明完善人源脐带间充质干细胞的储备，保障了人源脐带间充质干细胞的存活率、增殖能力和特异性。但是，现有技术使用的间充质干细胞本身以及其分泌的旁分泌因子或者外泌体，这对皮肤屏障修复能力差，并且不能常温保存，所以在应用至皮肤修复上效果会大打折扣。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种脐带间充质干细胞提取物，以解决现行技术中脐带间充质干细胞提取物在常温保存活性成分易失活的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明提供一种脐带间充质干细胞提取物，其由下述步骤提取得到：(1)从脐带组织块或脐血中分离得到脐带间充质干细胞；(2)将步骤（1）得到的脐带间充质干细胞定向分化为皮肤干细胞；(3)将步骤（2）得到的皮肤干细胞收集和裂解，并通过分子筛将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
优选的，其由下述步骤提取得到：其由下述步骤提取得到：(1)从脐带组织块中分离得到脐带间充质干细胞；(2)将步骤（1）得到的脐带间充质干细胞定向分化为皮肤干细胞；(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养18～36h后，再置于氧气5%、二氧化碳5%、氮气90%的低氧环境下培养18～36h后，收集并裂解得到的皮肤干细胞，并通过孔径为0.3～2.0nm分子筛得到活性小分子物质，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
优选的，步骤（1）中，所述脐带间充质干细胞是从脐带组织块或脐血中经过原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤和人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤得到的。
优选的，步骤（1）中，所述脐带间充质干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1～2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2～3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。
优选的，在步骤（2）中，所述培养液的组成为：胎牛血清100g/L、胰岛素20mg/L、L-谷氨酰胺5mg/L、表皮生长因子8μg/L、成纤维细胞生长因子2μg/L、神经生长因子0.88μg/L、糖皮质激素175μg/L、黄芩甙元0.1mg/L和飞燕草素35μg/L。
优选的，在步骤（2）中，将步骤（1）得到的胎盘间充质干细胞接种在皮肤干细胞培养基中，于37℃、5％CO2、培养箱中孵育15～25h，弃去培养基，重新加入新鲜的皮肤干细胞培养基中，待皮肤干细胞接近80～90％融合时，进行传代扩增培养。
优选的，在步骤（2）还包括将定向分化得到的皮肤干细胞采用0.1%胰酶消化，用生理盐至少清洗一次。
优选的，在步骤（3）中，所述皮肤干细胞采用冰浴超声破碎对皮肤干细胞进行裂解，冰浴超声破碎条件为间歇超声，超声破碎的功率300～350W，每工作10s，间歇3s，循环至少20次。
一种脐带间充质干细胞提取物的应用，所述的脐带间充质干细胞提取物用于制备美容产品。
一种脐带间充质干细胞提取物的检测方法，采用反相液质联用方法。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明先把间充质干细胞定向分化为皮肤干细胞，再把皮肤干细胞收集起来，用超声破碎的办法收集其中活性物质，再过分子筛富集小分子物质。这类小分子物质在常温可以保存超过24个月，并且对皮肤屏障的修复能力明显增强。而与现有技术中直接使用间充质干细胞本身以及其分泌的旁分泌因子或者外泌体，对皮肤屏障修复能力差，常温下其中的活性物质容易失活，并且不能常温保存。我们通过把间充质干细胞定向分化为皮肤干细胞，再富集其小分子活性物质，使其在常温也能保存比较长的时间，并且增强对皮肤屏障的修复能力。
2.本发明优选的在通过将脐带间充质干细胞分化为皮肤干细胞，将步骤（3）得到皮肤干细胞正常培养18～36h后，再置于低氧环境下培养18～36h后，先通过正常处理，使细胞大面积的繁殖，再通过置于低氧环境下进行培养，检测可知，脐带间充质干细胞提取物活性大大提升。
3.制备的皮肤干细胞活性素应用于霜剂化妆品中能显著改善皮肤老化、降低不良反应的发生，增加角质层含水量和油脂含量。
附图说明
图1实施例1、3-4中的细胞提取物对成纤维细胞胶原蛋白生成量的图；
