具体实施方式

众所周知，在修复由创伤、感染或肿瘤引起的骨缺损中，通常用同种异体、自体或合成移植材料代替缺失/去除的材料。如果骨缺损涉及皮质损失，即使松质骨已经愈合，也要花费大量时间来建立新的皮质。取决于皮质缺损的大小，尤其是如果皮质缺损是分段的，则其可能无法愈合。骨折不愈合的情况也是如此，占所有高冲击性骨折的5％。

骨膜疑似乎参与骨缺损的成功愈合，因为骨膜细胞在皮质骨愈合中具有很强的作用。用于严重缺陷的特殊手术是，临时插入垫片(spacer)，以在垫片周围形成类似于骨膜的软组织壳(具有高代谢活性)，然后在几个月后进行骨移植，从而去除垫片。重新缝合如此形成的临时骨膜，并允许移植物愈合为正常骨。

本发明的人造骨膜是修复骨缺损的理想材料，因为含胶原膜充当骨缺损的覆盖物，并且在某些方面还提供了替代材料。本发明的人造骨膜减少了膨胀、渗漏，并且当用生物分子功能化时，形成了新的桥接皮质。可以用圆周环将其胶合、缝合或打结到骨上或骨周围。它可以通过高嵌体(onlay)或嵌体技术插入皮质下来应用。如果使用骨活性剂进行功能化，则其将加速皮质骨再生。

在最广泛的方面，本发明涉及已经功能化的含胶原膜。

如本文所用，术语“胶原”是指所有形式的胶原，包括已经加工或以其他方式修饰的胶原。优选的胶原经过处理以去除免疫原性的端肽区域(“端胶原”)，是可溶的，并且将已经被重构为纤维形式。。

术语“含胶原膜”是指一块或一段已经通过本领域已知的方法产生并且例如在美国专利号7,096,688中公开的含有胶原的组织。含胶原膜可以是任何几何形状，但是通常基本上是平面的，并且在位置上可以与下面的组织或上覆的组织形状一致。

含胶原膜优选具有以下性能：

a)以有利于组织整合和血管生成的方式相互连接的孔；

b)生物降解性和/或生物吸收性，以使正常组织最终替代含胶原膜；

c)促进细胞附着、增殖和分化的表面化学；

d)力量和柔韧性；和

e)低抗原性。

含胶原蛋白的膜通常由“含胶原组织”制备或制造，“含胶原组织”包含在任何哺乳动物中发现的致密结缔组织。术语“含胶原组织”是指可以从含有胶原的哺乳动物体内分离出的皮肤、肌肉等。术语“含胶原组织”还涵盖胶原或含胶原材料已在体外组装或制造的“合成”产生的组织。

在一些实施方案中，从哺乳动物中分离含胶原组织，包括但不限于绵羊、牛、猪或人。在其他实施方案中，从人分离含胶原组织。

在一些实施方案中，含胶原组织是“自体的”，即从需要治疗的患者身体分离的。

在一些实施方案中，含胶原膜将包含大于80％的I型胶原。在其他实施方案中，含胶原膜将包含至少85％的I型胶原。还在其他实施方案中，含胶原膜将包含大于90％的I型胶原。

可以通过本领域已知的任何方法来制造含胶原的膜；然而，一种首选方法包括以下步骤：

(i)分离含胶原组织，并在乙醇溶液中孵育该组织；

(ii)将步骤(i)中的含胶原组织在包含无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中孵育，以使其中所含的非胶原蛋白变性；

(iii)将步骤(ii)中产生的含胶原组织在包含无机酸的第二溶液中孵育，直到所述材料中的胶原变性为止；和

(iv)将步骤(iii)中产生的含胶原组织在包含无机酸的第三溶液中孵育足够的时间，同时机械刺激，以使所述含胶原组织中的胶原束对齐；其中机械刺激包括向含胶原组织周期性地施加张力。

将理解的是，可以在第一溶液中使用任何无机盐，只要它能够与路易斯酸形成络合物即可。在一些实施方案中，无机盐选自由三甲基氯化铵、四甲基氯化铵、氯化钠、氯化锂、高氯酸盐和三氟甲磺酸盐组成的组。在其他实施方案中，无机盐是氯化锂(LiCl)。

尽管在第一溶液中可以使用任何数量的阴离子表面活性剂，但是在一些实施方案中，阴离子表面活性剂选自由烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐组成的组。特别有用的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐，例如十二烷基硫酸钠(SDS)。

在一些实施方案中，第一溶液包含约1％(v/v)的SDS和约0.2％(v/v)的LiCl。

在一些实施方案中，第二溶液中的无机酸包含约0.5％(v/v)的HCl，而第三溶液中的无机酸包含约1％(v/v)的HCl。

本领域技术人员将理解，三个步骤的每个步骤中的孵育期，将取决于下述而变化：(i)含胶原组织的类型；(ii)无机盐/酸和/或阴离子表面活性剂的类型；(iii)所使用的各无机盐/酸和/或阴离子表面活性剂的强度(浓度)，以及(iv)孵育温度。在一些实施方案中，步骤(i)中的孵育期为至少8小时。在其他实施方案中，步骤(ii)中的孵育期少于60分钟，而在其他实施方案中，步骤(iii)中的孵育期为至少为20小时。

在一些实施方案中，步骤(ii)中的孵育在约4℃下。在其他实施方案中，步骤(ii)中的孵育进行至少12小时。

在一些实施方案中，第二溶液包含约0.5％(v/v)的HCl。

在一些实施方案中，步骤(iii)中的孵育进行约30分钟。在其他实施方案中，步骤(iii)中的孵育在震荡下进行。

在一些实施方案中，第三溶液包含约1％(v/v)的HCl溶液。

在一些实施方案中，步骤(iv)中的孵育进行约12-36小时，优选约24小时。在其他实施方案中，步骤(iv)中的孵育在震荡下进行。

在一些实施方案中，该方法还包括步骤(iii)和步骤(iv)之间的中和步骤，该中和步骤包括将所述含胶原组织与约0.5％(v/v)的NaOH一起孵育。

在一些实施方案中，该方法还包括步骤(v)，该步骤包括将来自步骤(iv)的含胶原组织与丙酮一起孵育，然后干燥该含胶原组织。

在一些实施方案中，该方法还包括在步骤(ii)和(iii)之间和/或步骤(iii)和(iv)之间，使含胶原组织与甘油接触，以可视化并促进脂肪和/或血管的去除的步骤。

