阅读说明：本技术 一种适合噬菌体渗入块茎作物用的辅助渗透剂及其制备方法和应用 (Auxiliary penetrating agent suitable for bacteriophage to penetrate into tuber crops and preparation method and application thereof ) 是由 于浩 徐旭凌 乔欢 丛郁 许文建 徐天舜 李涛 于 2021-01-28 设计创作，主要内容包括：本申请涉及噬菌体生物农药技术领域,具体涉及一种适合噬菌体渗入块茎作物用的辅助渗透剂,以及该噬菌体辅助渗透剂的制备方法和应用方法。本申请所述的辅助渗透剂成分包括曲拉通、脂肪醇聚氧乙烯醚、珀酸二辛酯磺酸钠、噻酮、硬脂酸钙和甘露醇。本申请的辅助渗透剂组分合理,物料易于获取,生产成本低,对人体无害。本申请的辅助渗透剂可以在块茎作物浸泡处理时增加噬菌体进入块茎的数量,提高噬菌体的利用效率,增强噬菌体对植物细菌性病害的防治效果。(The application relates to the technical field of phage biopesticides, in particular to an auxiliary penetrating agent suitable for phage to penetrate tuber crops, and a preparation method and an application method of the phage auxiliary penetrating agent. The auxiliary penetrant ingredient includes triton, fatty alcohol-polyoxyethylene ether, dioctyl sodium sulfosuccinate, thioxanthone, calcium stearate and mannitol. The auxiliary penetrating agent has reasonable components, easily obtained materials, low production cost and no harm to human bodies. The auxiliary penetrating agent can increase the number of the phage entering tubers during soaking treatment of tuber crops, improve the utilization efficiency of the phage and enhance the control effect of the phage on plant bacterial diseases.)

具体实施方式

以下实施例和实验例用于进一步阐述本申请，但不以任何的方式限制本申请的有效范 围。

除非另有定义，本申请使用的所有技术和科学术语的含义与本申请所属技术领域普通 技术人员通常理解的含义相同。通常，本申请使用的命名是本领域公知的或常用的，若未特 别指明，本申请实施例中所用的渗透剂试剂的各组分均可市售获得。

以下实例中，所涉及菌株代号均以本公司的命名方式编号。

以下实施例中，使用的试剂如下：

LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL。

LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸 馏水1000mL。

采用设备：0.22μm无菌过滤器(Millpore)；

无菌离心管(Eppendorf)。曲拉通为市购产品，纯度大于等于99.5％，分子式C₃₄H₆₂O₁₁，分 子量为646.86。

脂肪醇聚氧乙烯醚为市购产品，纯度大于等于99.0％，分子式C₁₂H₂₅O.(C₂H₄O)_n，分子量为1199.55。

琥珀酸二辛酯磺酸钠为市购产品，纯度大于等于99.0％，分子式C₂₀H₃₇O₇SNa，分子量为444.25。

噻酮为市购产品，纯度大于等于97.0％，分子式C₁₁H₁₃O₃SN，分子量为239.29。

硬脂酸钙为市购产品，纯度大于等于99.0％分子式C₃₆H₇₀CaO₄，分子量为607.01。

甘露醇为市购产品，纯度大于等于99.0％，分子式C₆H₁₄O₆，分子量为182.17。

茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(Ralstonia solanacearum phage GP1)、保藏编号为CCTCC NO:M 2016633，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日。

茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(Ralstonia solanacearum phage GP2)、保藏编号为CCTCC NO:M 2016634，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日。

茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)、保藏编号为CCTCC NO：M 2016635，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月10日。

地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)，保藏编号为 CCTCC NO:M 2018579，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年08月30日。

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae phage PSA-P1)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020252，保藏单位为中国典型培养物 保藏中心，保藏日期为2020年06月30日。

实施例1六种试剂不同浓度制剂的制备方法

准确称取曲拉通8g、10g、12g、14g和16g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后， 然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌15min，4℃储 存备用。

准确称取脂肪醇聚氧乙烯醚20g、21g、22g、23g和24g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌15min，4℃储存备用。

准确称取琥珀酸二辛酯磺酸钠10g、14g、18g、22g和24g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液 121℃灭菌15min，4℃储存备用。

准确称取噻酮10g、15g、20g、25g和30g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌15min， 4℃储存备用。