图2实施例1、5-10中的细胞提取物对成纤维细胞胶原蛋白生成量的图；
图3实施例9、11-14中的细胞提取物对成纤维细胞胶原蛋白生成量的图；
图4实施例9、11-14中的细胞提取物在贮存6个月后对成纤维细胞胶原蛋白生成量的图；
图5为200ngHeLa液质分析基峰色谱图；
图6为母离子误差分布图；
图7为细胞样品液质分析基峰色谱图；
图8为细胞样品母离子误差分布图；
图9细胞样品肽段漏切率分布；
图10细胞培养基样品液质分析BasePeak图；
图11细胞样品肽段漏切率分布；
图12为使用本发明的脐带间充质干细胞提取物对于患有红肿过敏患者的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的工业原料（试剂、原料视情况选择）如无特别说明，均为市售常规工业原料；所涉及的加工制作方法（检测、测试、制备方法等视情况而选择），如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：一种脐带间充质干细胞提取物，其由下述步骤提取得到：
(1)从脐带组织块中分离得到脐带间充质干细胞，采集符合采集标准的脐带标本，于48h内进行细胞分离。将脐带保存液弃尽，用PBS冲洗3次，并将脐带移至Ф10cm培养皿内，截取透亮度好、无破损、无水肿区域的脐带小段，每段截成4*4cm。用组织剪将脐带纵向剖开，剔除脐静脉和脐动脉，用PBS冲洗4次。使用脐带组织专用剪将脐带剩余组织即华通氏胶剪成1mm3的组织块，接种至新的Ф10cm培养皿内，24h后补一半无血清完全培养基，后每2d进行弃3ml补4ml的半量换液操作；
(2)将步骤（1）得到的脐带间充质干细胞定向分化为皮肤干细胞；在步骤（2）中，所述培养液的组成为：胰岛素20mg/L、L-谷氨酰胺5mg/L、表皮生长因子8μg/L、成纤维细胞生长因子2μg/L、神经生长因子0.88μg/L、糖皮质激素175μg/L、黄芩甙元0.1mg/L和飞燕草素35μg/L；
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养24h后，再置于低氧环境下培养24h后，皮肤干细胞采用冰浴超声破碎对皮肤干细胞进行裂解，冰浴超声破碎条件为间歇超声，超声破碎的功率320W，每工作10s，间歇3s，循环40次，收集并裂解得到的皮肤干细胞，并通过孔径为1nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。所述低氧条件为氧气5%、二氧化碳5%、氮气90%。
实施例2：与实施例1的不同之处在于步骤（1）：
（1）采用从脐血中分离得到脐带间充质干细胞：
使用分离液对脐血中的单个核细胞进行提取和收集，并对剩余红细胞组分中的单个核细胞再次分离和提取；洗涤两次收集的单个核细胞；将非特异性促贴壁蛋白及特异性促贴壁蛋白包被在培养瓶底部；待原代细胞融合率达到60%时进行传代培养；使用继续对传代的脐血间充质干细胞进行培养，待细胞融合率达到80%后进行传代。
通过实施例1和实施例2对细胞指数的影响发现，采用脐带组织块得到的脐带间充质干细胞更易得，操作更为便捷。
实施例3：与实施例1的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养48h后收集并裂解得到的皮肤干细胞，并通过孔径为1nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
实施例4：与实施例1的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞直接在低氧环境下48h后收集并裂解得到的皮肤干细胞，并通过孔径为1nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
收集实施例1、实施例3、实施例4的提取物加入至成纤维细胞培养48h后，将成纤维细胞进行裂解，取各组细胞上清，加入100uL胶原分离与浓缩试剂，4℃过夜后离心弃上清。将标准胶原分别稀释为0、0.01、0.05、0.10、0.20、0.5、1.00mg·mL1。各样本管中加入500μLsircol染料孵育30min，用1×Acid-SaltWashReagent清洗。向各管中加入250uL碱性金属试剂，涡旋混匀。转移200μL样本至96孔板中。用酶标仪检测，检测波长为555nm，用水调吸光值为零，测定空白试剂、标准胶原和检测样本空白试剂吸光度，读数重复试验误差士10%，重复3次，实施例1、实施例3、实施例4的胶原蛋白的检测结果如图1所示。
由图1可知，实施例1、实施例5和实施例6，按照实施例1，采用先正常培养24h后，再置于低氧环境下培养24h后的方式得到的提取物，对成纤维细胞培养中胶原蛋白的产生量具有促进作用。
