截短的轮状病毒vp4蛋白及其用途
阅读说明：本技术 截短的轮状病毒vp4蛋白及其用途 (Truncated rotavirus VP4 protein and application thereof ) 是由 葛胜祥 李廷栋 贾连智 李毅坚 薛淼舸 曾渊君 张军 夏宁邵 于 2016-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种截短的轮状病毒VP4蛋白,其编码序列和制备方法,包含所述蛋白的药物组合物和疫苗,所述蛋白、药物组合物和疫苗可用于预防、减轻或治疗轮状病毒的感染及由轮状病毒的感染所导致的疾病,例如轮状病毒性胃肠炎和腹泻等。本发明还涉及上述蛋白用于制备药物组合物或疫苗的用途,所述药物组合物或疫苗用于预防、减轻或治疗轮状病毒的感染及由轮状病毒的感染所导致的疾病,例如轮状病毒性胃肠炎和腹泻等。(The invention relates to a truncated rotavirus VP4 protein, a coding sequence and a preparation method thereof, a pharmaceutical composition and a vaccine containing the protein, wherein the protein, the pharmaceutical composition and the vaccine can be used for preventing, relieving or treating rotavirus infection and diseases caused by the rotavirus infection, such as rotavirus gastroenteritis, diarrhea and the like. The invention also relates to the application of the protein in preparing a pharmaceutical composition or a vaccine for preventing, relieving or treating rotavirus infection and diseases caused by the rotavirus infection, such as rotavirus gastroenteritis, diarrhea and the like.)
本申请是申请日为2016年5月20日、申请号为201610339225.9的同名申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物化学、分子生物学、分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种截短的轮状病毒VP4蛋白，其编码序列和制备方法，包含所述蛋白的药物组合物和疫苗，所述蛋白、药物组合物和疫苗可用于预防、减轻或治疗轮状病毒的感染及由轮状病毒的感染所导致的疾病，例如轮状病毒性胃肠炎和腹泻等。本发明还涉及上述蛋白用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防、减轻或治疗轮状病毒的感染及由轮状病毒的感染所导致的疾病，例如轮状病毒性胃肠炎和腹泻等。
背景技术
轮状病毒(rotavirus,RV)属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，是引起婴幼儿腹泻的主要病原体，在1973年由Bishop在胃肠炎病人的十二指肠中发现(Bishop,Davidson,Holmes,et al.Lancet,2(7841),1281-1283,1973)。研究表明，95％以上的儿童在5岁前至少感染过一次轮状病毒。据WHO统计，每年因轮状病毒感染而导致的死亡病例高达60万，而腹泻病例则高达2亿；仅在美国，每年因轮状病毒感染而造成的经济损失就高达10亿美元(Hsu,Staat,Roberts,et al.Pediatrics,115(1),78-82,2005；Tate,Burton,Boschi-Pinto,et al.The Lancet Infectious Diseases,12(2),136-141,2011)，这造成了严重的经济负担和社会负担。
轮状病毒为无包膜RNA病毒，其基因组由11条双链RNA组成，分别编码6种结构蛋白(VP1-VP4，VP6和VP7)和6种非结构蛋白(NSP1-NSP6)(Estes and Cohen.Microbiol Rev,53(4),410-449,1989)。轮状病毒为二十面体对称，其衣壳由三个同心层构成，即由VP1、VP2和VP3构成的核心层，由VP6构成的内衣壳，以及由VP4和VP7构成的外衣壳。
