具体实施方式

本说明书的公开内容涉及一种吸入粉末剂、其评价方法及其用途。根据本说明书所公开的吸入粉末剂，通过吸气进行分散破碎，因此分散性和肺到达性优异，而且，在高湿度环境下吸湿溶胀，能够在肺部发挥附着凝聚性。

此外，根据本说明书所公开的吸入粉末剂的评价方法，能够评价分散性、肺到达性和附着性优异的吸入粉末剂，并管理其特性。

此外，根据本说明书所公开的吸入粉末剂，以肺及其周边器官为目标，能够提供对肺部的疾病、障碍的预防和治疗有用的药物组合物。

下面，适当参照附图对本公开的代表性且非限定性的具体例进行详细说明。该详细说明只是单纯地为了向本领域技术人员示出用于实施本公开的优选例的细节，而不是为了限定本公开的范围。此外，下面公开的追加特征和发明，为了提供进一步改善的“吸入粉末剂及其评价方法”等，可以与其他的特征、发明分开或者一起使用。

此外，下面的详细说明中公开的特征、工序的组合在最广义上不是实施本公开时所必须的，而仅仅是为了特别说明本公开的代表性的具体例而记载的。此外，上述和下述代表性的具体例的各种特征、以及独立和从属权利要求所记载的各种特征，在提供本公开的追加且有用的实施方式时，不是必须按照在此记载的具体例或所列举的顺序进行组合。

除实施例和/或权利要求书所记载的特征的构成之外，本说明书和/或权利要求书所记载的全部特征作为对原始申请的公开内容和请求保护的特定事项的限定，单独且互相独立地被公开。进一步，与全部数值范围和组或集合有关的记载，作为对原始申请的公开内容和请求保护的特定事项的限定，旨在公开它们的中间的构成。

(吸入粉末剂)

本说明书所公开的吸入粉末剂(以下，也简称为本粉末剂)可以在能够通过吸气进行分散、破碎并且能够在吸湿时溶胀的多孔性中空球形颗粒的至少一部分中含有有效成分。下面，对这样的本粉末剂的各种特性及其评价方法进行说明，接着，对本粉末剂的制造方法进行说明。

(本粉末剂的粒径)

本粉末剂的粒径可以通过干式激光衍射法来测定。根据累积粒度分布曲线，可以计算50％粒径(D₅₀)。例如，可以使用激光微米粒度仪(LMS-2000e)或其同等装置进行测定。本粉末剂的50％粒径并无特别限定，但考虑到飞散性、分散性，例如可设为1μm以上且100μm以下，另外，例如可设为2μm以上且50μm以下、5μm以上且20μm以下等。另外，例如可设为5μm以上且20μm以下，另外，例如可设为5μm以上且15μm以下等。

(本粉末剂的颗粒形状)

本粉末剂的颗粒形状可以用扫描型电子显微镜进行观察。观察时，例如，使用在本粉末剂的分散添加中使用的粉末微粒添加设备在试样台上喷雾后，按照适于SEM观察的方式，根据需要涂铂，并进行观察。作为粉末微粒添加设备和喷雾方法，例如可以采用在后述的实施例中使用的设备和方法。

本粉末剂的粒径形状没有特别限定，但考虑到飞散性、分散性等，优选为球形。此外，若考虑飞散性、溶胀性等，则优选为多孔性。此外，优选具有中空结构。典型地，本粉末剂可以是由本粉末剂的有效成分、赋形剂等构成成分构成的分隔壁划分出通过水的升华而产生的多个孔部(中空部)的、具有多个孔部(中空部)的多孔性球形颗粒等。

(吸入特性)

本粉末剂通过吸气(从口腔向支气管抽吸时的气流)被递送到呼吸器官，通过利用安德森级联撞击器(ACI)法进行评价，能够评价这种情况下的特性(吸入特性)、即本粉末剂的分散性、递送性、崩解性。分散性、递送性和崩解性是各自独立的特性，但相互关联。

(基于安德森级联撞击器(ACI)法的评价方法)

在本说明书中，ACI法是指，采用第十七次修订日本药典第一增补版一般试验法6.15吸入剂的空气动力学粒度测定法5.2安德森级联撞击器法(装置2)中记载的测定装置。可以适当使用预分离器。作为测定装置，可以列举例如低容量空气采样器、安德森型、AN-200型、柴田科学株式会社制造的装置。

测定装置的概要和测定方法的一例如图1所示。如图1所示，具备测定装置、作为导入部分的设备、喉管、从阶段0到阶段7的八个阶段、以及最下层的过滤器。各阶段具有过滤器结构，构成为越往下能够对越小的空气动力学粒径的颗粒进行分级捕捉。在各阶段中分级的颗粒的粒径(μm)，作为抽吸量为28.3L/min时的截止直径，例如可以采用图1所示的直径。在图1中，还一并记载与各阶段对应的呼吸器官部位。

基于ACI法的本粉末剂的评价可以按照上述一般试验法5.2.2安德森级联撞击器法(装置2)的5.2.2吸入粉末剂的测定顺序。即，能够以28.3L/min的流量和4L的空气量来实施。另外，还根据吸入设备适当选择吸入阻力。

测定后，测定用于导入的胶囊、设备、喉管、各阶段和过滤器上的本粉末剂(颗粒或有效成分)的质量。本粉末剂的质量的测定除了定量地检测有效成分以外，例如也可以通过为了评价目的而对颗粒赋予适当的标记并测定该标记来实施。对于本领域技术人员来说，有效成分的定量可以根据需要实施，并且这样的标记的利用和检测是本领域技术人员公知的。

(分散性和递送特性)

关于本粉末剂的分散性和递送性，可以将使用下式得到的数值等作为指标进行评价。另外，在本说明书中，将阶段3之后作为对吸入剂的应用有效的肺内递送区域，将阶段5之后作为能够期待全身作用的肺深部递送区域。

通过以下的式(1)计算设备的释放率即OE(Output Efficiency：％)。

此外，能够通过式(2)、(3)分别计算表示从设备释放的本粉末剂中到达了阶段3和阶段5之后的比例的FPF_Stage3和FPF_Stage5(Fine Particle Fraction：％)。此外，能够通过式(4)计算表示总回收量中到达了阶段5之后的比例的OE×FPF_Stage5(％)。

OE(％)＝回收量T(μg)/总回收量(μg)×100 (1)

(其中，回收量T是喉管之后的回收量)

FPF_Stage3(％)(FPF3)

＝阶段3之后的回收量(μg)/回收量T(μg)×100 (2)

FPF_Stage5(％)(FPF5)

＝阶段5之后的回收量(μg)/回收量T(μg)×100 (3)

OE×FPF_Stage5(％)

＝阶段5之后的回收量(μg)/总回收量(μg)×100 (4)