可以使甘油与含胶原组织接触有助于脂肪和/或血管去除的任何时间。在一些实施方案中，接触时间为至少10分钟。

在一些实施方案中，该方法还包括在步骤(ii)和(iii)之间和/或在步骤(iii)和(iv)之间用于含胶原组织的洗涤步骤。在步骤(ii)和(iii)之间所用的洗涤步骤的目的是去除变性的蛋白质。因此，可以使用能够去除变性蛋白质的任何洗涤溶液。在一些实施方案中，在步骤(ii)和(iii)之间所用的洗涤溶液是丙酮。

用丙酮洗涤后，用无菌水进一步洗涤含胶原组织。

在一些实施方案中，将含胶原组织在NaOH:NaCl溶液中进一步洗涤。如果用NaOH:NaCl洗涤含胶原组织，则优选然后用无菌水洗涤。

在一些实施方案中，在步骤(iv)之后，用第一溶液进一步洗涤含胶原组织。

本文所述方法中所用的术语“同时机械刺激”是指，在含胶原组织的化学加工过程中拉伸含胶原组织的过程。含胶原组织可以经历静态和/或周期性拉伸。因此，在一些实施方案中，同时的机械刺激可以包括：

(i)将含胶原组织拉伸预定的时间；

(ii)使含胶原的组织松弛预定的时间；和

(iii)n倍重复步骤(i)和(ii)，其中n是大于或等于1的整数。

如果通过拉伸含胶原组织进行机械刺激，则优选沿含胶原组织的长轴拉伸所述含胶原组织。

在一些实施方案中，同时机械刺激包括向含胶原组织周期性地施加张力，其中张力的周期性包括约10秒至约20秒的拉伸期和约10秒的松弛期，并且由此产生的应变为约10％，并且如本文所述，机械刺激持续到含胶原组织内的胶原束对齐为止。

一旦产生，含胶原组织包含具有编织结构的胶原纤维或胶原束。如本文所用，术语“编织结构”是指包括第一组和第二组纤维或束的结构，其中第一组中的纤维或束主要在第一方向上延伸，而第二组中的纤维或束主要在第二方向上延伸，其中第一方向和第二方向彼此不同，并且第一组中的纤维或束与第二组中的纤维或束交织或以其他方式编织。方向差可以为约90°。

通过优选方法制备的含胶原组织包括大于20N的“最大拉伸负荷强度”。在一些实施方案中，本发明的含胶原组织的最大拉伸负荷强度大于25N、40N、60N、80N、100N、120N或140N。

此外，相信含胶原组织实施方案的编织结构在含胶原片的最大负荷下提供了减小的延伸，同时提供模量的增加。

如本文所用，术语“模量”是指杨氏模量，并且作为应力与应变之比来确定。这提供了含胶原组织和/或片的刚度的量度。

在一些实施方案中，所述含胶原组织具有高于100MPa的模量。在其他实施方案中，所述含胶原组织具有高于200MPa、300MPa、400MPa或500MPa的模量。

如本文所用，术语“最大负荷下的延伸(extension at maximum load)”是指，参考未负荷条件下含胶原组织的原始长度，含胶原组织在最大拉伸负荷强度下的延伸。这与将更大的最大延伸形成对比。

在一些实施方案中，含胶原组织在最大负荷下的延伸小于原始长度的85％。

一旦已产生了含胶原组织，可将其成形为含胶原膜以供使用。在一些实施方案中，所述含胶原膜可通过使所述膜成形以提供原位操作的更好方式来被。

优选本发明的含胶原膜足够厚，从而为药物-载体混合物提供支撑；但是，不要太厚，以至于损害了原位操作所述含胶原膜的能力。因此，在一些实施方式中，所述含胶原膜的厚度为25μm至200μm。在一些实施方案中，所述含胶原膜的厚度为30μm至180μm。在其他实施方案中，所述含胶原膜的厚度为35μm至170μm。在其他实施方案中，所述含胶原膜的厚度为40μm至160μm。在其他实施方案中，所述含胶原膜的厚度为45μm至150μm。在其他实施方案中，所述含胶原膜的厚度为50μm至140μm。在其他实施方案中，所述含胶原膜的厚度为50μm至100μm。最后，在一些实施方案中，所述含胶原膜的厚度为约50μm。

一种形式的含胶原膜确保该膜被穿孔，以允许天然骨活性分子的运输，或移植材料中的治疗活性剂能够传递并通过该膜，从而从上覆肌肉(overlaying muscle)中募集循环干细胞和周细胞。

含胶原膜优选具有两个不同的表面(任一侧)：以密实胶原束为特征的光滑表面，和疏松胶原纤维的粗糙多孔表面。粗糙侧特别擅长促进细胞附着，并且在实践中，当将膜与上覆肌肉一起使用时，至关重要的是，粗糙侧面向肌肉。但是，在没有上覆肌肉的情况下，例如在远端胫骨的修复中，粗糙侧面向任何具体表面就不是那么重要。

一旦制成，含胶原膜由诸如形态发生蛋白2(BMP-2)和唑来膦酸(ZA)和/或羟基磷灰石(nHAP)纳米颗粒等生物活性分子进在膜的每一侧上进行功能化。

在一个实施方案中，使用Teotia et al.(2017),ACS Appl.Mater.Interfaces,9(8),pp 6816-6828中所述的湿化学方法合成nHAP。简而言之，将四水硝酸钙(Ca(NO₃)₂·4H₂O,0.96M)的碱性溶液(pH 10.0)在恒定搅拌下保持在90–100℃，然后与正磷酸氢二铵((NH₄)₂HPO₄,0.6M)的水溶液以受控的速率混合。通过添加NH₄OH溶液不断监测系统的pH值并将其保持在pH 10.0。nHAP以白色晶体从溶液中沉淀出来。反应完成后，将晶体保持在母液中，用于在室温下在碱性条件中成熟48小时。成熟后，将晶体从溶液中滤出，并用Milli-QI型水(DI-H₂O)彻底洗涤。然后将晶体在120℃下干燥。