准确称取硬脂酸钙12g、15g、18g、21g和24g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌15min，4℃储存备用。

准确称取甘露醇40g、50g、60g、70g和80g，分别加入适量的去离子水搅拌至充分溶解后，然后再加入去离子水定容至1000mL；将所获得的五份1000mL溶液121℃灭菌15min， 4℃储存备用。

将1000mL去离子水121℃灭菌15min，作为空白对照，4℃储存备用。

实施例2噬菌体辅助渗透剂的制备

(1)适用于茄科雷尔氏菌噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：准确称取曲拉通12g、脂肪 醇聚氧乙烯醚22g、琥珀酸二辛酯磺酸钠14g、噻酮20g，硬脂酸钙21g、甘露醇70g，加入 适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃ 条件下灭菌15min，4℃储存备用。

(2)适用于地毯草黄单胞菌噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：准确称取曲拉通 10g、脂肪醇聚氧乙烯醚22g、琥珀酸二辛酯磺酸钠14g、噻酮25g，硬脂酸钙24g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃条件下灭菌15min，4℃储存备用。

(3)适用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体的辅助渗透剂的制备方法如下：准 确称取曲拉通12g、脂肪醇聚氧乙烯醚23g、琥珀酸二辛酯磺酸钠18g、噻酮20g，硬脂酸钙21g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃条件下灭菌15min，4℃储存备用。

(4)适用于噬菌体组合物的辅助渗透剂的制备方法如下：准确称取曲拉通12g、脂肪 醇聚氧乙烯醚22g、琥珀酸二辛酯磺酸钠14g、噻酮20g，硬脂酸钙21g、甘露醇70g，加入适量去离子水，升温到20～30℃，磁力搅拌至充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL；121℃ 条件下灭菌15min，4℃储存备用。

实施例3茄科雷尔氏菌噬菌体GP1溶液的制备

将保存的茄科雷尔氏菌单菌落接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，28℃下240rpm震荡 培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(Ralstonia solanacearum phage GP1，保藏编号CCTCC NO:M 2016633)100μL，28℃下240rpm震荡培 养18h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到茄科雷尔氏菌噬菌 体溶GP1液。

实施例4茄科雷尔氏菌噬菌体GP2溶液的制备

将保存的茄科雷尔氏菌单菌落接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，28℃下240rpm震荡 培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(Ralstonia solanacearum phage GP2，保藏编号CCTCC NO:M 2016634)100μL，28℃下240rpm震荡培 养18h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到茄科雷尔氏菌噬菌 体溶GP2液。

实施例5茄科雷尔氏菌噬菌体GP3溶液的制备

将保存的茄科雷尔氏菌单菌落接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，28℃下240rpm震荡 培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3，保藏编号CCTCC NO:M 2016635)100μL，28℃下240rpm震荡培 养18h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到茄科雷尔氏菌噬菌 体GP3溶液。

实施例6地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5溶液的制备

将噬菌体YHC5宿主菌接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，25℃下240rpm震荡培养至 OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonasaxonopodis phage YHC5，保藏编号为CCTCC NO:M 2018579)，25℃下240rpm震荡培养18h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5 溶液。

实施例7丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1溶液的制备

将噬菌体PSA-P1宿主菌接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，28℃下240rpm震荡培养 至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1 (Pseudomonas syringae pv.Actinidiae phage PSA-P1，保藏编号为CCTCC NO:M2020252)， 28℃下240rpm震荡培养18h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得 到丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1溶液。

实施例8具有辅助渗透剂的单种噬菌体制剂的制备

取实施例3～7中得到的三种茄科雷尔氏菌噬菌体溶液、地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5溶液及 丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1溶液，在无菌条件下，将实施例2中制备得到 的各噬菌体辅助渗透剂分别加入上述5种噬菌体溶液中。每种噬菌体与辅助渗透剂以体积比 9:1混合均匀。最后得到含有辅助渗透剂的茄科雷尔氏菌噬菌体GP1的制剂、茄科雷尔氏菌 噬菌体GP2的制剂、茄科雷尔氏菌噬菌体GP3的制剂、地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的制 剂和丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1的制剂。