OE为分散性的指标，FPF3为肺内递送性的指标，FPF5为肺深部递送性的指标值。

此外，由于各阶段能够与呼吸器官部位对应，因此，装置中的各部位、各阶段中的本粉末剂的回收量相对于来自测定装置的总回收量的比例(回收率％)能够用作向各自对应的呼吸器官的部位的递送率的指标。

本粉末剂在基于ACI法的吸入特性评价中，例如OE可以为80％以上。这是因为，当为80％以上时，可以说释放率良好。OE也可以例如为85％以上，例如为90％以上，例如为95％以上。

此外，本粉末剂在基于ACI法的吸入特性评价中，例如FPF3可以为20％以上，也可以例如为30％以上，例如为40％以上。例如，当为40％以上时，可以说肺递送率极好。还例如为50％以上，例如为60％以上，例如为70％以上，例如为80％以上，例如为90％以上。另外，根据吸入粉末剂的有效成分、用途，有时FPF3为20％以上也是足够的。

此外，本粉末剂在ACI法中的吸入特性评价中，FPF5例如可以为10％以上，也可以例如为15％以上，例如为20％以上，例如为25％以上，例如为30％以上。这是因为，当为30％以上时，可以说肺深部递送率极好。FPF5还例如为40％以上，例如为50％以上，例如为55％以上，例如为60％以上，例如为65％以上。另外，根据吸入粉末剂的有效成分、用途，有时FPF5为10％以上也是足够的。

本粉末剂在基于ACI法的吸入特性评价中，可以在阶段2～4中的任何一个和过滤器中具备回收率的峰值。这是因为，通过具有该回收率特性，可以说本粉末剂除了破碎性乃至崩解性优异以外，吸湿溶胀性优异，肺深部递送性优异。典型地，能够在阶段3和过滤器中具备回收率的峰值。此外，典型地，过滤器中的回收率的峰值比其他的峰值大，例如大30％以上，还例如大40％以上。

(崩解性)

本发明人们可以通过ACI法评价本粉末剂的崩解性。本粉末剂的崩解性可以根据本粉末剂的崩解率和质量中值空气动力学直径求出。

这样的特性评价在本粉末剂中有用的原因被推断为，本粉末剂因抽吸而部分崩解，产生最初大小的颗粒的一部分崩解而得到的颗粒，最初大小的颗粒和崩解颗粒混合存在。该推断的概要如图8所示。如图8所示，最初大小的颗粒因吸入气流而部分崩解，维持在较大状态的颗粒例如附着于肺的支气管附近，崩解后得到的小粒径的颗粒进一步流入到肺的深部。

粉体的粒度分布根据经验遵循对数正态分布，当相对于截止直径的对数值绘制每个阶段的回收率的累计值时，能够得到直线，可以使50％粒径为MMAD、使(84.3％粒径)/(50％粒径)为几何标准偏差(GSD)。可以说本粉末剂具有对数正态图不为直线而为曲线的特性。

在本说明书中，认为粒径较大的粉体(具有质量中值空气动力学直径MMAD_c及其几何标准偏差GSD_c)与较小的粉体(具有质量中值空气动力学直径MMAD_f和几何标准偏差GSD_f)以比率(1-R)：R(崩解率)存在，并求出崩解率R和质量中值空气动力学直径MMAD_f，c及其几何标准偏差GSD_f，c。

(崩解率和质量中值空气动力学直径)

根据通过ACI法得到的八个测定点(阶段1至过滤器)的回收率(相对于释放量的％)的累计值，对各阶段求出下述A～D的值，求出E最小时的R、MMAD_c、GSD_c、MMAD_f、GSD_f(参照表1)。另外，在A～D以及E最小时的各个数值的计算中，例如可以使用表计算软件即Excel(微软公司)的下述函数和求解器功能等。另外，作为截止值，使用图1所示的数值。

表1

A＝通过NORM.S.INV函数对每个阶段的回收率的累计值(％)进行变换而得到的概率变量

B＝通过NORM.DIST函数计算出的粒径较大的颗粒(MMAD_c和GSD_c)的回收率的累计值

C＝通过NORM.DIST函数计算出的粒径较小的颗粒(MMADf和GSD_f)的粉体的回收率的累计值

D＝通过NORM.S.INV函数对B×(1-R)+C×R的值进行变换而得到的概率变量

E＝对每个阶段求出的(D-A)²的合计值

根据以上内容，可以说，本粉末剂可以具有在基于ACI法的吸入特性评价中根据上述条件计算的质量中值空气动力学直径MMAD_c(第一质量中值空气动力学直径)和比上述第一质量中值空气动力学直径小的第二质量中值空气动力学直径MMAD_f(第二质量中值空气动力学直径)。

此外，在本粉末剂中，具有第二质量中值空气动力学直径的粉体的质量相对于全部粉体(具有第一和第二质量中值空气动力学直径的粉体)的总质量的比率(％)(崩解率)例如可以为40％以上。这是因为，当为40％以上时，肺深部递送率较高。崩解率还例如为44％以上，例如为50％以上，例如为55％以上，例如为60％以上。

(吸湿性、溶胀性)

此外，本粉末剂在动态水分吸附测定法中，在37℃下变化至50％RH～95％RH时，例如70％RH下的质量变化率可以为2％以下。这是因为，当为2％以下时，可以说在吸入前具有充分的耐湿性。还例如质量变化率为1.5％以下，例如为1％以下。

另外，例如95％RH下的质量变化率可以为8％以上。这是因为，当为8％以上时，容易吸湿。该质量变化率还例如为9％以上，例如为10％以上，例如为11％以上。

动态水分吸附测定法是指使用动态水分吸附测定装置(DVS：Dynamic VaporSorage；DVS advantage、Surface Measurement Systems)的方法，该装置以秒量级监视天平上的试样随着所设置的温湿度环境下的水分的吸附解吸而产生的质量变化。可以评价吸入后到呼吸道内、再到高湿度的肺深部的耐吸湿性和吸湿性生长。在本说明书中，可以以吸入前的环境为“温度37℃、相对湿度(RH)50％(绝对湿度：6.903g/m³)”、以吸入后的肺内环境为“温度37℃、95％RH(绝对湿度：41.62g/m³)”进行评价。

另外，关于吸湿、溶胀性，在通常的条件(即干燥条件、约40％RH以下)下用ACI法评价后，采集各阶段上的颗粒作为干燥时的颗粒，然后抽吸加湿空气(例如90％RH以上)，接着采集各阶段上的颗粒作为加湿时的颗粒，利用SEM等分别观察这些颗粒的颗粒形状，从而能够评价吸湿性和溶胀性。