VP6蛋白是轮状病毒中含量最高的衣壳蛋白。根据VP6的抗原性，可以将轮状病毒分为A-G 7个组，其中A组轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体。VP4和VP7为主要中和抗原，根据二者抗原性的不同可将A组轮状病毒分为不同的P血清型和G血清型。G血清型和P血清型相互独立又相互影响，常见的组合包括G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]和G4P[8]。近年来，G9P[8]和G9P[6]的流行显著增加(Li,Liu,Yu,et al.Vaccine,27F40-F45,2009)。
目前尚无针对轮状病毒的特效药。安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段。经过多年的研究，疫苗开发历经单价减毒疫苗，多价基因重配疫苗和基因工程疫苗三个阶段。目前已有五种轮状病毒疫苗相继上市，包括惠氏的四价人-猿基因重配疫苗，兰州所的单价减毒疫苗、默克的五价人-牛基因重配疫苗、葛兰素史克的单价减毒疫苗和印度巴拉特的单价减毒疫苗。然而，这些疫苗均为减毒活疫苗，存在较大的安全隐患，其中：惠氏的疫苗由于肠套叠问题在上市半年后即被撤回(Murphy,Gargiullo,Massoudi,et al.344(8),564-572,2001)；默克和葛兰素史克的疫苗尽管经过大量的临床实验证实其安全性和有效性(Bernstein,Sack,Rothstein,et al.Lancet(British edition),354(9175),287-290,1999；Vesikari,Matson,Dennehy,et al.New England Journal of Medicine,354(1),23-33,2006；Linhares,Velázquez,Pérez-Schael,et al.Lancet,371(9619),1181-1189,2008；Vesikari,Itzler,Karvonen,et al.Vaccine,28(2),345-351,2009；Snelling,Andrews,Kirkwood,et al.Clinical Infectious Diseases,52(2),191-200,2011)，但其在亚洲和非洲等轮状病毒死亡率较高的国家和地区的保护效率远低于欧美等发达国家(Armah,Sow,Breiman,et al.Lancet,376 606-614,2010；Zaman,Anh,Victor,etal.Lancet,376 568-570,2010；Madhi,Cunliffe,Steele,et al.N Engl J Med,362(4),289-298,2011)，并且越来越多的证据表明，二者接种后均产生排毒并可导致病毒的水平传播(Anderson.Lancet Infect Dis,8(10),642-9,2008；Rivera,Pena,Stainier,etal.Vaccine,29(51),9508-9513,2011；Yen,Jakob,Esona,et al.Vaccine,29(24),4151-5,2011)，并且还有研究表明，免疫缺陷儿童接种疫苗后可产生严重的胃肠炎(Steele,Cunliffe,Tumbo,et al.J Infect Dis,200Suppl 1S57-62,2009；Patel,Hertel,Estes,etal.N Engl J Med,362(4),314-9,2010)；兰州所的疫苗上市十多年，至今尚未发现严重问题，但仅能预防严重腹泻，而不能预防轮状病毒的感染(Fu,Wang,Liang,et al.Vaccine,25(52),8756-61,2007)。因此，尽管轮状病毒减毒疫苗的研究取得了可喜的结果，但也还存在一定的问题，其安全性和有效性还有待进一步提高；发展更加安全、有效的疫苗势在必行。
非复制型疫苗是目前轮状病毒疫苗研究的主要方向，其中基因工程疫苗由于成本低，安全、有效等特点而备受关注。
VP4和VP7蛋白作为轮状病毒的中和抗原，均可刺激机体产生中和抗体，从而抑制轮状病毒的感染。因此，VP4和VP7均是轮状病毒亚单位疫苗的主要候选抗原。VP7蛋白为糖基化蛋白，含有4对链内二硫键，形成Ca2+依赖性的三聚体，重组表达的VP7蛋白刺激机体产生的中和抗体水平较低。VP4蛋白无糖基化修饰，重组表达的VP4蛋白则可以刺激机体产生较高的免疫应答，并降低乳鼠腹泻的水平(Mackow,Vo,Broome,et al.J Virol,64(4),1698-703,1990)。另一方面，常见的P血清型仅2种，而常见的G血清型有5种。因此，相比于VP7蛋白，VP4蛋白更适合作为轮状病毒基因工程疫苗的候选抗原。