在一些实施方案中，对合成的nHAP进行热处理，以增强其结晶度、密度和相纯度。温度条件范围为500至1000℃，保持时间为1-4小时。

然后仅仅通过含胶原膜浸入含有nHAP的无菌盐溶液中，即可将合成的nHAP应用于所述含胶原膜。

也可以同时将生物活性分子掺入nHAP溶液中，或将其独立应用于含胶原膜中。将生物活性分子(ZA、BMP-2)在无菌水或盐水中混合，然后每克nHAP使用600μL水，与无水nHAP混合，或通过浸入将其应用于含胶原膜。

上述过程的最终结果是本发明的人造骨膜。

在人造骨膜的一种形式中，将药物-载体混合物应用于功能化的含胶原膜。

因此，在本发明的一种形式的人造骨膜中，包括药物-载体混合物。所述药物-载体混合物的载体组分可以是本领域已知的任何含钙载体混合物，包括磷酸钙水泥(CPC)。载体组分还可包括其他额外载体。

本发明人造骨膜的药物-载体混合物中的治疗剂包括能够刺激、促进、增强或诱导骨形成或抑制骨再吸收的骨活性剂。治疗剂可以是在治疗部位减轻疼痛和/或炎症，或治疗癌症或治疗或预防微生物感染的骨修复药物或其他骨活性剂。药物-载体混合物在治疗部位释放治疗剂。优选药物-载体混合物将治疗剂的释放维持延长的时间段。

如下文更详细描述的，通过将治疗剂与合适的载体材料例如磷酸钙水泥粉末混合，来制备药物-载体混合物。取决于具体实施方案，可以通过将药物-载体混合物固化并将其研磨成粉状来对其进行进一步加工。如下文所述，还可以将药物-载体混合物与合适的骨基质材料组合，以形成本发明的人造骨膜。或者，可以将药物-载体混合物应用于功能化的含胶原膜，从而也形成本发明的人造骨膜。然后可以例如通过植入将人造骨膜应用于治疗部位。

可用于药物-载体混合物载体组分中的磷酸钙水泥(CPCs)包括磷酸三钙混合物，例如α-磷酸三钙(αTCP)和β-磷酸三钙(β-TCP))。可以使用的其他CPC包括磷酸二钙和磷酸四钙的组合。也可以使用市售磷酸钙水泥，例如本文公开的实施例中所用的Hydroset(由Stryker Corp销售)。Hydroset是一种柔软的磷酸三钙水泥，其具有α-TCP和β-TCP(1:3)混合物的特征。在一些实施方案中，磷酸钙水泥及其混合物也可以用羟基磷灰石(例如2.5％wt/wt羟基磷灰石晶体)接种。α-TCP和β-TCP可以以各种比例使用。例如，在一些实施方案中，CPC包含α-TCP和β-TCP(1:3)的混合物以及任选的羟磷灰石种子。在其他实施方案中，α-TCP和β-TCP可以以1:1或1:0的比率使用。在其他实施方案中，CPC是种有2.5％羟基磷灰石的α-TCP水泥，其在固化后产生较硬的水泥。

药物-载体混合物可以包括至少部分脱矿质的骨基质。骨基质可以是脱矿质骨基质腻子(putty)，也可以是部分或全部脱矿质的完整骨基质。完整骨基质可用于骨移植手术中，并充当递送骨修复药物的支架。

人脱矿质骨基质腻子也可用于药物-载体混合物的载体组分中。它可以从商业来源获得，例如RTI Biologics(佛罗里达州阿拉卡瓦)生产的Puros脱矿质骨基质腻子。也可以通过Urist&Dowell(Inductive Substratum for Osteogenesis in Pellets ofParticulate Bone Matrix,Clin.Orthop.Relat.Res.,1968,61,61-78.)所描述的方法制备脱矿质骨基质腻子。该方法包括骨脱矿质并脱脂，然后将固体的脱矿质的骨切成小块，然后在液氮下将小块研磨成粗粉。融化后，研磨的脱矿质骨基质呈现出腻子的稠度。

如果需要，用于磷酸三钙水泥粉末的固化溶液在本领域中是众所周知的，并且包括2.5％w/v之间的Na₂HPO₄溶液或市售溶液。参见Dorozhkin,Materials 2009,2,221-291。

载体组分的另一个实例是，通过使用Kumar等人(Mater.Today,13,(2010),42-44)的冷冻凝胶化技术，将明胶与硫酸钙(CaS)组合而产生的组分，所述组合含有或不含有羟基磷灰石(HA)。另一实例描述于使用明胶-CaS-HA复合材料的Raina et al.(2018),JControl Release,Vol.272,83-96中，和丝绸、壳聚糖、生物活性玻璃和HA的类似复合材料描述于Raina et al.J Control Release,Vol.235,365-378.(2016)中。Murphy及其合作者还描述了用于递送rhBMP-2和ZA的一种多孔胶原羟基磷灰石基载体，但均会导致松质骨再生(Murphy et al.(2014),Acta Biomaterialia,Vol 10,Issue 5)。

可以通过将治疗剂溶解在适当的溶剂例如乙醇中，并将该溶液添加到载体混合物中，来制备药物-载体混合物。排放溶剂后，将治疗剂-载体混合物混合，以将治疗剂均匀(即均质)分布在整个载体混合物中，然后如果需要，将治疗剂-载体混合物用适当的固化溶液湿润，以产生药物-载体混合物。

治疗方法

本发明的人造骨膜可用于治疗由于牙周病、外科程序、癌症或创伤引起的骨折和骨丢失。本发明人造骨膜的其他用途包括在骨制备中增加骨密度用于接收牙科或整形外科植入物的用途、涂覆植入物用于增强的骨整合，以及在所有形式的脊柱融合术中的用途。