或者，在相同条件下实施ACI法，不同之处在于，在ACI法中，在设备与喉管之间配置用于调节干湿条件的盒子，并将该盒子设置为干燥条件和加湿条件。其结果是，通过评价所得到的各阶段的回收率，能够评价颗粒的吸湿性和膨胀性。

进一步，在扫描型电子显微镜的试样台上散布本粉末剂后，在37℃的水浴上短时间(例如数秒至数十秒以内)曝露，并进行SEM观察。根据水蒸气曝露前后的颗粒形状的变化，能够评价吸湿性和膨胀性。

如图8所示，通过具备适当的吸湿、溶胀性，能够确保崩解性，并且通过在吸入时崩解之后，能够在呼吸道等中吸湿、溶胀而沉积到肺深部。

本粉末剂在以上说明的特性的一个或两个以上指标中可以具备有利的特性。这样的本粉末剂的分散性、肺递送性和沉积性优异，可用作吸入粉末剂。

(本粉末剂的组成及其制造方法)

本粉末剂通常用于药物用途，并且可以含有药学上可接受的赋形剂。作为该赋形剂，没有特别限定，例如可以含有选自亮氨酸、甘露醇和海藻糖的一种或两种以上。优选使用三种。这三种赋形剂分别能够有助于本粉末剂的上述有利的特性。亮氨酸、甘露醇和海藻糖没有特别限定，均可以使用天然类型，即L-亮氨酸、D-(-)-甘露醇、D-(+)-海藻糖。

例如，亮氨酸能够有助于耐吸湿性和高分散性。对此，本发明人们已经进行了报告(Chem.Pharm.Bull.64，239-245(2016))。甘露醇能够有助于崩解性。海藻糖能够有助于吸湿、溶胀性。甘露醇和海藻糖能够有助于高湿度下的吸湿、溶胀性。因此，通过将这三者适当组合，能够提供在保存时耐吸湿性优异、在抽吸时分散性和崩解性良好、在相当于肺内的高湿度环境下吸湿溶胀性优异的制剂。

亮氨酸、甘露醇和海藻糖在本粉末剂中的含量没有特别限定，例如甘露醇：海藻糖：亮氨酸的质量比可以为0以上且10以下：0以上且5以下：85以上且100以下等。优选可以为大于0且10以下：大于0且5以下：85以上且100以下，进一步优选可以为5以上且10以下：1以上且5以下：85以上且94以下等。另外，本粉末剂除了上述赋形剂以外，还可以适当使用公知的赋形剂。

(阴离子性成分)

此外，本粉末剂也可以具有阴离子性聚合物或其盐即阴离子性成分作为赋形剂。阴离子性成分虽不是很明确，但可以推断为，其作为固体物质的有效成分与核酸共存，从而能够提高核酸向细胞的导入效率。此外，可以推断为，使其在通过喷雾冷冻干燥等干燥含有核酸的本粉末剂时共存，从而有助于维持核酸的生物活性。对于这样的阴离子成分及其可用性，本发明人们已在日本特开2018-11588号公报中公开。

作为阴离子性聚合物，没有特别限定，可以列举在分子中含有阴离子性基团、带负电且分子量为500～400万左右的天然来源或合成的聚合物。阴离子性基团没有特别限定，可以使用在1分子中具有多个、优选具有五个以上的聚合物，作为这样的官能团，例如可以列举羧基、-OSO₃H基、-SO₃H基、磷酸基。另外，作为这样的阴离子性聚合物，还包括两离子性聚合物。

作为阴离子性聚合物，更具体而言，可列举：具有阴离子性基团的多糖类或其衍生物；包含侧链具有阴离子性基团的氨基酸残基的多肽；具有羧基侧链的PEG衍生物；具有阴离子性基团的合成聚合物等。

作为具有阴离子性基团的多糖类或其衍生物，可列举葡糖胺聚糖。该葡糖胺聚糖的分子量优选为1000～400万，更优选为4000～300万。葡糖胺聚糖具体可列举透明质酸、软骨素、硫酸软骨素、羧甲基纤维素、硫酸角质素、肝素、硫酸皮肤素等。其中，透明质酸被认为非常有助于核酸导入、保护。作为以透明质酸为代表的各种葡糖胺聚糖的衍生物，除了可以列举通过导入聚乙二醇、肽、糖、蛋白质、碘酸、抗体或其一部分等而得到的物质以外，还可以列举导入精胺、亚精胺等并具有带正电的部分的两离子性的衍生物等。

透明质酸或其盐可以使用大范围的分子量的透明质酸或其盐，而无需特别过问其来源。例如，透明质酸的平均分子量(典型地为重均分子量)优选为5000以下(小于)，平均分子量也可以为10000以上、20000以上、30000以上。此外，平均分子量还可以为40000以上。此外，上限也没有特别限定，例如，平均分子量可以为200000以下，也可以为150000以下。此外，例如，优选使用平均分子量为50000以上且110000以下。作为这样的透明质酸或其盐(例如钠盐)，例如可以适当使用FCH-SU(分子量5万至11万)、微透明质酸FCH(分子量5000以下(或小于))(均为龟甲万百欧凯米发公司制)等。

透明质酸的重均分子量优选为15000以上且40000以下。通过使用这样的透明质酸或其盐，有时能够提高siRNA等裸核酸的导入效率。

透明质酸的重均分子量可以为30000以上且70000以下，此外，也可以为40000以上且60000以下。通过使用该透明质酸或其盐，能够足够高地发挥作为有效成分的核酸的生物活性(例如，在核酸为表达盒的情况下其表达量等)，并且能够发挥适当的吸入特性。

透明质酸的平均分子量例如可以通过将尺寸排阻色谱法和多角度光散射检测器组合的方法(SEC/MALS，例如“日本国立医药品食品卫生研究所报告”，2003年，121卷，p.30-33)、Morgan-Elson法和Carbazol硫酸法的组合等来求得(参照专利文献日本特开2009-155486号公报)。优选使用SEC/MA LS。

作为包含侧链具有阴离子性基团的氨基酸残基的多肽，优选列举具有500～100万的分子量的肽。作为这样的多肽，具体可以例示聚谷氨酸、聚天冬氨酸等。

作为具有羧基侧链的PEG衍生物，可列举每1分子PEG具有多个、优选具有五个以上羧基侧链、且具有500以上、优选2000以上、更优选4000～40000的分子量的PEG衍生物。

作为具有阴离子性基团的合成聚合物，可以为每1分子具有多个、优选为五个以上阴离子性基团的聚合物或共聚物，优选为具有500～400万的分子量的聚合物或共聚物。作为这样的聚合物或共聚物，具体而言，可列举分子量1000～300万的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物、或聚乙烯醇的硫酸酯体、琥珀酰亚胺化聚-L-赖氨酸等。