VP4蛋白由776个氨基酸组成，可以被胰酶酶切形成VP8*(aa1-231)和VP5*(aa248-776)两部分。VP4蛋白由头部、颈部和基座三个部分构成，其作为轮状病毒的刺突蛋白，在轮状病毒的感染中发挥着重要的作用。刺突的头部由两个分子的VP8蛋白组成，VP8蛋白可以与细胞表面的唾液酸受体结合，从而介导轮状病毒的吸附过程。颈部由三个分子的VP5抗原区组成，其中两个分子的VP5抗原区形成二聚体，另一个VP5抗原区以单体形式存在。在轮状病毒感染过程中，VP4的结构发生重排，暴露出VP5膜融合位点并介导轮状病毒的入胞过程；在此过程中，VP5抗原区由二聚体转变为三聚体。基座部分由三个分子的VP5蛋白C端结构域组成，并且通过该结构域插入外衣壳和内衣壳。VP8蛋白的N端25个氨基酸形成α螺旋，三个α螺旋形成螺旋束插入VP5基座部分，并通过一段柔性连接区与VP8头部相连，该连接区的结构目前尚未完全解析(Settembre,Chen,Dormitzer,et al.EMBO J,30(2),408-16,2011)。
研究表明，VP4蛋白的中和表位主要位于VP8头部和VP5抗原区，针对VP8的中和抗体可以抑制轮状病毒的吸附过程，针对VP5的中和抗体具有交叉中和活性，可以抑制轮状病毒的入胞(Dormitzer,Nason,Venkataram Prasad,et al.Nature,430(7003),1053-1058,2004；Abdelhakim,Salgado,Fu,et al.PLoS Pathog,10(9),e1004355,2014)。同时，合成肽扫描的结果表明，VP8蛋白的N端α螺旋区和连接区也存在中和表位(Kovacs-Nolan,Yoo andMine.Biochem J,376(Pt 1),269-75,2003)。
大量研究结果表明，VP4蛋白可以刺激机体产生保护性免疫应答(Dunn,Fiore,Werner,et al.Arch Virol,140(11),1969-78,1995；Gil,De Souza,Asensi,et al.ViralImmunology,13(2),187-200,2000)。然而，通过真核系统来表达VP4蛋白的周期长、成本高而且表达量低；并且，全长的VP4蛋白在原核系统中主要以包涵体形式表达，难以纯化且无法维持其天然构象。闻小波等人通过截短表达的方式解决了VP8蛋白在原核系统中以包涵体形式表达的问题，获得了在大肠杆菌中能够以可溶形式高效表达的截短VP8蛋白(△VP8*，aa65-223)(Wen,Cao,Jones,et al.Vaccine,30(43),6121-6,2012)；但是，该截短VP8蛋白的免疫原性显著低于全长的VP8蛋白。为了解决截短VP8蛋白免疫原性较低的问题，我们实验室在进行了深入研究后，获得了免疫原性更高的新的VP8截短蛋白，其在弗氏佐剂条件下免疫小鼠后，可以刺激小鼠产生高滴度的中和抗体并可以降低子代乳鼠的腹泻水平；并且，其可以与分子内佐剂进行融合表达，产生免疫原性和免疫保护性更高的融合蛋白(CN201510165746.2)。尽管该新的VP8截短蛋白及其融合蛋白已实现了显著有利的技术效果，但其也仍然存在着不足。例如，针对VP8蛋白的抗体主要是血清型特异性抗体，因此，该新的VP8截短蛋白用作疫苗时对异型毒株的中和活性显著低于同型毒株(Wen,Cao,Jones,et al.Vaccine,30(43),6121-6,2012)。此外，后续的研究还发现，该新的VP8截短蛋白在铝佐剂条件下，免疫保护性不够理想，有待进一步提高。
因此，本领域仍然需要开发新的针对轮状病毒的疫苗，其能够方便地、高表达量地产生(例如通过可溶性表达和纯化的方法)，能够比现有的疫苗(例如上述VP8截短蛋白)具有更强的免疫原性，能够诱导机体产生高滴度的针对轮状病毒的中和抗体(特别是在铝佐剂条件下)，从而使得能够大规模工业化生产高效的抗轮状病毒疫苗。
发明内容
本申请的发明人经过大量研究后出人意料地发现：N端截短了1-64个氨基酸(例如，5-64个氨基酸)，且C端终止于氨基酸位置276-497之间的VP4蛋白能够在大肠杆菌中以可溶形式表达，且能够通过色谱层析容易地进行纯化；并且，由此所获得的高纯度截短蛋白(纯度可达到至少50％或更高，例如60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％)具有良好的均一性和免疫原性，且能够在铝佐剂的条件下，诱导机体产生高滴度的针对轮状病毒的中和抗体，从而有效地解决了上述技术问题。
因此，在一个方面，本发明涉及N端截短了1-64个氨基酸(例如5-64个氨基酸)，且C端终止于氨基酸位置276-497之间的轮状病毒VP4蛋白或其变体。
在一个方面，本发明涉及一种截短的轮状病毒VP4蛋白或其变体，其与野生型轮状病毒VP4蛋白相比，N端截短了1-64个氨基酸(例如5-64个氨基酸)，并且C端终止于野生型轮状病毒VP4蛋白的下述位置：与SEQ ID NO:40的氨基酸位置276-497中的任一位置相对应的位置。