本发明提供了治疗方法，该方法包括向有需要的患者施用本发明的人造骨膜，如本文所述，人造骨膜可以含有治疗有效量的骨修复药物。治疗方法通常包括刺激、促进、增强或诱导骨形成或抑制骨再吸收。治疗方法还包括例如促进骨重塑，激活成骨细胞，促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞，增加成骨细胞的数量和活性，增强平均壁厚，增强小梁骨体积，改善骨结构，改善小梁连接性，增加皮质厚度，抑制骨丢失，维持/改善骨强度，增加总骨体积或类骨质的体积。治疗方法还包括治疗骨质疏松症、骨折、低骨密度或牙周病中的一种或多种。

在该治疗方法的一个实施方案中，通过从本文所述的药物-载体混合物中释放来施用一种或多种骨修复药物。在另一个实施方案中，与全身(例如口服)施用的另一种治疗剂组合，从药物-载体混合物施用骨修复药物。例如，可以与一种或多种全身施用的治疗骨丢失或骨质疏松症的其他治疗剂组合，通过从人造骨膜中缓慢释放，施用修复骨药物。

该治疗方法还包括将人造骨膜局部施用于人、其他哺乳动物和鸟类的所需作用部位，例如，施用于诸如牙槽缺损的骨空隙中，邻近牙槽骨，或由手术、创伤或疾病引起的骨缺损。

本发明还提供了治疗骨相关疼痛、炎症、感染和/或骨癌的方法，包括施用含有治疗有效量的止痛剂、抗炎药、抗癌剂和/或抗微生物剂的人造骨膜。可以将治疗疼痛、炎症、癌症和/或感染的方法与任何上述治疗骨病症的方法组合使用。

组合疗法包括施用含有一种或多种本文所述化合物和一种或多种额外药剂的单一药物剂量制剂，以及以其自身单独的药物剂量制剂所述化合物和每种额外的药剂。例如，可以将本文所述的化合物和一种或多种额外的药剂在具有固定比例的每种活性成分的人造骨膜中一起施用于患者，或者每种药剂可以以单独的剂量制剂施用。例如，可以通过在骨缺损部位局部递送活性药物的人造骨膜，组合全身施用的另一种药物，来治疗患者。在使用单独的剂量制剂的情况下，可以在基本上相同的时间(例如同时)或在各自的交错时间(例如，顺序地)施用本发明的化合物和一种或多种额外的药剂。

在本发明的一个方面，例如，用天然或合成来源的骨移植物或骨移植物替代物、独立的或复合的替代物填充骨空隙，然后用本发明的包含功能化的含胶原膜和药物-载体混合物的人造骨膜覆盖，或用本发明的羟基磷灰石和/或生物活性剂功能化的含胶原膜覆盖。含胶原膜充当桥梁，并通过引导的组织再生来再生骨。

本发明的人造骨膜的一种用途是作为已经填充了骨移植材料的骨中的缺损和/或空隙的外部覆盖物。可以使用本领域已知的任何方法将人造骨膜保持在适当位置，包括缝合、夹紧或用医用粘合剂固定。也可以简单地将人造骨膜在骨内膜骨(endosteal bone)下压紧。

在一些实施方案中，使用医用粘合剂原位固定本发明的人造骨膜。医用胶粘剂的优点是它们适合接触体液。关于人造骨膜，医用粘合剂可以用于促进锚定人造骨膜，或者可以用于以结构方式将一部分人造骨膜固定在一起。为了方便起见，本文所用的粘合剂通常是指应用形式的粘合剂以及固化后固化形式的粘合剂组合物。合适的医用胶粘剂应当是生物相容的，因为它们是无毒的，无致癌性的，并且不会引起溶血或免疫应答。合适的生物相容粘合剂包括市售外科粘合剂，例如氰基丙烯酸盐粘合剂(cyanoacralate)(例如EthiconProducts的氰基丙烯酸2-辛酯，DERMABOND^TM)、纤维蛋白胶(例如Baxter的)及其混合物，尽管可以使用广范围的合适的粘合剂。

为了修复骨中的长段缺损，可以用任何骨移植物替代物(合成的、原生的、天然的)填充空腔，该替代物可以包括或不包括内部或外部固定。然后，可以将本发明的人造骨膜包裹在皮质骨周围，从而将骨移植物替代物保持在适当位置，从而可以避免两步Masquelet手术。Masquelet手术用于有较大的中间缺损(例如长骨的一段缺失)的长骨创伤应用中。Masquelet手术通常包括两个阶段：第一阶段，其中放置垫片，在垫片周围形成软组织，第二阶段，其中使用形成的软组织覆盖骨移植物。因此，在一些实施方案中，本发明的人造骨膜可用于长骨节段性缺损的创伤修复。例如，可以提供相对大的覆盖物，其中提供适合于创伤修复的物质，其中所述人造骨膜用于在长骨中保持空间(排除软组织)并具有软组织在其周围形成。可以避免Masquelet手术的第二步，因为在最初放置人造骨膜时提供了移植材料。

另一个理想的实施方案包括接种在本发明的人造骨膜上或沉积在本发明的人造骨膜上的细胞。可以使用任何细胞，但是显然优选通常与促进骨和骨相关组织生长有关的细胞。一些优选的实例包括但不限于干细胞、定型干细胞和分化的细胞，包括骨髓干细胞。在各种实施方案中使用的细胞的其他实例包括但不限于成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞和结缔组织细胞。