实施例5：与实施例1的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养18h后，再置于低氧环境下培养24h后并通过孔径为1nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
实施例6：与实施例1的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养30h后，再置于低氧环境下培养24h后并通过孔径为1nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
实施例7：与实施例1的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养36h后，再置于低氧环境下培养24h后并通过孔径为1nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
实施例8：与实施例1的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养24h后，再置于低氧环境下培养18h后并通过孔径为1nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
实施例9：与实施例1的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养24h后，再置于低氧环境下培养30h后并通过孔径为1nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
实施例10：与实施例1的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养24h后，再置于低氧环境下培养36h后并通过孔径为1nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
收集实施例1、实施例5-10提取物加入至成纤维细胞培养48h后，将成纤维细胞进行裂解，取各组细胞上清，加入100uL胶原分离与浓缩试剂，4℃过夜后离心弃上清。具体操作如上述。实施例1、实施例5-10提取物成纤维细胞生成胶原蛋白的影响如图2所示。
由图2所示，实施例9中提取物对成纤维细胞生成胶原蛋白含量最高，故采用实施例9中的时间参数，即步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养24h后，再置于低氧环境下培养30h后并通过孔径为1nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
实施例11：与实施例9的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养24h后，再置于低氧环境下培养30h后并通过孔径为0.3nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
实施例12：与实施例9的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养24h后，再置于低氧环境下培养30h后并通过孔径为0.5nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
实施例13：与实施例9的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养24h后，再置于低氧环境下培养30h后并通过孔径为1.5nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
实施例14：与实施例9的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养24h后，再置于低氧环境下培养30h后并通过孔径为2.0nm分子筛，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物。
对比例1：与实施例9的不同之处在于步骤（3）：
(3)将步骤（2）得到皮肤干细胞正常培养24h后，再置于低氧环境下培养30h后，得到的活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物，不经过分子筛处理。
收集实施例9、实施例11-14，对比例1提取物1天内加入至成纤维细胞培养48h后，将成纤维细胞进行裂解，取各组细胞上清，加入100uL胶原分离与浓缩试剂，4℃过夜后离心弃上清。具体操作如上述。实施例9、实施例11-14、对比例1提取物成纤维细胞生成胶原蛋白的影响如图3所示。