在某些优选的实施方案中，与野生型轮状病毒VP4蛋白相比，该截短的轮状病毒VP4蛋白的N端截短了1-64个氨基酸，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个或64个氨基酸(例如，1-5个，5-25个，5-21个，21-25个，21-64个，或25-64个氨基酸，例如1个、5个、21个、25个、或64个氨基酸)；并且C端终止于野生型轮状病毒VP4蛋白的下述位置：与SEQ ID NO:40的氨基酸位置276-497(例如氨基酸位置281-497、291-497、301-497、311-497、321-497、331-497、341-497、351-497、361-497、371-497、381-497、391-497、401-497、411-497、421-497、431-497、441-497、451-497、461-497、471-497、476-497、482-497、487-497、或492-497)中的任一位置相对应的位置，例如C端终止于下述位置：与SEQ ID NO:40的氨基酸位置276、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、476、482、487、492或497相对应的位置(例如，与SEQ ID NO:40的氨基酸位置331、351、381、411、441、461、471、476、482、487、492或497相对应的位置)。
在某些优选的实施方案中，与野生型轮状病毒VP4蛋白相比，该截短的轮状病毒VP4蛋白的N端截短了1个、5个、21个、25个、或64个氨基酸，并且C端终止于野生型轮状病毒VP4蛋白的下述位置：与SEQ ID NO:40的氨基酸位置276、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、476、482、487、492或497相对应的位置(例如，与SEQ ID NO:40的氨基酸位置331、351、381、411、441、461、471、476、482、487、492或497相对应的位置)。
在某些优选的实施方案中，与野生型轮状病毒VP4蛋白相比，该截短的轮状病毒VP4蛋白具有选自下列的一个特征：
(1)N端截短了25个氨基酸且C端终止于下述位置：与SEQ ID NO:40的氨基酸位置276、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、476、482、487、492或497相对应的位置(优选地，与SEQ ID NO:40的氨基酸位置331、351、381、411、441、461、471、476、482、487、492或497相对应的位置)；
(2)N端截短了1个氨基酸且C端终止于与SEQ ID NO:40的氨基酸位置476相对应的位置；
(3)N端截短了5个氨基酸且C端终止于与SEQ ID NO:40的氨基酸位置476相对应的位置；
(4)N端截短了21个氨基酸且C端终止于与SEQ ID NO:40的氨基酸位置476相对应的位置；和
(5)N端截短了64个氨基酸且C端终止于与SEQ ID NO:40的氨基酸位置476相对应的位置。
在某些优选的实施方案中，所述野生型轮状病毒VP4蛋白是来源于轮状病毒LLR株、SA11株、EDIM株的VP4蛋白，或者是来源于P[4]、P[6]、或P[8]基因型轮状病毒的VP4蛋白；
在某些优选的实施方案中，所述野生型轮状病毒VP4蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:40和87-91。
在某些优选的实施方案中，所述截短的轮状病毒VP4蛋白(以下也简称为截短蛋白)具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:2-5和10-39。
在另一个方面，本发明涉及编码上述截短蛋白或其变体的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。
可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。然而，特别优选地，本发明的宿主细胞是原核细胞例如大肠杆菌细胞。
在另一个方面，本发明还涉及一种多聚体，其包含上述截短蛋白或其变体或者由上述截短蛋白或其变体组成。在某些优选的实施方案中，所述多聚体为三聚体。在某些优选的实施方案中，所述多聚体为分子量至少600kDa的多聚体。在某些优选的实施方案中，所述多聚体包含截短的轮状病毒VP4蛋白，其与野生型轮状病毒VP4蛋白相比，N端截短了25个氨基酸，并且C端终止于野生型轮状病毒VP4蛋白中的、与SEQ ID NO:40的氨基酸位置476相对应的位置。在某些优选的实施方案中，所述多聚体包含截短的轮状病毒VP4蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示。在某些优选的实施方案中，所述多聚体为三聚体或者分子量至少600kDa的多聚体，其包含如SEQ ID NO:30所示的截短的轮状病毒VP4蛋白。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述截短蛋白或其变体，或上述多核苷酸，或上述载体，或上述宿主细胞，或上述多聚体的组合物。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的截短蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的多聚体。
