一种交联复合胶原支架及其制备方法
阅读说明：本技术 一种交联复合胶原支架及其制备方法 (Cross-linked composite collagen scaffold and preparation method thereof ) 是由 白新鹏 王国锭 于 2021-01-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种交联复合胶原支架及其制备方法,通过将猪脱细胞真皮外基质与牛I型胶原交联来制备复合胶原支架。与传统的胶原蛋白支架相比,此支架具有均匀的多孔结构,高孔隙率,强吸水能力和强持水能力,同时,它具有良好的抗拉伸强度和热稳定性,可以更好地满足伤口敷料的需求。生物相容性结果表明,该复合胶原支架没有细胞毒性,适合细胞粘附和增殖。它是一种更好的胶原蛋白复合支架,能够代替传统的胶原蛋白支架。(The invention provides a cross-linked composite collagen scaffold and a preparation method thereof. Compared with the traditional collagen scaffold, the scaffold has the advantages of uniform porous structure, high porosity, strong water absorption capacity and strong water holding capacity, and meanwhile, the scaffold has good tensile strength and thermal stability and can better meet the requirements of wound dressings. The biocompatibility result shows that the composite collagen scaffold has no cytotoxicity and is suitable for cell adhesion and proliferation. The collagen composite scaffold is a better collagen composite scaffold and can replace the traditional collagen scaffold.)
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种交联复合胶原支架及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是一种结构蛋白，可为骨骼，软骨，皮肤和组织提供机械强度，同时支持器官并在细胞分化，细胞迁移和结缔组织修复中发挥重要作用。胶原蛋白由于其天然的低毒性，低抗原性和低免疫性，抑制上皮组织细胞迁移，指导细胞再生并具有良好的组织相容性而被广泛用于生物医学材料和临床医学。由于胶原蛋白的许多优良特性，它也被广泛用于医药，化妆品，食品和其他领域。迄今为止，已有28种不同类型的胶原蛋白被遗传学报道，其中I型胶原蛋白占人体总蛋白质含量的90％以上。根据目前的文献，上述制剂中使用的市售胶原蛋白是牛I型胶原蛋白，而其他类型的胶原蛋白仅在实验研究中制备，由于价格昂贵，不适合大规模生产。
与其他传统生物材料相比，I型胶原蛋白具有良好的生物学特性以及良好的材料特性，包括粘附性和纤维不透性，吸水性和相对较高的孔隙率。高孔隙率可以为新的组织形成提供空间，并且胶原纤维可以整合到新的组织基质中。当前，各种形式的胶原蛋白被用于生物材料中。商业化的胶原蛋白溶液可用于制备各种凝胶，膜和支架，用于组织工程，作为药物控制释放载体并用于伤口修复和愈合。
当前市场上的商用胶原蛋白敷料通常使用牛组织制备。可以通过将含有0.5～5w/v％干物质的溶液冷冻干燥来制备胶原蛋白海绵支架。通过调节冷冻干燥条件可以控制不同的结构。胶原蛋白敷料刺激细胞迁移并促进新组织的发展，并可以促进新形成的胶原蛋白的沉积和组织，从而创造一种通过激活伤口成纤维细胞的趋化特性促进伤口愈合的环境。然而，传统的牛I型胶原蛋白敷料仍具有一些缺点，例如差的热稳定性和差的机械性能。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种交联复合胶原支架及其制备方法，通过将猪脱细胞真皮外基质与牛I型胶原交联来制备复合胶原支架。与传统的胶原蛋白支架相比，它具有良好的拉伸强度和热稳定性，可以更好地满足伤口敷料支架的需求。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种交联复合胶原支架，通过猪皮脱细胞外基质与牛I型胶原交联制备而成。