实施例9噬菌体组合物的制备

取茄科雷尔氏菌噬菌体GP1(Ralstonia solanacearum phage GP1)，保藏编号CCTCC NO:M 2016633；茄科雷尔氏菌噬菌体GP2(Ralstonia solanacearum phage GP2)，保藏编号CCTCC NO:M 2016634；茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phageGP3)，保藏编号 CCTCC NO:M2016635；地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonasaxonopodis phage YHC5)，保藏编号CCTCC NO:M 2018579；丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1 (Pseudomonas syringae pv.Actinidiae phage PSA-P1)，保藏编号CCTCCNO:M 2020252，按 体积比1:1:1:1:1制成噬菌体组合物。

实施例10具有辅助渗透剂的噬菌体组合物制剂的制备

在无菌条件下，将实施例2制备的噬菌体组合物辅助渗透剂加入实施例9的噬菌体组合物中 并混合均匀，其中辅助渗透剂与噬菌体组合物的体积比为1:9，得到具有辅助渗透剂的噬菌体 组合物的制剂。

实验例1毒理试验

取实验小鼠40只，雌雄各半，适应性饲养三天后，随机分为四组：噬菌体组合物处理组(处 理1)、噬菌体渗透制剂处理组(处理2)、具有噬菌体渗透制剂的噬菌体组合物处理组(处理 3)、对照组，每组10只小鼠(雌雄各5只)。分别给予处理1计量为10¹⁰PFU/kg的噬菌体组 合物(实施例9制得)；给予处理3计量为10¹⁰PFU/kg的具有噬菌体渗透制剂的噬菌体组合 物(实施例10制得)；给予处理2等量的噬菌体渗透制剂的10倍稀释液(实施例2制得)；对照组给予等量生理盐水。连续给药15d后将实验鼠断颈处死，检查内脏情况。

实验结果显示，上述各处理均对小鼠日常行为没有影响，且解剖检查小鼠内脏未见异 常。说明噬菌体渗透制剂与噬菌体组合物均具有生物安全性，且二者混合后无生物毒性，可 应用于块茎植物浸泡。

实验例2六种试剂对茄科雷尔氏菌噬菌体GP1的辅助渗透效果检测

选取实施例1种制备的曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙， 甘露醇等试剂溶液的各5个浓度梯度分别进行单因素实验。

按实施例3分别制备31瓶450mL的茄科雷尔氏菌噬菌体GP1溶液(4.3x10⁶PFU/mL)，分别向其中30瓶中加入50mL的曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮， 脂酸钙，甘露醇等试剂溶液制剂，混合均匀；在第31瓶中加入50mL的无菌去离子水作为对 照1，混合均匀；同时以500mL无菌去离子水作为对照2。分别向32个瓶中放入3块直径为 6cm的生姜块茎，室温下静置浸泡5h。以双层平板法测定姜块中噬菌体效价，并计算姜块中 噬菌体增加率。实验重复3次。

噬菌体增加率＝(加入辅助渗透剂后植物体内噬菌体量-对照1处理后植物体内噬菌体 量)/对照1处理后植物体内噬菌体量×100％

测定结果如表1所示，不同剂量的曲拉通处理中，加入12g和14g的处理组均使得茄科雷尔 氏菌噬菌体GP1渗透量提高了35.71％，因此选择最小剂量12g为最佳剂量；

不同剂量脂肪醇聚氧乙烯醚处理中，23g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高 了39.28％，因此选择剂量23g为最佳剂量；

不同剂量琥珀酸二辛酯磺酸钠处理中，14g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提 高了60.71％，因此选择剂量14g为最佳剂量；

不同剂量噻酮处理中，25g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高了50％，因此 选择剂量25g为最佳剂量；

不同剂量硬脂酸钙处理中，18g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高了42.86％， 因此选择18g为最佳剂量；

不同剂量甘露醇处理中，70g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP1渗透量提高了60.71％， 因此选择70g为最佳剂量；

综上，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，硬脂酸钙，甘露醇均为噬 菌体辅助渗透剂的必要成分，其最佳剂量分别为12g，23g，14g，25g，18g和70g。

表1六种试剂的不同浓度对茄科雷尔氏菌噬菌体GP1溶液的渗透作用结果

实验例3六种试剂对茄科雷尔氏菌噬菌体GP2的辅助渗透效果检测

选取实施例1种制备的曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙， 甘露醇等试剂溶液的各5个浓度梯度分别进行单因素实验。