由图3可以看出，实施例9、实施例13和实施例14均可以使纤维细胞的胶原蛋白的生成量提高到4.0mg/mL以上。
同时将实施例9、实施例13-14、对比例1提取液做保存存放在37℃下存储6、12、24、36个月后，将收集实施例9、实施例11-14、对比例1提取物加入至成纤维细胞培养48h后，将成纤维细胞进行裂解，取各组细胞上清，加入100uL胶原分离与浓缩试剂，4℃过夜后离心弃上清。具体操作如上述。实施例9、实施例11-14提取物成纤维细胞生成胶原蛋白的影响如图4所示。
由图4可知，在37下存在6、12、24、36个月后，实施例9和实施例11使纤维细胞的胶原蛋白的生成量最为稳定，从侧面说明其中所含的活性物质的含量最稳定。
一种脐带间充质干细胞提取物的检测方法如下，将本发明实施例13的脐带间充质干细胞提取物做如下检测：
1.检测方法：蛋白质提取→蛋白质处理→C18反相Tip柱除盐→反相液质联用RPLC-MS。
蛋白质提取
（1）细胞样品：向EP管中加入300μL含有1%蛋白酶抑制剂的1%SDS溶液，冰浴超声破碎2min（10son，10off，避免过热损失蛋白质）；21000×g4℃离心15min，取上清；采用BCA发测定蛋白质浓度。
（2）培养基样品：取1mL培养基，加入2mL甲醇，涡旋混匀，冰上静置5min；21000×g4℃离心15min，弃上清；加入300μL1%SDS溶液，涡旋溶解蛋白质沉淀；采用BCA发测定蛋白质浓度。
蛋白质处理
（1）上述两种蛋白质溶液相同处理，如下：溶液95℃变性10min，冷却至室温；向离心管中加入3μL1M二硫苏糖醇（DTT），56℃恒温振荡1.5h；冷却至室温，加入6μL1M碘乙酰胺（IAA），避光反应30min。
（2）使用FASP(filter-aidedsamplepreparation)酶解方法进行酶解：200μL50mM碳酸氢铵（ABC）润洗超滤膜，取50μg处理的蛋白质上样至超滤膜上，离心去除缓冲溶液；加入200μL50mMABC溶液，充分将SDS去除；加入100μLpH8缓冲溶液，1μgTrypsin蛋白酶，37℃恒温振荡反应12h；加入5μL三氟乙酸（TFA）终止酶解，更换离心管，离心收集肽段混合物。
反相Tip柱除盐
（1）活化：使用1.5mL离子管（盖子上用尖锐工具打直径0.3cm的孔）固定Pep-Tip除盐柱（仅用于处理50μg样品），加入200μLBPhase，5000×g（或7000rpm）离心5min；
（2）平衡：加入200μLAPhase，5000×g（或7000rpm）离心5min；
（3）吸附样品：加入样品，3000×g（或5000rpm）离心10min；
（4）脱盐：200μLAPhase清洗柱子，5000×g（或7000rpm）离心5min；
（5）洗脱：更换低吸附离心管收集样品，200μLBPhase，5000×g（或7000rpm）离心5min，冻干洗脱液。
（6）溶解：离心管中加入20μLAPhase，-20℃冻存，等待上样。
反相液质联用RPLC-MS
（1）数据采集软件：Xcalibur(Thermo,USA)；色谱柱信息：单柱模式，分离柱：75μm×200mm（C18，1.9μm粒径，120A孔径）；色谱仪器：Easy-nano1000；质谱仪器：QExactivePlus（Thermo,USA）
（2）色谱条件：分析柱平衡体积：5μL；上样量：3μL；Loading体积：8μL
色谱分离时间：120min；A：0.1%甲酸水溶液；B：80%乙腈，0.1%甲酸
流速：200nL/min；梯度如表1：
（3）。
（4）质谱条件：MS扫描范围（m/z）355-1700，分辨率70,000，最大离子注入时间100ms，MS/MS离子注入时间75ms，扫描范围200-2000，分辨率35,000，碎裂模式：高能碰撞（HCD），碎裂能量（NCE）：27；排除1价及高于7价的离子，动态排除时间60s，数据依赖采集模式（DDA），一个MS1图谱选择10个最强的母离子进行串级扫描。
数据分析
质谱产生的原始数据.Raw文件通过ProteinDiscovery2.2.0（Thermo）进行定性分析，ProteinDiscovery参数如下：数据库为UniProtKB（2015_04,42121），其他参数设置如下：母离子质量容差10ppm；碎片离子质量容差：0.05Da；蛋白质酶：Trypsin；最多允许2个漏切位点；固定修饰：carbamidomethyl(C)；可变修饰：oxidation(M)和acetyl(proteinN-term)。
检测结果
2.1质控数据：