作为阴离子性聚合物的盐，例如除了钾、钠等碱金属的盐以外，还可以列举钙、镁等碱土金属的盐、铵盐等。根据所使用的阴离子性聚合物，可适当选择其盐。

在本粉末剂中，可以适当组合使用一种或两种以上各种形态(即，聚合物的种类、分子量、盐的种类等)的阴离子性成分作为赋形剂。对于本粉末剂中使用的阴离子性成分，如后所述，只要能够提高作为固体物质的核酸的稳定化、向细胞的导入、细胞中的基因表达或抑制等核酸固有的功能表达等，则可以适当地商购获得、根据需要人工合成、或者适当组合使用。

本粉末剂中的核酸与阴离子性成分的配合比率没有特别限定，取决于阴离子性成分的种类、作用于后述的分散辅助剂的赋形剂的有无等，例如，相对于1质量份的核酸，可以为5质量份以上且100质量份以下。更优选为5质量份以上且50质量份以下。另外，例如为25质量份以上且45质量份以下，例如为30质量份以上且43质量份以下，例如为25质量份以上且40质量份以下，例如为30质量份以上且43质量份以下。

(疏水性氨基酸)

本粉末剂还可以含有一个或两个以上疏水性氨基酸作为赋形剂。可以认为，当含有该氨基酸时，能够提高向细胞供给本粉末剂时的分散性、吸入给药时的吸入特性等。对于该疏水性氨基酸及其可用性，本发明人们已在日本特开2018-11588中公开。

作为疏水性氨基酸，可以列举亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸等。其中，优选使用亮氨酸和苯丙氨酸。可以认为，能够提高具有较佳疏水性且作为固相存在的核酸等有效成分和阴离子性成分的分散性等。例如，可以认为，苯丙氨酸有助于核酸等有效成分的较佳的细胞导入效率。苯丙氨酸也可以代替亮氨酸使用。

疏水性氨基酸相对于核酸等有效成分的配合比率没有特别限定，可以在能够提高核酸的分散性等的范围内适当设置。例如，相对于1质量份的核酸，可以为5质量份以上且100质量份以下。更优选为5质量份以上且50质量份以下。还例如为4质量份以上且24质量份以下、6质量份以上且19质量份以下，例如为9质量份以上且19质量份以下，例如为9质量份以上且24质量份以下。

作为本粉末剂的组成的一例，可以含有重均分子量为30000以上且70000以下、优选为40000以上且60000以下的透明质酸或其盐和苯丙氨酸等疏水性氨基酸，作为有效成分以外的成分即赋形剂。当为该组成时，可以很好地兼顾作为有效成分的核酸的生物活性(基因表达、基因表达抑制等)与本粉末剂的吸入特性。进一步，相对于这两种成分的赋形剂的总质量，所述透明质酸或其盐可以含有例如40质量％以上且90质量％以下、还例如50质量％以上且90质量％以下、60质量％以上且90质量％以下、60质量％以上且85质量％以下。苯丙氨酸等疏水性氨基酸可以为余量。通过这样的比率，能够容易地实现兼顾核酸的生物活性和吸入特性。

(阳离子性载体)

在本粉末剂含有核酸时，优选不含有阳离子性载体。阳离子性载体一般可用于向细胞中导入核酸等，但即使是阳离子性聚合物等非病毒性阳离子性载体，也有可能表现出细胞毒性等，因此优选不含有阳离子性载体。作为该阳离子性载体，没有特别限定，可以列举具有阳离子性基团的阳离子性聚合物、阳离子性脂质。作为阳离子性聚合物，可列举具有阳离子性基团的多糖类、侧链具有阳离子性基团的多肽、具有阳离子性基团的人工聚合物或它们的盐等。

作为这样的阳离子性载体，例如，作为阳离子性脂质(包括阳离子性胆固醇衍生物)，可列举DC-Chol(3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨甲酰基)胆固醇)、DDAB(N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵)、DMRI(N-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基氯化铵)、DODAC(N，N-二油基-N，N-二甲基氯化铵)、DOGS(双十七酰氨基甘氨酰亚精胺)、DOSPA(N-(1-(2，3-二油氧基)丙基)-N-(2-(精胺羧酰氨基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵)、DOTAP(N-(1-(2，3-二油氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵)、或DOTMA(N-(1-(2，3-二油氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵)、以及它们的组合。

如以上说明的那样，本粉末剂除了有效成分外，还可以包括赋形剂。作为赋形剂，除了选自亮氨酸、海藻糖和甘露醇中的至少一种以外，还可以采用包括阴离子性成分、以及根据需要包括疏水性氨基酸的形态。进一步，本粉末剂并不排除包括通常用于下述组合物中的添加剂，该组合物包括实现基因表达或其抑制的DNA、RNA等。

本粉末剂中可以含有有效成分。有效成分的含量没有特别限定，例如相对于总质量，可以为0.2％以上且15％以下左右。

作为有效成分，没有特别限定，只要能够用于后述的喷雾冷冻干燥法即可。通常为有机化合物，例如核酸也包括在内。

核酸可以包括天然核酸和非天然核酸，天然核酸是天然存在的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，非天然核酸是包括至少部分具有非天然结构的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物。天然的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸具备天然碱基。天然碱基为天然的DNA和RNA中的碱基，可列举腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外，天然的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸具有其2-脱氧核糖和/或核糖的5位点的磷酸与邻接的脱氧核糖和/或核糖的3’位点的羟基通过磷酸二酯键连结而成的骨架。在本说明书中，作为天然核酸，也可以是DNA、RNA和脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸的嵌合体(以下，也称为DNA/RNA嵌合体)。此外，DNA、RNA可以分别为单链，也可以为相同类型的双链，还可以为DNA与RNA杂交而成的杂交体。进一步，DNA/RNA嵌合体也可以是与DNA、RNA或DNA/RNA嵌合体杂交而成的杂交体。

非天然核酸是指在碱基、骨架(糖部分和磷酸部分)的任意一个中至少部分具有非天然结构的核酸。作为非天然碱基，已知各种非天然碱基。此外，还提供了代替天然的核糖-磷酸骨架的各种骨架。例如，可列举具有碳原子数为三个左右的碳的二醇核酸、肽核酸等代替糖-核糖骨架。此外，天然核酸为L-DNA或L-RNA，但至少部分具备D-DNA和D-RNA的结构的核酸包括在非天然核酸中。在非天然核酸中，也包括单链、双链、杂交体和嵌合体等各种形态。

这种非天然核酸通常不是将蛋白质编码的编码链、模板链，例如用于改变其他功能、例如与细胞内的种类的核酸相互作用来改变该核酸的功能等。典型地，用于靶蛋白的表达抑制和功能抑制这一功能表达。例如，可列举不经由基因表达而直接作用于生物体内核酸的核酸，具体而言，可列举反义核酸、有义核酸、shRNA、siRNA、诱饵核酸、适配体、miRNA等。这种非天然核酸多数为十几个到几十个左右的核苷酸聚合而成的寡核苷酸。