按实施例4分别制备31瓶450mL的茄科雷尔氏菌噬菌体GP2溶液(6.5x10⁶ PFU/mL)， 分别向其中30瓶中加入50mL的曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮， 脂酸钙，甘露醇等试剂溶液制剂，混合均匀；在第31瓶中加入50mL的无菌去离子水作为对 照1，混合均匀；同时以500mL无菌去离子水作为对照2。分别向32个瓶中放入3块直径为6cm的生姜块茎，室温下静置浸泡5h，以双层平板法测定姜块中噬菌体效价，并计算姜块中噬菌体增加率。实验重复3次。

噬菌体增加率＝(加入辅助渗透剂后植物体内噬菌体量-对照1处理后植物体内噬菌体 量)/对照1处理后植物体内噬菌体量×100％

测定结果如表2所示，不同剂量的曲拉通处理中，加入10g、12g和14g的处理组均使得茄科 雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了42.22％，因此选择最小剂量10g为最佳剂量；

不同剂量脂肪醇聚氧乙烯醚处理中，22g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高 了28.89％，因此选择剂量22g为最佳剂量；

不同剂量琥珀酸二辛酯磺酸钠处理中，14g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提 高了28.89％，因此选择剂量14g为最佳剂量；

不同剂量噻酮处理中，20g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了31.11％，因 此选择剂量20g为最佳剂量；

不同剂量硬脂酸钙处理中，21g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了22.22％， 因此选择21g为最佳剂量；

不同剂量甘露醇处理中，60g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP2渗透量提高了31.11％， 因此选择60g为最佳剂量；

综上，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，硬脂酸钙，甘露醇均为噬 菌体辅助渗透剂的必要成分，其最佳剂量分别为12g，22g，14g，20g，21g和60g。

表2六种试剂的不同浓度对茄科雷尔氏菌噬菌体GP2溶液的渗透作用结果

实验例4六种试剂对茄科雷尔氏菌噬菌体GP3的辅助渗透效果检测

选取实施例1种制备的曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙， 甘露醇等试剂溶液的各5个浓度梯度分别进行单因素实验。

按实施例5分别制备31份450mL的茄科雷尔氏菌噬菌体GP3溶液(5.0x10⁶PFU/mL)，分别向其中30瓶中加入50mL的曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮， 脂酸钙，甘露醇等试剂溶液制剂，在第31瓶中加入50mL的无菌去离子水作为对照1，混合 均匀；同时以500mL无菌去离子水作为对照2。分别向32个瓶中放入3块直径为6cm的生 姜块茎，室温下静置浸泡5h，以双层平板法测定姜块中噬菌体效价，并计算姜块中噬菌体增 加率。实验重复3次。

噬菌体增加率＝(加入辅助渗透剂后植物体内噬菌体量-对照1处理后植物体内噬菌体 量)/对照1处理后植物体内噬菌体量×100％

测定结果如表3所示，不同剂量的曲拉通处理中，加入10g和12g的处理组均使得茄科雷尔 氏菌噬菌体GP3渗透量提高了12.5％，因此选择最小剂量10g为最佳剂量；

不同剂量脂肪醇聚氧乙烯醚处理中，22g和23g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透 量提高了12.5％，因此选择剂量22g为最佳剂量；

不同剂量琥珀酸二辛酯磺酸钠处理中，14g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提 高了22.5％，因此选择剂量14g为最佳剂量；

不同剂量噻酮处理中，20g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提高了22.5％，因 此选择剂量20g为最佳剂量；

不同剂量硬脂酸钙处理中，21g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提高了30％， 因此选择21g为最佳剂量；

不同剂量甘露醇处理中，70g的处理组使得茄科雷尔氏菌噬菌体GP3渗透量提高了22.5％， 因此选择70g为最佳剂量；

综上，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，硬脂酸钙，甘露醇均为噬 菌体辅助渗透剂的必要成分，其最佳剂量分别为10g，22g，14g，20g，21g和70g。

表3六种试剂的不同浓度对茄科雷尔氏菌噬菌体GP3溶液的渗透作用结果

实验例5六种试剂对地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的辅助渗透效果检测

选取实施例1种制备的曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙， 甘露醇等试剂溶液的各5个浓度梯度分别进行单因素实验。