样品：200ngHeLa液质分析基峰色谱图；样品量：200ng，检测结果如图5所示。
由图5可知，肽段高效分离是保证质谱检测的前提，图5中，提取离子色谱图峰宽<0.5min，说明肽段得到很好的分离；色谱峰平滑，并未出现明显毛刺，说明电喷雾（ESI）稳定，可以实现肽段的高效离子化。
图6可以发现质谱质量轴偏差小于2ppm，充分说明质谱状态正常；从20ngHeLa酶解产物中鉴定的肽段数目9,505条，蛋白质鉴定数目2439，该数据也说明液质联用系统状态良好，可用于样品测定。
蛋白质鉴定列表做以下说明：
coverage：覆盖率；Peptides：所有肽段；PSMs：鉴定次数；UniquePeptides：该蛋白质组的唯一肽段数；AAs：蛋白序列长度；MW：蛋白质的分子量；calc.pI：蛋白质的等电点。K-Q列：每个样本定量情况；R-X列：每个样本的定量值；ScoreMascot：蛋白搜库打分；PeptidesMascot：肽段搜库打分；
肽段鉴定结果的每列做以下说明：
Sequence：肽段序列；Modifications：肽段修饰；Qvalityq-value：实际RDR（假阳性率），值越小越好；ProteinGroups：出现在几个ProteinGroups中；Proteins：出现在几个蛋白中；PSMs：鉴定次数；MasterProteinAccessions：最佳匹配蛋白号；MissedCleavages：漏切位点；Theo.MH+[Da]：理论质荷比；J-P列：肽段在每个样本中的定量情况；Q-中的定量值；IonsScoreMascot：母离子打分；W：肽段在每个样本。
（2）细胞样品鉴定结果
样本信息：人源细胞；上样量：200ng，细胞样品鉴定结果如图7所示，细胞样品母离子误差分布图如图8所示；细胞样品肽段漏切率分布如图9所示。
图7、8说明液质联用系统可以很好的实现样品处理后肽段的高效分析，质谱状态稳定。
图9显示包含少于2个漏切位点的肽段占比达到99.5%，充分说明样品前处理方法完全可以很好的进行样品预处理，即超声波提取+FASP膜酶解。采用该方法从200ng细胞样品中鉴定的蛋白数目为3609。
（3）细胞培养基样品鉴定结果
样本信息：人源细胞；上样量：200ng。人源细胞培养基样品液质分析BasePeak图如图10所示，细胞样品肽段漏切率分布如图11所示。
图10、11包含少于2个漏切位点的肽段占比为96%，基峰色谱图图显示肽段较少，说明样品主要是高丰度蛋白质。最终，从200ng细胞培养基样品中仅鉴定了7种蛋白。
表2为本发明脐带间充质干细胞提取物检测结果
。
一种含有脐带间充质干细胞提取物的美容面霜，所述的美容面霜包括以下组分及其质量百分比，实施例13制得的间充质干细胞提取物10.5％、羊毛醇3.5％、白蜂蜡7.5％、山茶花提取物2.3％、SOD5％、肌肽2％、壳寡糖2％、汉生胶2.5％、蜂胶3％、余量为水。
对比例2：所述的美容面霜包括以下组分及其质量百分比，羊毛醇3.5％、白蜂蜡7.5％、山茶花提取物2.3％、SOD5％、肌肽2％、壳寡糖2％、汉生胶2.5％、蜂胶3％、余量为水。
对比例3：受试者不使用任何护肤产品。
试验方法：筛选150例皮肤出现老化的女性受试志愿者，年龄30-50岁，平均年龄40岁，入选标准：皮肤干燥、弹性降低、出现皱纹、色素沉着、肤色灰暗等皮肤老化现象，在整个试验期间不使用其他抗衰老产品。
150名女性受试志愿者分为3组每组50例，分别为实施例13组和对比例2-3组，其中对照组3为受试者不使用任何护肤产品，实施例13组和对比例2-3组受试者分别使用本发明实施例13和对比例2制得的美容面霜，早晚洁面后取适量的美容面霜涂抹于面部，各组整个试验时间为60天，记录试验期间发生的不良反应，并对受试者进行效果评价，部分受试对比图如图12所示。
皮肤老化评估：通过观察受试者的5个受试区的皱纹来评价(眉间纹、前额皱纹、鱼尾纹、鼻唇沟、唇周皱纹)，评判标准：没有皱纹；轻度(有2-3条皱纹，长度<1.5cm)；中度(有2-6条浅皱纹，长度<3cm)；重度(有数条主皱纹，长度达4cm，同时伴有浅皱纹)。
安全性评估：主要评价使用产品后受试者出现轻微不适、红斑、干燥、瘙痒和刺痛等不良反应的发生情况。
在第100天对受试者采用无创性仪器检测受试部位的含水量、油脂含量，进行统计分析。试验结果如表3-4所示。
表3不同化妆品对受试者脸部安全性评估
。
表4不同化妆品对受试部位的含水量、油脂含量
。
由表2及表3可知，本发明的美容面霜可以改善皮肤暗黄、红斑，提高皮肤角质层含水量及油脂含量。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
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