本组合物优选裸核酸状态的核酸。所谓的裸核酸(naked核酸)是指裸的核酸。更具体而言，例如，在要实现基因表达的情况下，可列举使用质粒的核酸构建体(非病毒性载体)。此外，例如，在要实现基因表达的抑制的情况下，除了质粒DNA等非病毒性载体以外，还可列举反义核酸(反义DNA或反义RNA)、shRNA、siRNA、诱饵核酸、适配体、微RNA等。作为裸核酸，也可以为以用于治疗目的的核酸元件为主体、或者仅由该核酸构成而不包括作为仅用于向细胞导入核酸的媒介物的核酸元件的核酸。

裸核酸的形态没有特别限定，可以是线性的，也可以是环形的(闭环或开环)，还可以是超螺旋形的。可以适当地具备与目的相适应的形态。作为裸核酸，优选不具有含有病毒来源的元件的病毒性载体、以及脂质体、阳离子性聚合物等阳离子性的非病毒性载体。这是因为，除了病毒性载体的危险性以外，该非病毒性载体在细胞毒性、靶向性能和表达效率方面也未必足够。

本粉末剂是通过干燥使其自身呈粉末的外观的固相，并且在构成粉末的球形颗粒的一部分中含有作为有效成分的核酸。在本粉末剂中，核酸可以具有结晶或非结晶的状态、即形成固相的状态。

本粉末剂优选可以通过冷冻干燥法制造，更优选可以通过喷雾冷冻干燥法制造。通过采用该制造方法，能够容易地得到作为多孔性中空球形颗粒的本粉末剂。

由以上可知，根据本说明书，提供一种包括有效成分的吸入粉末剂的制造方法，其具备以下工序：利用喷雾冷冻干燥法干燥含有有效成分、以及选自由亮氨酸、甘露醇和海藻糖组成的组中的一种或两种以上作为赋形剂的液体。此外，作为赋形剂，可以与上述赋形剂分开地或与上述赋形剂组合地使用透明质酸或其盐等阴离子性成分和/或疏水性氨基酸。

此外，根据本说明书，也可以实施如下的干燥工序：将溶解有效成分和至少一种赋形剂而得到的液体进行喷雾冷冻干燥，以得到具有上述本粉末剂的球形颗粒的特性、即能够通过吸气进行分散、破碎并且能够在吸湿时溶胀的多孔性中空球形颗粒。得到这样的球形颗粒的赋形剂和其他条件已在本说明书公开。

此外，为了进行该干燥工序，还可以具备如下工序：选择所述赋形剂来制备所述液体，使得所述球形颗粒的基于安德森级联撞击器(ACI)的吸入特性评价为，OE(％)＝喉管之后的回收量(mg)/总回收量(mg)×100为80％以上。此外，也可以选择所述赋形剂来制备所述液体，使得所述球形颗粒的基于ACI的吸入特性评价为，FPF5(％)为30％以上。此外，还可以选择所述赋形剂来制备所述液体，以得到在所述球形颗粒的基于ACI的吸入特性评价中，在过滤器和阶段2～4中的任何一个中具有回收率的峰值的球形颗粒。

(吸入粉末剂的评价方法)

根据本说明书，还提供吸入粉末剂的评价方法。即，本评价方法提供得到在基于ACI法的吸入特性评价中根据已经说明的条件计算的第一质量中值空气动力学直径和比所述第一质量中值空气动力学直径小的第二质量中值空气动力学直径的方法。根据该方法，除了能够评价吸入粉末剂的特性即到达性以外，还能够一并评价崩解性。

此外，根据本说明书，还提供得到具有第二质量中值空气动力学直径的粉体相对于全部粉体的比率(质量)的方法。通过得到该比率(崩解率)，也能够评价吸入粉末剂的到达性和崩解性。崩解率也可以与上述第一和第二质量中值空气动力学直径一起得到。

此外，根据本说明书，还提供在动态水分吸附测定法中、在37℃下变化至50％RH～95％RH时至少测定70％RH下的质量变化率和95％RH下的质量变化率的方法。根据本测定法，能够评价吸入粉末剂的耐湿性、吸湿性和溶胀性。

(本粉末剂的用途)

本粉末剂在有效成分为核酸时，可以用于向细胞中导入核酸。进一步，本粉末剂用于将核酸导入细胞来实现该核酸的各种作用、例如基因表达(蛋白质的合成)、基因表达抑制。

本粉末剂中含有的核酸可以根据本粉末剂的目的而采用各种形态。例如，在核酸包括将蛋白质等编码的编码区域的情况下，核酸可以同时包括能够表达该蛋白质的启动子、终止子等表达控制区域。例如，作为这样的核酸，可列举表达盒或包括表达盒的质粒载体、人工染色体。以启动子、终止子为代表的控制区域、其他元件是本领域技术人员可以根据需要适当选择使用的。此外，质粒载体、人工染色体可以考虑导入的细胞的种类、要导入的核酸的大小等而适当选择。

此外，例如，在抑制基因表达的情况下，如上所述，作为核酸，可列举有义核酸、反义核酸(DNA或RNA等)、shRNA、siRNA、miRNA、诱饵核酸、适配体等形态。此外，核酸也可以是通过转录这样的RNA等而形成的DNA。

应用本粉末剂的细胞没有特别限定，优选为动物细胞、微生物细胞。作为动物细胞，除了包括人类在内的哺乳动物以外，还可列举各种非哺乳动物细胞。作为微生物，可列举酵母、细菌、真菌等，没有特别限定。

本粉末剂可优选用于人类、动物的基因治疗、核酸药物、免疫治疗、胚胎制作等、以及各种遗传关联研究。即，除了所谓的in vivo基因治疗以外，还可用于ex vivo基因治疗。特别地，可用作预防或治疗从鼻腔、口腔的吸入而对基因起作用的疾病、例如支气管和肺部的肿瘤等的粉末剂。

本粉末剂可以为基本上不利用水系介质而供给至细胞的组合物。“基本上不利用水系介质”是指，在应用于细胞时，无需通过缓冲液等以水作为主体的介质(在本说明书中称为水系介质)对本粉末剂进行溶解或分散等。在应用本粉末剂之前通过水(水分)来溶解核酸等，与“基本上不利用水系介质”不矛盾。

包括作为固体物质的核酸的本粉末剂优选将核酸保持为固体物质直接应用于体内细胞，更优选将固相的粉末剂应用于体内细胞。可以认为，通过将包括作为固体物质的核酸的本粉末剂或固相的本粉末剂应用于细胞，能够在细胞表面形成有利于核酸导入的环境。例如，可以认为，这样的形态的本粉末剂以作为生物体内的气液界面而存在的细胞表面的水分为媒介来发挥作用，将核酸吸收到细胞内。