按实施例6分别制备31份450mL的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(3.3x10⁶PFU/mL)，分别向其中30瓶中加入50mL的曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮， 脂酸钙，甘露醇等试剂溶液制剂，在第31瓶中加入50mL的无菌去离子水作为对照1，混合 均匀；同时以500mL无菌去离子水作为对照2。分别向32个瓶中放入3块直径为6cm的生 姜块茎，室温下静置浸泡5h，以双层平板法测定姜块中噬菌体效价，并计算姜块中噬菌体增 加率。实验重复3次。

噬菌体增加率＝(加入辅助渗透剂后植物体内噬菌体量-对照1处理后植物体内噬菌体 量)/对照1处理后植物体内噬菌体量×100％

测定结果如表4所示，不同剂量的曲拉通处理中，加入10g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬 菌体YHC5渗透量提高了13.3％，因此选择10g为最佳剂量；

不同剂量脂肪醇聚氧乙烯醚处理中，22g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量 提高了15.6％，因此选择剂量22g为最佳剂量；

不同剂量琥珀酸二辛酯磺酸钠处理中，14g和18g的处理组均使得地毯草黄单胞菌噬菌体 YHC5渗透量提高了17.8％，因此选择剂量14g为最佳剂量；

不同剂量噻酮处理中，25g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量提高了24.4％， 因此选择剂量25g为最佳剂量；

不同剂量硬脂酸钙处理中，24g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量提高了 28.9％，因此选择24g为最佳剂量；

不同剂量甘露醇处理中，70g的处理组使得地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5渗透量提高了 31.1％，因此选择70g为最佳剂量；

综上，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，硬脂酸钙，甘露醇均为噬 菌体辅助渗透剂的必要成分，其最佳剂量分别为10g，22g，14g，25g，24g和70g。

表4六种试剂的不同浓度对地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5溶液的渗透作用结果

实验例6六种试剂对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1的辅助渗透效果检测 选取实施例1种制备的曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙， 甘露醇等试剂溶液的各5个浓度梯度分别进行单因素实验。

按实施例7分别制备31份450mL的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1(5.1x10⁶PFU/mL)，分别向其中30瓶中加入50mL的曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸 二辛酯磺酸钠，噻酮，脂酸钙，甘露醇等试剂溶液制剂，在第31瓶中加入50mL的无菌去离 子水作为对照1，混合均匀；同时以500mL无菌去离子水作为对照2。分别向32个瓶中放入 3块直径为6cm的生姜块茎，室温下静置浸泡5h，以双层平板法测定姜块中噬菌体效价，并 计算姜块中噬菌体增加率。实验重复3次。

噬菌体增加率＝(加入辅助渗透剂后植物体内噬菌体量-对照1处理后植物体内噬菌体 量)/对照1处理后植物体内噬菌体量×100％

测定结果如表5所示，不同剂量的曲拉通处理中，加入12g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴 桃致病变种噬菌体PSA-P1渗透量提高了21.6％，因此选择12g为最佳剂量；

不同剂量脂肪醇聚氧乙烯醚处理中，23g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体 PSA-P1渗透量提高了16.2％，因此选择剂量23g为最佳剂量；

不同剂量琥珀酸二辛酯磺酸钠处理中，18g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌 体PSA-P1渗透量提高了16.2％，因此选择剂量18g为最佳剂量；

不同剂量噻酮处理中，20g的处理组使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1渗透量 提高了24.3％，因此选择剂量20g为最佳剂量；

不同剂量硬脂酸钙处理中，21g和24g的处理组均使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体 PSA-P1渗透量提高了29.7％，因此选择21g为最佳剂量；

不同剂量甘露醇处理中，70g和80g的处理组均使得丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体 PSA-P1渗透量提高了35.1％，因此选择70g为最佳剂量；

综上，曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯磺酸钠，噻酮，硬脂酸钙，甘露醇均为噬 菌体辅助渗透剂的必要成分，其最佳剂量分别为12g，23g，18g，20g，21g和70g。

综合实验例2～6各个试剂在不同浓度下对5株噬菌体的辅助渗透作用效果及渗透剂成 本等方面的因素，最终确定噬菌体辅助渗透剂中曲拉通，脂肪醇聚氧乙烯醚，琥珀酸二辛酯 磺酸钠，噻酮，硬脂酸钙，甘露醇的最佳剂量分别为12g，22g，14g，20g，21g和70g。