将理解，还提供了本发明的人造骨膜用于这样的治疗方法。

将理解的是，还提供了功能化的含胶原膜和药物-载体混合物在制造用于这样的治疗方法的人造骨膜中的用途。

术语的定义

短语“治疗有效量”是指化合物以适用于任何医学治疗的合理受益/风险比治疗病症的足够的量。但是，可以理解，人造骨膜中化合物的总剂量可以由主治医师在合理的医学判断范围内确定。对于任何具体患者而言，具体的治疗有效剂量水平可以取决于多种因素，包括：正在治疗的病症和病症的严重性；所用具体化合物的活性；所用的具体人造骨膜；人造骨膜的药物释放速率；患者的年龄、体重、一般健康状况和既往病史、性别和饮食；递送方式；与所用的具体化合物组合或同时使用的药物以及医学领域众所周知的因素。可以改变药学人造骨膜中活性成分的实际剂量水平，以获得对于具体患者和具体给药方式有效实现所需治疗反应的活性化合物的量。

如本文所用，术语“骨修复药物”或“骨活性剂”是指能够刺激、促进、增强或诱导骨形成或抑制骨再吸收的试剂。因此，骨活性剂可以是合成代谢药物或抗分解代谢药物。骨活性剂可以执行以下一项或多项操作：促进骨重塑，激活成骨细胞，促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞，增加成骨细胞的数量和活性，增加平均壁厚，增强小梁骨体积，改善骨结构，改善小梁连接性，增加皮质厚度，抑制骨丢失，维持/改善骨强度，增加总骨体积或类骨质的体积。骨活性剂包括但不限于：前列腺素E1(PGE1)；前列腺素E2(PGE2)；EP2受体激动剂；EP4受体激动剂；EP2受体/EP4受体双激动剂；有机双膦酸盐(例如，阿仑膦酸或阿仑膦酸钠)；组织蛋白酶K抑制剂；雌激素或雌激素受体调节剂；降钙素；破骨细胞质子ATP酶抑制剂；HMG-CoA还原酶抑制剂(即他汀类)；αvβ-整联蛋白受体拮抗剂；RANKL抑制剂，例如地诺单抗(denosumab)；骨合成代谢剂，例如甲状旁腺激素；骨形态发生蛋白(例如BMP-2、BMP-4、BMP-7)；维生素D或合成的维生素D类似物，例如ED-70；雄激素或雄激素受体调节剂；Wnt/β-连环蛋白信号传导激活剂(例如GSK-3抑制剂、骨硬化蛋白拮抗剂、SOST抑制剂)；硼替佐米；雷尼酸锶(strontium ranelate)；血小板衍生的生长因子；其药学上可接受的盐；及其混合物。当暴露于约4-5的pH下时，骨活性剂优选不降解成无活性形式。

如本文所用，术语“磷酸钙水泥”是指，包括磷酸二钙、磷酸三钙(例如，α-磷酸三钙和β-磷酸三钙)或磷酸四钙的骨修复组合物，或是指由前述物质中的任一种或它们的混合物通过固化而制成的骨修复组合物。磷酸钙水泥还可以包括与磷酸钙化合物一起掺入的羟磷灰石。

本文所用的术语“药物-载体混合物”是指掺入钙载体组分中的治疗剂的混合物。

如本文所用，术语“激动剂”是指，生物学作用是模仿天然激动剂的作用的化合物。激动剂可具有全部功效(即，等同于天然激动剂)、部分功效(与天然激动剂相比具有较低的最大功效)或超最大功效(与天然激动剂相比具有更高的最大功效)。具有部分功效的激动剂称为“部分激动剂”。具有超最大功效的激动剂称为“超级激动剂”。在一实施方案中，天然激动剂可以是PGE 2。

可以从人造骨膜中释放的止痛剂种类包括钠通道阻滞剂(例如Nav 1.8抑制剂、Nav1.9抑制剂、罗哌卡因、布比卡因等)、TRPV1拮抗剂、内皮素拮抗剂(例如阿曲生坦、齐泊腾坦(zibotentan))、缓激肽拮抗剂、ASIC抑制剂、TrkA抑制剂和放射性核素(⁸⁹Sr、¹⁵³Sm-lexidronam(来昔决南钐)、¹⁸⁶Re-etetronate)。

可以从人造骨膜释放的抗炎药的种类包括NSAIDS，皮质类固醇和细胞因子抑制剂(例如TNF-α、IL-1β等的抑制剂)。

可以从人造骨膜释放的抗菌剂的种类包括抗细菌剂和抗真菌剂。抗细菌剂包括众所周知的药剂，例如头孢烯类、头孢菌素、喹诺酮类抗生素(例如环丙沙星、左氧氟沙星等)、大环内酯类(例如阿奇霉素、克拉霉素、红霉素等)。抗真菌剂包括氟康唑、克霉唑、伊曲康唑等。

可以从人造骨膜中释放的抗癌药的类别包括长春新碱、阿霉素、依托泊苷、吉西他滨、甲氨蝶呤，Saad在Cancer Treat Rev.2010,36(2)177-84中描述的SRC激酶抑制剂(例如达沙替尼(dasatinib)、萨拉卡替尼(saracatinib)、博舒替尼(bosutinib))。

骨活性剂可以是前列腺素E1、前列腺素E2、雷尼酸锶、降钙素、甲状旁腺激素、维生素D或合成的维生素D类似物(例如ED-70)、BMP-2、BMP-4、BMP-7或血小板衍生的生长因子。

骨活性剂也可以是有机双膦酸盐。有机双膦酸盐包括，例如，阿仑膦酸、阿仑膦酸钠、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐、唑来膦酸盐、唑来膦酸、依替膦酸盐、帕米膦酸盐、替鲁膦酸盐(tiludronate)、奈立膦酸盐(neridronate)和奥帕膦酸盐(olpadronate)。

骨活性剂也可以是组织蛋白酶K抑制剂，包括例如Bromme在ExpertOpin.Investig.Drugs 2009,18(5)585-600中公开和引用的化合物(例如，奥当卡替(odanacatib))。

骨活性剂可以是雌激素或雌激素受体调节剂，包括例如雷洛昔芬、巴多昔芬和拉索昔芬，包括在http://en.wikipedia.org/wiki/Selective_estrogen-receptor_modulator中描述的化合物。