此外，在包括人类在内的动物等中，对于能够使用导管等从外部非侵入性地或大致非侵入性地到达的脏器、例如鼻腔、眼、口腔、呼吸道、肺、胃、十二指肠、小肠、大肠、直肠、膀胱、阴道、子宫、心脏、血管等的内表面(粘膜)，通过将本粉末剂经由适当的气体注入，能够使作为固体物质的核酸到达靶位点。例如，作为吸入方法等，向肺粘膜、鼻腔粘膜供给粉末制剂等是公知的。此外，也可以通过剖腹术、切开术等直接向动物体内、例如皮下、肌肉、腹腔、肿瘤等病变部位供给本粉末剂。另外，在应用本粉末剂时，也可以采用移植到靶组织内部、其表面或其附近等方法。此外，也可以将本粉末剂担载在凝胶状物、海绵等多孔体、无纺布等的表面上并留置。

通过这样以含有作为固体物质的核酸的形态将本粉末剂供给至靶位点或细胞，可以以高浓度向靶位点供给并持续停留在该部位，而无需如以往那样用水系介质稀释。即，本粉末剂基本上能够以高浓度到达靶细胞。其结果是，可以认为能够实现较高的吸收能力和核酸的功能表达。

本粉末剂即使在使用时溶解也会发挥充分的效果。例如，在使用时，也可以通过将本粉末剂悬浮或溶解于水、生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液、培养基溶液等水系介质中来制备再溶解物并应用。关于再溶解，例如使用核酸的100～10000倍(重量比)的溶剂来悬浮或稀释本粉末剂。由于可以使用与冷冻干燥前不同量、不同种类的溶剂，因此也可以容易地制备以往难以得到的浓度比较高的悬浮液、溶液(例如，1ml中含有1mg的DNA的液体)。

本粉末剂也可以是在使用时使非水系介质含有核酸作为固体物质的状态。例如，在使用时，也可以将本粉末剂悬浮在非水系介质中。例如，由于可以使用与冷冻干燥前不同量、不同种类的溶剂，因此能够将以往难以得到的非水系介质作为基质来应用核酸。

这样，在适当的液性介质中溶解或悬浮的本粉末剂可以使用在向生物体细胞导入核酸或其衍生物的过程中通常使用的任何方法。

本粉末剂在细胞中的用量根据上述导入方法、疾病的种类、目的等而不同，例如对于核酸的量，根据给药部位而大不相同，在向肿瘤的局部给药时，例如可以为5～1000μg/cm³肿瘤，在向膀胱等脏器的给药时，例如可以为0.1μg～100mg/脏器，在全身给药时，例如可以为0.1ng～10mg/Kg体重。

实施例

下面，为了更具体地说明本说明书的公开内容，记载了作为具体例的实施例。下面的实施例用于对本说明书的公开内容进行说明，并非限定其范围。

实施例1

(吸入粉末剂的制备)

在本实施例中，按照下表所示的组合来使用荧光染料即荧光素钠(FlNa)作为模型药物，使用如下所示的亮氨酸、甘露醇和海藻糖作为赋形剂。

[化学式1]

表2

吸入粉末剂的种类和赋形剂(甘露醇和海藻糖的组成)

粉末微粒通过SFD(喷雾冷冻干燥法)制备。SFD法由喷雾工序和冷冻干燥工序这两个工序组成。首先，使用喷雾干燥机(SD-1000，东京理化器械株式会社)附带的二流体喷雾喷嘴，将试样溶液以150k Pa喷雾至喷嘴前端下面15cm处的液氮(500mL)中，进行急速冷冻。试样溶液以5mL/min的速度输送，并继续喷雾1.5min。将得到的冰珠加入到连接了冷冻干燥机(FDU-210东京理化器械株式会社)的方形干燥室(DRC-1000东京理化器械株式会社)中，在真空条件下干燥24hr，得到目标制剂。

SFD法的操作条件

表3

实施例2

(粉末剂的基于扫描型电子显微镜的颗粒形状的评价)

用扫描型电子显微镜(SEM：JSM-IT100LA，日本电子株式会社)观察所制备的粉末微粒的颗粒形状。使用图2所示的用于分散添加的粉末微粒添加设备进行喷雾。作为喷雾方法，在经由三通旋塞阀与填充有少量所制备的粉末制剂的100μL吸头连接的1mL注射器(TERUMO)内压缩0.25mL的空气，将三通旋塞阀打开。在粘贴有黑色双面胶带的试样台上分散添加粉末微粒后，在30mV、90sec的条件下涂铂(JFC-1600，日本电子DATUM株式会社)，并进行SEM观察。结果如图2所示。

如图2所示，不论赋形剂的混合比如何，均可获得多孔性中空球形颗粒。另外，对于单独的海藻糖和单独的荧光素钠，无法观察到多孔性中空颗粒。

实施例3

(粉末剂的基于激光衍射散射式粒度分布测定装置(LMS)的粒度分布评价)

在实施例1中制备的制剂的几何学粒径、粒度分布使用了激光衍射散射式粒度分布测定装置(LMS：LMS-2000e、SEISHIN ENTERPRISE Co.，Ltd.)。通过干式单次测定法进行，将空气供给压力设定为0.4Mpa并进行测定。根据得到的累积粒度分布计算50％粒径(D₅₀)，进行粒度分布评价。结果如图3所示。图3一并示出了计算出的D₅₀。

如图3所示，所制备的粉末剂不论混合比如何，均观测到单一的粒度分布。对于部分制剂(M0T0、M5T0、M0T1、M5T1、M10T3、M5T3、M0T5)，观测了100～1000μm附近的制剂。此外，D₅₀在全部制剂中计算出10μm左右的类似的值。

实施例4

(粉末剂的基于ACI的吸入特性的评价)

为了得到吸入特性的详细数据，使用ACI(低容量空气采样器，安德森型，AN-200型，柴田科学株式会社)进行吸入特性评价。

在评价方法中，将约1.0mg的试样填充在2号HPMC胶囊(快力胶囊株式会社)中，通过日立ROTARY BEBICON(BEBICON，200RC-20C5，日立产机系统株式会社)以28.3L/min的流量(PFR)进行抽吸。抽吸时间为10sec。吸入设备使用吸入阻力不同的单、双、反向吸入器(Jethaler(注册商标)，Hitachi Automotive Systems Measurement,Ltd)。

(粉末剂的回收率的计算)