表5六种试剂的不同浓度对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种噬菌体PSA-P1溶液的渗透 作用结果

实验例7噬菌体辅助渗透剂对噬菌体浸泡生姜块茎的处理时间试验

分别取由实施例8和实施例10制得的效价为8.5x10⁴PFU/mL的具有辅助渗透剂的噬菌体 GP1、GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液各15份，每份500mL。分别向其中放入3块直径为6cm的生姜块茎，于室温下静置浸泡。自2h起每0.5h取样测定生姜块 茎中噬菌体效价直至9h。实验重复3次。此处作为处理I。

分别取由实施例3～实施例7和实施例9制备的效价为8.5x10⁴PFU/mL的噬菌体GP1、 GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液各15份，每份450mL，向其中分别加入50mL无菌去离子水并混合均匀。分别向其中放入3块直径为6cm的生姜块茎，于室温下 静置浸泡。自2h起每0.5h取样测定生姜块茎中噬菌体效价直至9h。实验重复3次。此处作 为对照I。

取15份500mL无菌去离子水，分别向其中放入3块直径为6cm的生姜块茎，于室温下静置浸泡。自2h起每0.5h取样测定生姜块茎中噬菌体效价直至9h。实验重复3次。此处 作为对照II。

结果如表6所示：处理I六组试验中，生姜块茎中的噬菌体效价均在浸泡至3h时达到 最高(＞7.5x10⁴PFU/mL)；浸泡至9h时生姜块茎内噬菌体效价较浸泡3h时无显著变化。对 照I六组试验中生姜块茎内噬菌体效价呈缓慢上升趋势；浸泡至8h时，六组试验中生姜块茎 内噬菌体效价与处理I中各试验组浸泡3h时效价相近；生姜块茎内噬菌体GP2与PSA-P1效 价于浸泡8.5h后呈下降趋势。上述试验结果说明噬菌体辅助渗透剂对生姜块茎的最佳浸泡处 理时间为3h；同时噬菌体辅助渗透制剂可持续有效地帮助噬菌体附着于生姜块茎内。

表6生姜块茎于不同噬菌体处理浸泡后块茎内噬菌体效价(PFU/mL)

实验例8噬菌体辅助渗透剂浓度对噬菌体浸泡生姜块茎效果的影响

分别取由实施例3～实施例7和实施例9制备的噬菌体GP1、GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶 液和噬菌体组合物溶液各5份。分别向其中加入终浓度分别为5％、10％、15％、20％和25％ (与噬菌体的体积比v/v)的辅助渗透剂(实施例2制得)并混合均匀，使得溶液总体积为 500mL且效价为9.3x10⁴PFU/mL；同时取500mL无菌去离子水作为对照。分别向其中放入3块直径为6cm的生姜块茎，于室温下静置浸泡3h后，测定各处理中生姜块茎内噬菌体效价。实验重复3次。

结果如表7所示，六组处理中，生姜块茎中的各株噬菌体在辅助渗透剂终浓度为10％ 和15％时均具有较高效价。结合生产成本等综合因素，噬菌体辅助渗透剂浸泡处理生姜块茎 的最佳工作浓度为10％(该浓度由辅助渗透剂与噬菌体的体积比计算而得v/v)。

表7不同浓度噬菌体辅助渗透剂处理生姜块茎中的噬菌体效价

实验例9噬菌体辅助渗透剂对噬菌体浸泡马铃薯块茎的处理时间试验

分别取由实施例8和实施例10制得的效价为9.0x10⁴PFU/mL的具有辅助渗透剂的噬菌体 GP1、GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液各15份，每份500mL。分别向其中放入3块直径为6cm的马铃薯块茎，于室温下静置浸泡。自2h起每0.5h取样测定马铃 薯块茎中噬菌体效价直至9h。实验重复3次。此处作为处理I。

分别取由实施例3～实施例7和实施例9制备的效价为9.0x10⁴PFU/mL的噬菌体GP1、 GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液各15份，每份450mL，向其中分别加入50mL无菌去离子水并混合均匀。分别向其中放入3块直径为6cm的马铃薯块茎，于室温 下静置浸泡。自2h起每0.5h取样测定马铃薯块茎中噬菌体效价直至9h。实验重复3次。此 处作为对照I。