骨活性剂可以是雄激素或雄激素受体调节剂，包括例如睾酮。

骨活性剂可以是破骨细胞质子ATP酶的抑制剂，包括例如Nyman在Potential ofthe Osteoclast's Proton Pump as a Drug Target in Osteoporosis(破骨细胞的质子泵作为骨质疏松症的药物靶标的可能性),Annales Universitatis Turkuensis 2011中描述的化合物，例如SB242784、巴佛洛霉素(bafilomycin)(例如巴佛洛霉素A1)、刀豆霉素A、阿布特罗(apicularen)、阿卡唑利德(archazolide)、苯并内酯酰胺(水杨酰卤酰胺A(salicylihalamide A)、洛巴胺A(lobatamide A))、FR167356、FR177995和山荷叶素(diphyllin)。

骨活性剂可以是HMG-CoA还原酶的抑制剂(即他汀类)，包括例如在http://en.wikipedia.org/wiki/Statin中所述的那些，例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

骨活性剂可以是αvβ-整联蛋白受体拮抗剂，包括例如Millard等人在IntegrinTargeted Therapeutics,Theranostics 2011,154-188中描述的化合物，例如西仑吉肽(cilengitide)(EMD 121974)、L000845704、SB2730005。

骨活性剂可以是RANKL抑制剂，例如地诺单抗。

骨活性剂可以是EP2受体激动剂，例如ONO-AE1-259-01和CP-533536。

骨活性剂可以是EP2受体/EP4受体双激动剂，例如在以下文献中所述的双激动剂：Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2012,22(1),396-401、U.S.专利号7,402,605以及U.S.专利号7,608,637。示例性的EP2受体/EP4受体双激动剂是2-((2-((R)-2-((S,E)-3-羟基-4-(间甲苯基)丁烯-1-基)-5-氧代吡咯烷-1-基)乙基)硫)噻唑-4-羧酸(CAS#494223-86-8)。

骨活性剂可以是EP4受体激动剂，包括但不限于下述文献描述的化合物：U.S.专利号6,043,275,6,462,081,6,737,437,7,169,807,7,276,531,7,402,605,7,419,999,7,608,637；WO 2002/024647；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2001,11(15),2029-2031；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2002,10(4),989-1008；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2002,10(6),1743-759；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2002,10(7),213-2110)；Journal of MedicinalChemistry,2004,47(25),6124-6127；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2005,15(10),2523-2526；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2003,13(6),1129-1132；Medicinal Chemistry Letters,2006,16(7),1799-1802；Bioorganic&MedicinalChemistry Letters,2004,14(7),1655-1659；Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters,2003,13(6),1129-1132；Journal of Medicinal Chemistry,1977,20(10),1292-1299；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2008,18(2),821-824；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2007,17(15),4323-4327；Bioorganic&MedicinalChemistry Letters,2006,16(7),1799-1802；Tetrahedron Letters,2010,51(11),1451-1454；Osteoporosis International,2007,18(3),351-362；Journal of Bone andMineral Research,2007,22(6),877-888；Heterocycles,2004,64,437-445。

具体的EP4受体激动剂包括但不限于CP-734432、ONO-4819(即利文前列素(rivenprost))、AE1-329、L-902,688。

在一些实施方案中，包括在人造骨膜中的骨活性剂是以下中的一种或多种：阿仑膦酸、阿仑膦酸钠、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐、唑来膦酸盐、唑来膦酸、依替膦酸盐、帕米膦酸盐、替鲁膦酸盐、奈立膦酸盐和奥帕膦酸盐、奥当卡替、雷洛昔芬、巴多昔芬、拉索昔芬(lasofoxifene)、阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、雷尼酸锶、降钙素、甲状旁腺激素或骨形态发生蛋白-2。

在其他实施方案中，包括在人造骨膜中的骨活性剂是以下一种或多种：EP2受体激动剂、EP2受体/EP4受体双激动剂、EP4受体激动剂、有机双膦酸盐、雌激素受体调节剂、HMG-CoA还原酶抑制剂和雷尼酸锶。

本发明还提供了人造骨膜，其包含本文所述任何剂、药物或药物类别的组合。例如，可以将激活成骨细胞的一种或多种剂/药物与抑制破骨细胞的一种或多种剂/药物组合。

或者，可以组合激活成骨细胞或抑制破骨细胞的多种剂/药物。

在一些实施方案中，人造骨膜可包括EP4受体激动剂和以下中的一种或多种：双膦酸盐；组织蛋白酶K抑制剂；雌激素或雌激素受体调节剂；降钙素；破骨细胞质子ATP酶抑制剂；HMG-CoA还原酶抑制剂(即他汀类)；αvβ3-整联蛋白受体拮抗剂；RANKL抑制剂，例如地诺单抗；骨合成代谢剂，如甲状旁腺激素；骨形态发生蛋白(例如BMP-2、BMP-4、BMP-7)；维生素D或合成的维生素D类似物，例如ED-70；雄激素或雄激素受体调节剂；Wnt/β-连环蛋白信号传导激活剂(例如GSK-3抑制剂、骨硬化蛋白拮抗剂、SOST抑制剂)；硼替佐米；雷尼酸锶；血小板衍生的生长因子。

在一些实施方案中，例如，EP4受体激动剂与一种或多种选自以下的双膦酸盐组合：阿仑膦酸、阿仑膦酸钠、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐、唑来膦酸盐、唑来膦酸、依替膦酸盐、帕米膦酸盐、替鲁膦酸盐、奈立膦酸盐和奥帕膦酸盐。

在其他实施方案中，将EP4受体激动剂与雷洛昔芬、巴多昔芬和拉索昔芬中的一种或多种组合。

在其他实施方案中，将EP4受体激动剂与骨形态发生蛋白例如BMP-2、BMP-4或BMP-7组合。例如，一种组合包括CP-734432和BMP-2或BMP-7。另一种组合包括ONO-4819(利文前列素)和BMP-2或BMP-7。又一组合包括AE1-329和BMP-2或BMP-7。又一组合包括L-902,688和BMP-2或BMP-7。另一组合包括7-((R)-3,3-二氟-5-((3S,4S,E)-3-羟基-4-甲基壬-1-烯-6-炔-1-基)-2-氧代吡咯烷-1-基)庚酸和BMP-2或BMP-7。另一组合包括7-((R)-2-((3S,4S,E)-3-羟基-4-甲基壬-1-烯-6-炔-1-基)-5-氧代吡咯烷-1-基)庚酸和BMP-2或BMP-7。