将沉积在设备、胶囊、喉管、过滤器、各阶段中的试样溶解在50ml或10ml的磷酸缓冲液(PBS)中，然后用多孔板检测仪(Enspire，株式会社珀金埃尔默日本)对FlNa的浓度进行定量(激发波长：490nm，荧光波长：515nm)，计算出各部分的回收量和回收率。根据需要进行了稀释定量。各阶段的回收率如图4所示。

(粉末剂的各项指标的计算)

根据本实验结果，由前述的式(1)～(4)计算出OE、FPF_Stage3、FPF_Stage5和OE×FPF_Stage5。各种制剂的这些指标如图5所示。

(粉末剂的质量中值空气动力学直径的计算)

在实施例1中制备的粉末剂存在对数正态图为曲线的趋势，因此，可以认为，部分粉体会崩解，粒径较大的粉体(设MMAD和GSD为MMAD_c和GSD_c)与较小的粉体(MMAD_f和GSD_f)以(1-R)：R的比率产生。因此，根据在ACI分析中得到的八个测定点(回收率的累计值)，使用Excel的函数对各阶段求出下述A～D的值，通过Excel的求解器功能求出E最小时的R、MMAD_c、GSD_c、MMAD_f、GSD_f。这些结果如图6所示。另外，图6一并示出颗粒崩解前后的粉体的分析结果的一例。

A＝通过NORM.S.INV函数对每个阶段的回收率的累计值(％)进行变换而得到的概率变量

B＝通过NORM.DIST函数计算出的MMAD_c和GSD_c的粉体的回收率的累计值

C＝通过NORM.DIST函数计算出的MMAD_f和GSD_f的粉体的回收率的累计值

D＝通过NORM.S.INV函数对B×(1-R)+C×R的值进行变换而得到的概率变量

E＝对每个阶段求出的(D-A)²的合计值

如图4和图5所示，结果是，过滤器的制剂沉积量最多，为20％以上。无论哪种制剂，各阶段的回收率中最高的均是阶段3。此外，如图5所示，特别是在包括甘露醇的制剂中，存在能够得到良好的指标(OE、FPF)的趋势。

如图6所示，利用求解器功能分析的崩解率R在Man含有率为0％时为45％左右，在5～10％时为约50～60％，随着Man的添加而增加。另一方面，由于Man的添加，MMAD_c和MMAD_f变小(Man 0％：4.3μm左右，Man 5～10％：3.5～4.0μm)(Man 0％：0.35μm左右，Man5～10％：0.2μm)。由以上内容可知，甘露醇极大地有助于崩解性。

实施例5

(粉末剂的耐吸湿性、吸湿性评价)

对于在实施例1中制备的各种SFD制剂和组成即各种原料粉末(Leu、Man、Tre、FlNa)，使用动态水分吸附测定装置(DVS：Dynamic Vapor Sorage；DVS advantage、SurfaceMeasurement Systems)对吸入后到呼吸道内、再到高湿度的肺深部的耐吸湿性和吸湿性生长进行了评价。

DVS可以将试样填充到天平型的测定部的一侧，以秒量级监视试样随着所设置的温湿度环境下的水分的吸附、解吸而产生的质量变化。评价的测定条件如下表所示。关于吸湿性生长评价的条件设置，为了再现粉末微粒到达肺深部为止的温湿度环境变化，使吸入前的环境为“温度37℃、相对湿度(RH)50％(绝对湿度：6.903g/m³)”，使吸入后的肺内环境为“温度37℃、95％RH(绝对湿度：41.62g/m³)”。结果如图7所示。

DVS测定条件

表4

如图7所示，当对SFD制剂彼此进行比较时，其结果是，Man和Tre的比例越大，相对湿度越高，随之，越吸湿，质量变化率越高。此外，Leu的比例越大，即使在高湿度下也表现出耐吸湿性。此外，对于Leu、Man和Tre各自的质量变化率，当比较原料粉末(约0.08、0.29、22％)与SFD制剂的质量变化率(约0.14、2.40、41％)时，其结果是，SFD制剂的质量变化率更高。

实施例6

(粉末剂的长期保存试验(耐吸湿性、吸湿性))

在本实施例中，使用将萤火虫荧光素酶编码的质粒DNA(对于吸入特性，使用荧光染料即荧光素钠(FlNa))作为模型药物，使用L-亮氨酸(以下也记为Leu)和透明质酸(钠盐、重均分子量50000，以下也记为LHA)作为赋形剂，按照下面的组成来制备喷雾冷冻干燥用液体，并进行喷雾冷冻干燥。

[1]试样1(pDNA/LHA/Leu)

含有1mg的pDNA、12.5mg的LHA和36.5mg的Leu(共计50mg)的水溶液

[2]试样2(pDNA/LHA)

含有1mg的pDNA、49mg的LHA(共计50mg)的水溶液

另外，喷雾冷冻干燥按照实施例1在喷雾气压150kPa、试样溶液的流速5ml/min、喷雾喷嘴的直径0.4mm、干燥时间24小时、最终真空度5Pa以下、最终搁板温度10℃的条件下进行。将得到的粉末制剂在5℃/干燥(硅胶)、25℃/干燥(硅胶)和25℃/75％RH这三个条件下保存至12个月，通过SEM评价了吸入特性和基因表达。

(SEM观察)

试样1和试样2的任意一个在干燥条件下，即使在12个月后也维持多孔性中空结构，而在加湿条件(75％RH)下，试样1从保存开始起1个月内吸湿，试样2在刚保存后至1周内吸湿，之后基本上不能构成多孔性中空结构。根据SEM观察，试样1的耐吸湿性比试样2优异。

(吸入特性)

对于吸入特性，按照实施例4进行评价。在吸入特性评价中使用包括FlNa的粉末剂。结果如图9A和图9B所示。如图9A所示，试样1在干燥条件下没有观察到明显的吸入特性的降低，而在加湿条件下，4个月后FPF3降低、MMAD增加。这表示初期的球形颗粒会因为吸湿而凝聚。此外，如图9B所示，试样2在干燥条件下吸入特性不会随保存时间而变化，FPF3也低，MMAD也高达大约5～8μm。此外，在加湿条件下，由于吸湿而无法测定。

(基因表达)

将试样1和2的粉末剂给药到小鼠肺内，评价基因表达效果。如下进行对小鼠的给药和评价。

(1)小鼠肺内给药

作为预处理，在戊巴比妥(50mg/kg，i.p.)麻醉下，将雌性ICR小鼠(5周龄)的前牙放在自制的固定板上，并使胸部垂直。使用光源(MegaLight100(商标)，肖特日本株式会社)，一边将光局部照射在胸部，一边打开小鼠的嘴，用镊子拔出舌头。在嘴内确认看起来为白色的孔的气管，将安装于插管辅助器械(使用Liquid Micro Spram(商品名，PennCentury,Inc))的喷嘴梢部分)的小鼠肺内给药用套管(总长4.0cm的PE-60聚乙烯管)插入气管内3.0cm。