取15份500mL无菌去离子水，分别向其中放入3块直径为6cm的马铃薯块茎，于室温下静置浸泡。自2h起每0.5h取样测定马铃薯块茎中噬菌体效价直至9h。实验重复3次。 此处作为对照II。

结果如表8所示：处理I六组试验中，马铃薯块茎中的噬菌体效价均在浸泡至3h时达 到最高(＞8.2x10⁴PFU/mL)，接近噬菌体浸泡液效价；浸泡至9h时马铃薯块茎内噬菌体效 价较浸泡3h时无显著变化。对照I六组试验中马铃薯块茎内噬菌体效价呈缓慢上升趋势；浸 泡至7.5h时，六组试验中马铃薯块茎内噬菌体效价与处理I中各试验组浸泡3h时效价相近； 马铃薯块茎内噬菌体GP2与GP3效价于浸泡8h后呈下降趋势。

上述试验结果说明噬菌体辅助渗透剂对马铃薯块茎的最佳浸泡处理时间为3h；同时噬 菌体辅助渗透制剂可持续有效地帮助噬菌体附着于马铃薯块茎内，进而维持马铃薯块茎内噬 菌体的有效浓度。

表8马铃薯块茎于不同噬菌体处理浸泡后块茎内噬菌体效价(PFU/mL)

实验例10噬菌体辅助渗透剂浓度对噬菌体浸泡马铃薯块茎效果的影响

分别取由实施例3～实施例7和实施例9制备的噬菌体GP1、GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶 液和噬菌体组合物溶液各5份。分别向其中加入终浓度分别为5％、10％、15％、20％和25％ (与噬菌体的体积比v/v)的噬菌体辅助渗透剂(实施例2制得)并混合均匀，使得溶液总体 积为500mL且效价为9.3x10⁴PFU/mL；同时取500mL无菌去离子水作为对照。分别向其中 放入3块直径为6cm的马铃薯块茎，于室温下静置浸泡3h后，测定各处理中马铃薯块茎内噬菌体效价。实验重复3次。

结果如表9所示，六组处理中，马铃薯块茎中的噬菌体在辅助渗透剂终浓度为10％和15％时均具有较高效价。结合生产成本等综合因素，噬菌体辅助渗透剂浸泡处理马铃薯块茎 的最佳工作浓度为10％(v/v)。

表9不同浓度噬菌体辅助渗透剂处理马铃薯块茎中的噬菌体效价

实验例11存放条件对噬菌体辅助渗透剂作用效果的影响

将噬菌体辅助渗透剂(实施例2制得)分别置于4℃、25℃及37℃，每6个月取出，直至18 个月。将其分别与由实施例3～实施例7和实施例9制备的效价为8.5x10⁴PFU/mL的噬菌体 GP1、GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液混匀，使辅助渗透剂终浓度为10％(与噬菌体的体积比v/v)。上述溶液各制备8份，每份500mL。分别向其中放入3块直 径为6cm的生姜块茎，于室温下静置浸泡。自2h起每1h取样测定生姜块茎中噬菌体效价直 至9h。实验重复3次。此处作为处理I。

分别取由实施例8和实施例10制得的效价为8.5x10⁴PFU/mL的具有辅助渗透剂的噬 菌体GP1、GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液各8份，每份500mL。分 别向其中放入3块直径为6cm的生姜块茎，于室温下静置浸泡。自2h起每1h取样测定生姜 块茎中噬菌体效价直至9h。实验重复3次。此处作为对照I。对照I中所采用辅助渗透剂为 新鲜配制的辅助渗透剂。

分别取由实施例3～实施例7和实施例9制备的效价为8.5x10⁴PFU/mL的噬菌体GP1、 GP2、GP3、YHC5、PSA-P1溶液和噬菌体组合物溶液各8份，每份450mL，向其中分别加 入50mL无菌去离子水并混合均匀。分别向其中放入3块直径为6cm的生姜块茎，于室温下 静置浸泡。自2h起每1h取样测定生姜块茎中噬菌体效价直至9h。实验重复3次。此处作为 对照II。

取8份500mL无菌去离子水，分别向其中放入3块直径为6cm的生姜块茎，于室温 下静置浸泡。自2h起每1h取样测定生姜块茎中噬菌体效价直至9h。实验重复3次。此处作 为对照III。