优选地，猪皮脱细胞外基质与牛I型胶原的重量比为1:6～1:10。
优选地，交联剂为戊二醛，工作浓度为0.2％～0.3％。
优选地，交联温度为37℃，交联时间为0.5h～1h。
本发明还提供了一种交联复合胶原支架的制备方法，包括将猪皮脱细胞外基质与牛I型胶原交联制备复合胶原支架。
进一步地，包括：将牛I型胶原蛋白溶解在乙酸溶液中，并添加猪皮脱细胞外基质，在37℃的环境下与戊二醛交联0.5～1小时后，用去离子水冲洗。
优选地，牛I型胶原蛋白与乙酸溶液的重量体积比(g/mL)为3：100，猪皮脱细胞外基质与牛I型胶原的重量比为1：6～1:10。
优选地，戊二醛的工作浓度为0.2％～0.3％。
优选地，猪皮脱细胞外基质通过以下方法制备：
1)去除猪皮肤的表皮和皮下脂肪以获得真皮；
2)用TritonX-100和氢氧化钠制备脱细胞溶液，并将猪真皮放入反应器中并搅拌1小时，1小时换液一次，共换液6次；
3)将获得的样品放入冻干机中干燥，并灭菌。
优选地，步骤2)中，猪真皮原料与脱细胞液的料液比(g/mL)为10：1。
更优选地，步骤2)脱细胞溶液中，氢氧化钠的重量百分比为2％，TritonX-100的重量百分比为1％。
本发明的有益效果如下：
本发明设计并研究了一种新型的交联复合胶原支架，有益于当前解决大量猪皮被浪费的现状，并提高现有胶原敷料支架的性能。结果表明，此支架具有均匀的多孔结构，高孔隙率，强吸水能力和强持水能力。与传统的胶原蛋白敷料相比，它具有良好的拉伸强度和热稳定性，可以更好地满足伤口敷料的需求。生物相容性结果表明，该复合胶原支架没有细胞毒性，适合细胞粘附和增殖。它是一种更好的胶原蛋白复合支架，能够代替传统的胶原蛋白敷料支架。
附图说明
图1是本发明实施例制备的交联复合胶原支架的扫描显微镜视图，a，b，c分别为传统胶原蛋白敷料的不同倍镜观察结果。d，e，f分别为交联复合胶原支架的不同倍镜观察结果。
图2是本发明的吸水性测试结果，COL为传统胶原敷料支架的缩写，CCS为新型交联复合胶原支架的缩写。标示的a，b为显著性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，如未有特殊说明，以下采用的材料和方法均为本领域常规选择及常规技术手段。
实施例1
(一)猪皮脱细胞外基质制备过程
1.分离表皮与真皮，即去除猪皮肤的表皮和皮下脂肪，获得真皮。
2.用TritonX-100和氢氧化钠制备脱细胞溶液，并将猪真皮放入反应釜中搅拌1小时，温度为37℃，1小时换液一次，共换液6次。
该步骤中，氢氧化钠在脱细胞溶液中的重量百分比(wt/wt)为2％，TritonX-100在脱细胞溶液中的重量百分比(wt/wt)为1％，猪真皮原料与脱细胞液的料液比为10：1。
3.冻干机中干燥24h、并灭菌保存。
实施例2和3中亦采用该方法制备的猪皮脱细胞外基质。
(二)交联复合支架的制备过程
1.将3g牛I型胶原用100ml乙酸(0.5mol/L)溶解，将0.5g猪皮脱细胞外基质粉碎后放入。
2.在37℃的环境下与戊二醛(工作浓度为0.2％)交联0.5小时。
戊二醛(GTA)是一种同源的双功能交联剂，它与两个相同的或不同的分子的两个-CHO基团和两个伯氨基形成席夫碱，并通过一个五碳桥连接两个分子。高浓度的GTA与胶原分子赖氨酸或羟赖氨酸残基E2氨基反应，形成分子间交联。低浓度的GTA和胶原分子形成分子内交联。与未交联的胶原膜相比，GTA交联的胶原膜具有较高的应变模量，并且抗胶原酶降解的能力得到了显著提高。
3.交联完成后，用去离子水冲洗。
4.冻干机中干燥、灭菌、保存。
最终获得的交联复合胶原支架的扫描显微镜视图如图1所示。新型交联复合胶原支架具有三维多孔结构，孔径相对均匀，具有良好的连通性。良好的孔隙率和连通性有利于水蒸气的传输和药物输送，因此，本支架材料可以作为给药载体，以促进伤口的恢复。
实施例2
1.将4g牛I型胶原用100ml乙酸(0.5mol/L)溶解，将0.5g猪皮脱细胞外基质粉碎后放入。