在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物(例如疫苗)，其包含本发明的截短蛋白或其变体或者本发明的多聚体，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物(例如疫苗)可以用于预防或治疗轮状病毒感染或由轮状病毒感染所导致的疾病例如轮状病毒性胃肠炎或腹泻等。
在某些优选的实施方案中，本发明的截短蛋白或其变体或者本发明的多聚体以预防或治疗轮状病毒感染或由轮状病毒感染所导致的疾病的有效量存在。在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物(例如疫苗)还包含另外的活性成分。优选地，所述另外的活性成分能够预防或治疗轮状病毒感染或由轮状病毒感染所导致的疾病。在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物(例如疫苗)还包含佐剂，例如铝佐剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还包含药学可接受的载体，赋形剂，稳定剂或能够为所述药物组合物的施用(例如施用给人受试者)提供有利性质的其他试剂。合适的药物载体包括例如，无菌水，盐水，葡萄糖，蓖麻油和环氧乙烷的缩合产物，液体酸，低级醇(例如C1-4醇)，油(例如玉米油，花生油，芝麻油；其任选还包含乳化剂例如脂肪酸的单-或二-甘油酯或磷脂例如卵磷脂)，乙二醇，聚亚烷基二醇，藻酸钠，聚(乙烯基吡咯烷酮)等等。所述载体任选地还可包含佐剂，防腐剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，渗透增强剂等。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物是无菌的。此外，所述药物组合的粘度可通过选择合适的溶剂或赋形剂来控制和维持。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物经配制具有4.5-9.0，5.0-8.0，6.5-7.5，或6.5-7.0的pH。
本发明的药物组合物(例如疫苗)可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物(例如疫苗)以单位剂量形式进行施用。
预防或治疗特定病况所需的本发明药物组合物(例如疫苗)的量将取决于施用途径、待治疗的病况的严重程度、患者的性别、年龄、体重和总体健康情况等等，其可由医生根据实际情况合理确定。
在另一个方面，本发明涉及一种制备上述截短蛋白或其变体的方法，其包括，在允许所述截短蛋白或其变体表达的条件下，培养本发明的宿主细胞；和，回收所表达的截短蛋白或其变体。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括，利用大肠杆菌来表达本发明的截短蛋白或其变体，然后将所述大肠杆菌裂解，并从裂解液中纯化获得该截短蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，纯化包括层析。在某些优选的实施方案中，所述纯化包括，两步层析法。在某些优选的实施方案中，所述两步层析法包括：阴离子交换层析(例如，使用Q-sepharose-HP的阴离子交换层析)；和，随后的疏水亲和层析(例如，使用Phenylsepharose-HP的疏水亲和层析)。
在另一个方面，本发明还涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的截短蛋白或其变体或者本发明的多聚体与药学可接受的载体和/或赋形剂混合，任选地还混合佐剂例如铝佐剂，和/或另外的活性成分，例如能够预防或治疗轮状病毒感染或由轮状病毒感染所导致的疾病的另外的活性成分。在某些优选的实施方案中，所述制备疫苗的方法包括下述步骤：将本发明的截短蛋白或其变体或者本发明的多聚体与佐剂(例如铝佐剂)混合。
如上所论述的，所获得的疫苗可以用于预防或治疗轮状病毒感染或由轮状病毒感染所导致的疾病例如轮状病毒性胃肠炎和腹泻等。
在另一个方面，本发明涉及一种在受试者中预防或治疗轮状病毒感染或由轮状病毒感染所导致的疾病的方法，其包括将预防或治疗有效量的根据本发明的截短蛋白或其变体或者本发明的多聚体或者本发明的药物组合物施用给所述受试者。在某些优选的实施方案中，所述由轮状病毒感染所导致的疾病包括但不限于，轮状病毒性胃肠炎和腹泻。在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如小鼠和人。
在另一个方面，本发明还涉及本发明的截短蛋白或其变体或者本发明的多聚体在制备药物组合物(例如疫苗)中的用途，所述药物组合物(例如疫苗)用于在受试者中预防或治疗轮状病毒感染或由轮状病毒感染所导致的疾病。在某些优选的实施方案中，所述由轮状病毒感染所导致的疾病包括但不限于，轮状病毒性胃肠炎和腹泻。在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如小鼠和人。