噬菌体辅助渗透剂长期置于4℃下对渗透效果的影响如表10-1～表10-3所示：噬菌体 辅助渗透剂于4℃下存放18个月后其辅助渗透效果与新配置的渗透剂的效果相近，生姜块茎 内噬菌体效价接近噬菌体浸泡液效价。

噬菌体辅助渗透剂长期置于25℃下对渗透效果的影响如表10-4～表10-6所示：噬菌体 辅助渗透剂于25℃下存放12个月后其辅助渗透效果与新配置的渗透剂的效果(对照I)相近， 生姜块茎内噬菌体效价接近噬菌体浸泡液效价；存放18个月后其辅助渗透效果减弱，浸泡处 理4h后生姜块茎内噬菌体效价与噬菌体浸泡液效价数量级相同，但其辅助渗透效果仍远优于 纯噬菌体浸泡渗透效果(对照II)。

噬菌体辅助渗透剂长期置于37℃下对渗透效果的影响如表10-7～表10-9所示：噬菌体 辅助渗透剂于37℃下存放6个月后其辅助渗透效果与新配置的渗透剂的效果(对照I)相近， 生姜块茎内噬菌体效价接近噬菌体浸泡液效价；存放12个月后其辅助渗透效果减弱，浸泡处 理5h后生姜块茎内噬菌体效价与噬菌体浸泡液效价数量级相同；存放18个月后则需浸泡处 理6h后生姜块茎内噬菌体效价方与噬菌体浸泡液效价数量级相同，但其辅助渗透效果仍远优 于纯噬菌体浸泡渗透效果(对照II)。

上述试验结果说明噬菌体辅助渗透剂在4℃下具有良好的稳定性，可存放18个月其辅 助渗透效果不受影响；噬菌体辅助渗透剂在25℃与37℃下的稳定存放时间则分别为12个月 与6个月。噬菌体辅助渗透制剂易于保存，可置于多种环境中，一次配制后多次使用，应用 便捷。

表10-1生姜块茎于不同噬菌体处理浸泡后块茎内噬菌体效价(PFU/mL)

表10-2生姜块茎于不同噬菌体处理浸泡后块茎内噬菌体效价(PFU/mL)

表10-3生姜块茎于不同噬菌体处理浸泡后块茎内噬菌体效价(PFU/mL)

表10-4生姜块茎于不同噬菌体处理浸泡后块茎内噬菌体效价(PFU/mL)

表10-5生姜块茎于不同噬菌体处理浸泡后块茎内噬菌体效价(PFU/mL)

表10-6生姜块茎于不同噬菌体处理浸泡后块茎内噬菌体效价(PFU/mL)

表10-7生姜块茎于不同噬菌体处理浸泡后块茎内噬菌体效价(PFU/mL)

表10-8生姜块茎于不同噬菌体处理浸泡后块茎内噬菌体效价(PFU/mL)

表10-9生姜块茎于不同噬菌体处理浸泡后块茎内噬菌体效价(PFU/mL)

上述实验例结果说明噬菌体辅助渗透剂对块茎作物的最佳浸泡处理时间为3～3.5h；同时噬菌 体辅助渗透制剂可持续有效地帮助噬菌体附着于块茎作物体内，进而维持块茎作物体内噬菌 体的有效浓度。故本发明的辅助渗透剂可显著加速噬菌体进入块茎作物体内的速度，同时显 著增加单位时间内进入块茎作物体内的噬菌体数量。普通浸泡需7～8.5h方可使块茎作物体内 噬菌体数量达到峰值，而使用辅助渗透剂后仅需3h即可使块茎作物体内噬菌体数量到达峰 值，且辅助渗透剂工作浓度仅需10％(v/v)。噬菌体辅助渗透制剂在不同温度下均具有良好 的长期稳定性(＞6m)，易于保存。本发明不仅极大节约了研究人员处理样本的时间，而且 可以减少块茎作物因长时间浸泡对其质量造成的影响，从而有助于预防块茎作物的外来细菌 性病害。

本申请的辅助渗透剂适用对象除上述生姜或马铃薯外，还适用于其它块茎类作物，此 处不应受到限制。

上述实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围， 故：凡依本申请的原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。