还在其他实施方案中，将EP4受体激动剂与他汀类联合，例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。

本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开均通过引用整体并入本文，包括所有附图和表格，引入程度为它们不与本说明书的明确教导相抵触。

应当理解，如果在本文中引用了任何现有技术公开，则该引用并不意味着承认该公开构成了澳大利亚或任何其他国家的本领域公知常识的一部分。

以下是说明实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应解释为是限制性的。

实施例

实施例1–体内研究

在第一项研究中，我们使用了Horstmann等人先前描述的胫骨缺损模型。简而言之，通过对皮质以及下面的干骺端骨(metaphyseal bone)钻孔，在Sprague-Dawley雄性大鼠的近端胫骨产生了4.5mm的缺损。图2示出了胫骨缺损模型外科手术的一个实例。使用明胶-硫酸钙-羟基磷灰石支架填充缺损，作为有或没有ZA和rhBMP-2的松质骨腔中可用的骨空隙填充剂之一。如Raina et al.(2018),J Control Release,Vol.272所述。这样做是为上覆含胶原膜提供支撑，否则其将难以放置。在某些组中，支架还覆盖有一片6mm的胶原膜，并将剩余的膜插入到骨内膜中。膜以此方式防止了支架泄漏到圆形缺损的外部。表1给出了组和不同生物活性分子剂量的详尽描述。

表1：胫骨缺损研究的组、剂量和样品量。

S＝明胶-硫酸钙-羟基磷灰石支架，ZA＝唑来膦酸，CM＝胶原膜，BMP-2＝骨形态发生蛋白-2

手术后8周将动物处死，并进行定量显微CT和代表性组织学，以评估缺损愈合。

在第二项研究中，在先前由Raina等人描述的腹肌袋模型中分析了单独的胶原膜(4mm圆形片)或在膜的每个侧面上用1mg羟基磷灰石纳米颗粒功能化的胶原膜，并使用了以下组：

1.单独的胶原膜(CM)，

2.CM+羟基磷灰石纳米颗粒(nHA)，

3.CM+rhBMP-2(10μg)，

4.CM+nHA+rhBMP-2(10μg)，

5.CM+rhBMP-2(10μg)+ZA(10μg)，

6.CM+nHA+rhBMP-2(10μg)+ZA(10μg)。

使用了总计n＝5只/组，并且在手术后4周处死动物，随后进行X射线摄影和显微CT定量。

结果

研究1：显微CT

感兴趣的区域1(ROI 1)：对于显微CT分析，我们定义了3个ROI。ROI 1测量了除皮质以外的缺损孔内矿化体积(MV)/组织体积(TV)％。ROI1的直径是动态的，因此在顶部经测量为4.5mm，在底部的缩小为1.5mm。ROI 1的深度为2mm。显微CT测量结果显示，与空白组相比，所有支架和膜处理组，无论生物活性分子如何，均再生了显著更高的矿化组织体积或MV/TV％(图3，上图)。

感兴趣的区域2(ROI 2)：为了评估皮质愈合，我们使用了来自ROI 2的测量结果。ROI 2由4.5mm的圆形ROI组成，该圆形ROI从旧皮质的底部向上延伸。因此，我们测量了先前在手术过程中取出的再生皮质区域中再生的骨。与组即空白组(第1组)或仅支架组(第2组)相比，S+ZA+rhBMP-2+(CM)(第6组)和S+ZA+(CM+rhBMP-2)组(第7组)的皮质矿化体积(MV)明显更高。(有关p值，请参阅图3，中间。)

图3显示了术后8周胫骨缺损研究的显微CT定量结果。上图的*表示各个组与空白组的比较。中间图的*表示与S+ZA+(CM+rhBMP-2)组相比，所有组的p值。δ表示S+ZA+rhBMP-2+(CM+rhBMP-2)与所有其他组的比较。最下面的组中的*表示各个组与空白组的比较，而δ表示各个组与仅支架组的比较。*或δ表示p<0.05，**或δδ表示p<0.01，***或δδδ表p<0.001。

感兴趣的区域3(ROI 3)：最后一个ROI即ROI 3用于测量完整缺损以及缺损近端和远端的骨。这不仅提供了在缺损区域再生的骨的量度，而且还提供了对在植入的支架和膜周围再生的矿化组织的体积的洞察。ROI 3的高度为6.5mm，覆盖4.5mm的缺陷以及1mm的近端缺损区域和1mm远端缺损区域。结果(图3底部)表明，与第1组相比，第3-8组的MV明显更高。此外，与第2组相比，第4、5、6和8组的MV也明显更高。在第1组和第2组之间或在第3-8组中的任何一组之间均未观察到显著差异。

研究1：通过显微CT进行皮质愈合

图4显示了使用显微CT对皮质愈合进行的评估。白色箭头指向缺损的皮质位置和皮质再生的程度(仅用于表示的图像)。

空白组中的几乎所有样品都在皮质侧愈合，缺损部位具有薄的皮质骨。在缺损内几乎看不到骨形成或没有骨形成。仅支架治疗组(2-4)在缺损内具有不同程度的骨形成，但未导致皮质再生。在第5组和第6组中，沿膜表面可以看到白色的放射致密边缘，这也证实了膜的骨内膜放置。所有经膜治疗组(5-8)都将支架限制在缺损内。第组7(5/10)和第8组(7/10)显著改善了皮质桥接，并且是在用支架或膜治疗的组中仅有的皮质桥接最大的组。有关更多详细信息，请参见图4。