将套管留在气管内并且仅拔出插管辅助器械后，确认呼气会从套管中通过，之后，将肺内给药用设备的吸头前端插入套管内，配合小鼠的吸气，释放0.25mL的压缩空气，由此将预先填充在吸头内的各粉末剂0.5mg(pDNA为10μg)给药到肺内。

(2)肺内基因表达效果的评价

使用IVIS(商标)检测、分析基于荧光素酶活性的发光，来进行评价。测定时使用的luciferin使用PBS调整为30mg/mL，在-80℃下保存后使用。通过Isoflurane(异氟烷，商标，雅培公司)麻醉，在小鼠肺内给药6、12、24、48小时后，经鼻给药发光底物即luciferin(30mg/mL，0.05m L/小鼠，300mg/kg)。给药luciferin 10分钟后，在Isoflurane麻醉下，曝光时间(exposure time)1分钟内检测到发光。制作相当于肺的感兴趣区域(region ofinterest：ROI，长1cm，宽3cm)，求出其发光强度(Total Flux(photon/sec))作为基因表达量，并分析了基因表达量-时间模式。根据得到的基因表达量-时间模式，分别求出基因表达量-时间曲线下面积(AUC)和最大基因表达量(Luc(max))。结果如图10所示。

如图10所示，试样1和试样2在干燥条件下即使在12个月后也大致维持初期的基因表达，而在加湿条件下在4个月内显著降低。此外，试样2的表达量比试样1高。

根据以上内容可知，如果本粉末剂在干燥条件下，则能够维持其吸入特性和基因表达特性。

实施例7

(透明质酸的分子量和基因表达)

在本实施例中，研究了使用各种分子量的透明质酸(钠盐)的粉末剂对基因表达造成的影响。

使用重均分子量2000、5000、50000、80000和350000(分别称为HA2等)的透明质酸，制备了含有pDNA(将萤火虫荧光素酶编码的质粒DNA)1mg(2质量％)、各透明质酸12.5mg(25质量％)、苯丙氨酸36.5mg(73质量％)的共计50mg的喷雾冷冻干燥用液体。透明质酸采用由NaOH调节至pH7.0±0.5的溶液。通过与实施例6同样的方法对该溶液进行喷雾冷冻干燥，制造粉末剂。

对于所制造的各种粉末剂，将人源肺泡癌细胞即A549细胞以2×102个细胞/孔(气液界面培养系统Transwell(注册商标))的细胞接种数培养4～9天后，从填充有0.4～0.6mg的粉末剂的粉末添加设备向这些孔中添加一定量的粉末剂。经过48小时后，将孔内的细胞冻融并破坏，之后添加Picagene，用发光计测定荧光。结果如图11所示。如图11所示，重均分子量为50000的HA50显示出最高的基因表达。

接着，对于重均分子量50000的HA50，pDNA固定为1mg(2质量％)，使HA的量为12.5mg(25质量％)、24.5mg(49质量％)、36.5mg(73质量％)、49mg(98质量％)，制备了分别包括36.5mg(73质量％)、24.5mg(49质量％)、12.5mg(35质量％)、0mg(0质量％)的苯丙氨酸的四种喷雾冷冻干燥用液体各5ml。通过与实施例6同样的方法对这些溶液进行喷雾冷冻干燥，制造粉末剂，并以与上述相同的方式评价基因表达。结果如图12所示。

如图12所示，包括73质量％的HA50和12.5质量％的苯丙氨酸的组合物显示出最高的基因表达效果。根据以上内容可知，从基因表达的观点出发，HA50较佳，此外，组合使用苯丙氨酸是有用的。此外，从基因表达的观点出发，HA50的含量在全部赋形剂中优选为50质量％以上，例如为50质量％以上，例如为60质量％以上，例如为70质量％以上，优选例如为90质量％以下，例如为85质量％以下，例如为80质量％以下，还优选从这些下限值和上限值中选出的组合所定义的范围。此外可知，HA50和苯丙氨酸等赋形剂相对于100质量份的HA50，在从例如10质量份以上、例如15质量份、例如20质量份以上的下限值、例如40质量份以下、例如35质量份以下、例如30质量份以下的上限值中分别选出的下限值和上限值所定义的范围内是有用的。

实施例8

(包括透明质酸和苯丙氨酸的粉末剂的吸入特性)

对包括在实施例7中确认了良好的基因表达的透明质酸(重均分子量50000)和苯丙氨酸的粉末剂的吸入特性进行了确认。本实施例中，使用荧光染料即荧光素钠(FlNa)，并使用L-苯丙氨酸(以下也记为Phe)和透明质酸钠(重量平均分子量50000，以下也记为HA50)作为赋形剂，按照下面的组成制备喷雾冷冻干燥用液体，并进行了喷雾冷冻干燥。另外，HA50采用了由NaOH调节至pH7的溶液。

[1]试样1

含有2质量％的FINa、98质量％的HA50和0质量％的Phe(共计50mg)的溶液5ml

[2]试样2

含有2质量％的FINa、73质量％的HA50和25质量％的Phe(共计50mg)的溶液5ml

[3]试样3

含有2质量％的FINa、49质量％的HA50和49质量％的Phe(共计50mg)的溶液5ml

[4]试样4

含有2质量％的FINa、25质量％的HA50和73质量％的Phe(共计50mg)的溶液5ml

另外，喷雾冷冻干燥按照实施例6进行，得到粉末剂，并按照实施例4评价了吸入特性。结果如图13所示。如图13所示，HA50的质量％越低、Phe的质量％越高，则肺到达性越高。此外，所有制剂均显示出良好的MMAD，HA50的质量％越低、Phe的质量％越高，则MMAD越小。

另外，从这样的吸入特性评价的结果可知，所有制剂的肺内到达率即“FPF3”、“OE×FPF3”均为20％以上。此外还可知，HA50为25质量％的制剂即Phe含量越多的制剂，能够获得更高的吸入特性。此外还可知，所有制剂的MMAD均为1～6μm，因此适合作为吸入剂。如此可知，根据本实施例，优选HA50与苯丙氨酸的组合。

此外，图14表示能够根据图12所示的体外的基因表达效果和图13所示的吸入特性的结果推断的、以HA50和苯丙氨酸为赋形剂的吸入粉末剂的有效性。

如图14所示可知，通过使HA50相对于HA50和苯丙氨酸这两种成分的总质量为40质量％以上且90质量％以下、例如为50质量％以上且90质量％以下、60质量％以上且90质量％以下、60质量％以上且85质量％以下、甚至60质量％以上且80质量％以下等，可期待吸入粉末剂的高有效性。