2.在37℃的环境下与戊二醛(工作浓度为0.25％)交联1小时。
3.交联完成后，用去离子水冲洗。
4.冻干机中干燥、灭菌、保存。
最终获得的交联复合胶原支架，结构特征与实施例1一致。
实施例3
1.将3g牛I型胶原用100ml乙酸(0.5mol/L)溶解，将0.3g猪皮脱细胞外基质粉碎后放入。
2.在37℃的环境下与戊二醛(工作浓度为0.3％)交联45分钟。
3.交联完成后，用去离子水冲洗。
4.冻干机中干燥、灭菌、保存。
最终获得的交联复合胶原支架，结构特征与实施例1一致。
以下以实施例1为例，通过测试例将实施例1中制备的交联复合胶原支架与牛I型胶原的机械性能，水蒸气透过率(WVTR)，吸水率进行比较。此外，通过细胞毒性和增殖实验进行了生物学评估。
测试例(一)力学性能检测
力学性能是支架材料的重要特征之一。拉伸强度是在拉伸下抵抗断裂的能力。
利用质构仪，使用50mm×10mm的样品测试支架的拉伸强度。将两端夹紧并悬挂在通用测试机的测试头的两端。在1mm/min的拉伸速率下测量支架的拉伸强度，并观察记录仪上的拉伸曲线，直到材料破裂为止。每组材料平行测试三个样品，结果表示为平均值±SD。
胶原支架的抗拉伸强度试验表明，传统胶原支架的抗拉伸强度为1.56±0.08MPa，而新型交联复合胶原支架的抗拉伸强度为2.76±0.06MPa，在统计学上显着高于传统的胶原支架(P<0.05)。良好的拉伸强度有利于支架材料的进一步加工。
(二)水蒸气透过率和吸水率检测
水蒸气透过率(WVTR)：将干燥的胶原海绵支架放置在直径为18mm的圆柱形试管的喷嘴中，其中装有10mL蒸馏水，将试管置于37℃的恒温培养箱中，相对湿度为35％。计算公式为：
其中A是海绵的面积(m2)，S是失重相对于时间的斜率(g/h)
结果：传统胶原支架的WVTR为859.53g/m2·day，而新型交联复合胶原支架的WVTR为942.75g/m2·day。
吸水率(U)：在室温下，将这两个支架在磷酸盐缓冲液中浸泡至少30分钟以实现完全吸收，将其取回，用滤纸擦拭以轻轻吸收表面水分，然后称重。计算公式为：
其中，m1是干海绵的重量，m2是溶胀海绵的重量。
结果：根据图2显示，传统胶原支架的吸水量为28.6±0.57，新型交联复合胶原支架的吸水量为31.3±1.0，即，新型交联复合支架的吸水性能显著高于传统胶原敷料支架。
(三)孔隙率检测
将合适的指定体积的乙醇(V1)放入两个量筒中，将2×2cm胶原海绵浸没。测量随后的乙醇体积(V2)。5分钟后，取回样品并测量剩余乙醇(V3)的体积。然后，使用以下公式获得两组胶原海绵的孔隙率。
P＝(V1-V3)/(V2-V3)×100％
经测试，传统胶原支架的孔隙率为60.3±2.0％，新型交联复合胶原支架的孔隙率为65.6±1.2％，差异具有统计学意义(P<0.05)。较高的孔隙率允许将支架用作载体以促进营养物交换以及细胞生长和代谢。
(四)细胞毒性评估
小鼠成纤维细胞L929细胞用于细胞毒性评估。L929细胞维持在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Gibco)中，该培养基中添加了10％(v/v)的胎牛血清和1％(v/v)的青霉素/链霉素抗生素。将胶原海绵支架切成1×1cm的块。样品和培养液的比例为1mg/mL。对数生长期的细胞被酶解并配制成浓度为105个细胞/mL的细胞悬液。对于每组材料，将100μL细胞悬浮液的等分试样添加到三个平行孔中的96孔板的每个孔中。将细胞在DMEM中培养24小时，然后吸出培养液并用无菌溶液代替。在恒温培养箱中孵育24小时后，将10μLCCk-8试剂添加到每个孔中，并在恒温培养箱中再孵育3小时。使用微孔板读取器检测每个孔在450nm处的吸光度。使用以下公式计算细胞活力：
其中，As是实验孔(含有细胞的细胞，CCK-8，有毒物质)的吸光度，Ac是对照孔(含有细胞的细胞，CCK-8，无毒物质)的吸光度，Ab是空白孔(无细胞的培养基和有毒物质的培养基，含有CCK-8)。
培养L929细胞于支架浸提液中进行酶标仪检测，最终测得细胞存活率大于80％，即支架材料无毒性。
实施例2和3制备的复合胶原支架测试效果与实施例1的测试例基本一致，无明显差异，在此不做赘述。
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