在图5中，左侧的图像提供了缺陷愈合的低倍放大概况，而右侧的图像提供了皮质愈合的高倍放大视图。框表示皮质缺损的程度，黑色箭头大约位于皮质缺损的中间。

显微CT成像充分证实了组织学结果。空白组显示薄但已愈合皮质，并在干骺端区浸润了骨髓组织。第2组即支架在支架的外围显示出一些骨形成，但是没有皮质愈合。第3-6组显示缺损周围有大量新的小梁骨和在支架孔内形成的一些骨。然而，仅观察到一些皮质骨再生。代表性的组织学图像显示了第7和第8组中的皮质桥接。与第3-6组相似，在支架外围，缺陷内充满了小梁骨，但在支架内形成的骨有限。

研究2：X射线摄影

图6所示的射线照片表明，与单独的含胶原膜相比，向具有或不具有羟基磷灰石的含胶原膜中添加rhBMP-2，导致样本的放射密度增加。在具有或不具有nHA的情况下，向含胶原膜中添加ZA和rhBMP-2显著增加了标本的放射密度。

结论

第2项研究通过在腹肌袋模型中诱导骨证明了含胶原膜的真正载体性能。不论是否存在nHA，rhBMP 2和rhBMP-2+ZA的递送均诱导不同程度的骨形成，并且rhBMP-2和ZA的共递送诱导的骨高于rhBMP-2组。当使用胶原膜递送rhBMP-2和ZA时，向胶原膜中添加nHA进一步增加了胶原膜的骨形成潜力。当仅添加rhBMP-2时，没有观察到这种效果。

第1项研究通过引导的组织再生现象阐明了膜在皮质层愈合中的真正潜力。除空白组外，第2-4组未能显示出完全的皮质再生。在第5-8组中，在支架的顶部上添加膜防止了支架被迫脱离缺损并阻断皮质再生。这项研究还表明，通过含胶原膜递送超低剂量的rhBMP-2可以显著增强皮质再生，如在第7组和第8组中所观察到的。因此，用低剂量的rhBMP-2功能化的膜可用于在高要求的整形外科的情形下再生骨。

实施例2-功能化的含胶原膜

如以上说明书中所讨论的，本发明的人造骨膜，即本文所述包含羟基磷灰石功能化的含胶原膜的人造骨膜，可以用作容纳装置，来保护填充在骨空隙中的生物材料不泄漏到皮质骨中。我们认为，当将生物材料(陶瓷或高分子材料)放置在骨缺损中时，它倾向于被推到骨外部，这很可能是由于骨内积聚的静水压力所致。这种现象很可能导致皮质骨愈合受损。然而，当使用本发明的人造骨膜，特别是在骨内膜使用，来覆盖置于骨空隙中即在皮质骨内端(内膜)之下的生物材料时，它防止了生物材料被推出到皮质骨中。我们认为,人造骨膜的骨内膜放置尽管不是必需的,但很重要,因为它在整个实验过程中为人造骨膜提供了牢固的抓握，从而覆盖植入的材料。

图7示出了本发明的人造骨膜作为放置在骨空隙内的陶瓷或聚合物生物材料的容纳装置的作用。虚线表示皮质骨的内外边缘。左上方和右上方的箭头分别表示陶瓷生物材料和聚合物生物材料，突出并位于皮质末端之间，如下方虚线所示。底部左侧面板中的底部箭头指示陶瓷材料泄漏到骨的皮质位置，而上方箭头指示被骨膜放置地胶原膜的矿化。底部右侧的箭头指向覆盖置于骨缺损中的聚合物支架的人造骨膜。请注意，膜已矿化到一定程度，并且还确保该材料始终保留在皮质骨下，而不是在皮质末端之间。所有图像均为在体内治疗8周后拍摄的代表性显微CT切片。

当然，人造骨膜的另一个作用是充当桥梁并通过引导组织再生来再生皮质骨(参见图4)。进行的实验已经表明，当骨膜放置该膜时，由于它不能牢固地覆盖缺损孔，因此它会被从皮质上推起并趋于在上覆肌肉中矿化。但是，在具有或不具有rhBMP-2的情况下，将膜进行骨内膜放置已显示出在骨空隙中容纳生物材料以及骨皮质再生两者(在膜上使用小剂量rhBMP-2时更是如此)。

实施例3-比较研究

我们使用了公开的腹肌袋模型(Raina et al.(2018),J.Control Release,Volume 272 Pages 83-96)来比较商业可得的ACS胶原海绵(Medtronic)(具BMP-2和ZA)与本发明功能化的含胶原膜进行比较。

我们从ACS组中获取了显微CT数据，并将其与肌肉袋中人造骨膜的数据进行比较。

两项研究都是在腹肌袋模型中用相同剂量的rhBMP-2(10微克/支架)和ZA(10微克/支架)完成的。虽然由于在两个不同的时间点进行了实验并且无法进行显微CT体模校准，所以不能完全直接比较这些数据，但我们确实注意到使用了相同的显微CT设置，并且像素大小相同(10微米)。此外，X射线是在相同的设置下拍摄的，因此它们也显示出差异。

我们发现人造骨膜在骨形成方面优于ACS组(图8)。

结论性陈述

鉴于以上所述，本发明相对于现有技术具有许多优点，例如：

·易于使用，避免对获得适当大小和形状的骨移植物的需要、移植部位发病以及与周围组织的组织整合；和

·提供了替代的骨修复方法，尤其是开发了也可用于在延长的时期内局部递送像BMP-2的骨活性剂，以促进骨生长和修复骨缺损的人造骨膜。

在本说明书和权利要求书中(如果有的话)，词语“包括/含(comprising)”及其衍生词，包括“包括/含(comprises)”和“包括/含(comprise)”，均包括每个所述整体，但不排除包括一个或多个其他整体。

在整个说明书中，提到“一个实施方案”或“实施方案”，是指结合该实施方案描述的具体特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中各处出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”，不一定都指的是同一个实施方案。此外，可以以任何合适的方式，以一种或多种组合来组合具体的特征、结构或特性。

将理解的是，本发明并不限于所示或所述的具体特征，因为本文所述的手段包括使本发明生效的优选形式。因此，能够以其任何形式或改变来要求保护本发明。