在另一个方面，本发明还涉及上述的截短蛋白或其变体或者上述的多聚体，其用于在受试者中预防或治疗轮状病毒感染或由轮状病毒感染所导致的疾病。在某些优选的实施方案中，所述由轮状病毒感染所导致的疾病包括但不限于，轮状病毒性胃肠炎和腹泻。在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如小鼠和人。
本发明中相关术语的说明及解释
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
根据本发明，表述“N端截短了X个氨基酸”是指，用起始密码子编码的甲硫氨酸残基替代蛋白质N末端的第1-X位氨基酸残基。例如，N端截短了25个氨基酸的轮状病毒VP4蛋白是指，用起始密码子编码的甲硫氨酸残基替代野生型轮状病毒VP4蛋白N末端的第1-25位氨基酸残基所获得的蛋白质。
根据本发明，表述“C端终止于氨基酸位置X”是指，氨基酸位置X之后(即，自氨基酸位置X+1开始)的氨基酸残基全部被缺失。例如，C端终止于野生型轮状病毒VP4蛋白的氨基酸位置441是指，在野生型轮状病毒VP4蛋白的氨基酸位置441之后(即，自氨基酸位置442开始)的氨基酸残基全部被缺失。
根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本发明的截短的轮状病毒VP4蛋白的氨基酸序列相比，具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸不同(例如保守氨基酸置换)或者具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了所述截短蛋白的必要特性。此处术语“必要特性”可以是如下特性中的一个或者多个：
(i)其能够在大肠杆菌中可溶性表达；
(ii)其能够通过色谱层析容易地进行纯化；
(iii)其在纯化后拥有良好的均一性和稳定性(不易于降解)；
(iv)其能够特异性结合抗VP4抗体，所述抗VP4抗体能够体外抑制病毒对细胞的感染；
(v)其能够与轮状病毒竞争性结合细胞受体，抑制病毒对细胞的感染；
(vi)其能够诱导机体产生高滴度的针对轮状病毒的中和抗体；
(vii)其能够保护受试者(如人和小鼠)，抵抗轮状病毒的感染。
优选地，本发明的“变体”保留了截短蛋白的所有上述特性。
根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698、ER2566、BL21(DE3)、B834(DE3)、BLR(DE3)等等。
根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
根据本发明，术语“VP4蛋白”、“VP4全长蛋白”和“轮状病毒VP4蛋白”可互换使用，其是指与VP7一起共同构成RV病毒颗粒外衣壳的结构蛋白。VP4蛋白的氨基酸序列是本领域技术人员已知的，并且见于各种公共数据库(例如GenBank数据库)。例如，VP4蛋白的示例性氨基酸序列可如SEQ ID NO：40和87-91所示。
根据本发明，术语“截短的轮状病毒VP4蛋白”是指，在野生型轮状病毒VP4蛋白的N端和/或C端去掉一个或者多个氨基酸后产生的蛋白质，其中，野生型轮状病毒VP4蛋白的具体氨基酸序列可从公共数据库(例如GenBank数据库)容易地获得，例如GenBank登录号AEV53329.1、BAA03850.1、AAB94758.2、AIS93087.1、ACJ06216.1和AAA66953.1。
在本发明中，野生型轮状病毒LLR的VP4蛋白的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示。因此，在本发明中，当涉及VP4蛋白的序列时，其使用SEQ ID NO:40所示的序列来进行描述。例如，表述“VP4蛋白的氨基酸位置276-497”是指，SEQ ID NO:40的氨基酸位置276-497。然而，本领域技术人员理解，可在SEQ ID NO:40中天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响VP4蛋白的生物学特性。例如，轮状病毒的不同病毒株的VP4蛋白可在氨基酸序列上天然存在差异，但具有实质上相同的生物学特性。因此，在本发明中，术语“VP4蛋白”意欲包括所有此类多肽和变体，包括SEQ ID NO:40所示的多肽以及其天然或人工的变体，所述变体保留了VP4蛋白的生物学特性。并且，当描述VP4蛋白的序列片段和氨基酸位置时，其不仅包括SEQ ID NO:40所示的多肽的序列片段和氨基酸位置，还包括该多肽的天然或人工变体中的相应序列片段和氨基酸位置。例如，表述“VP4蛋白的氨基酸位置276-497”意欲包括，SEQ ID NO:40的氨基酸位置276-497，以及SEQ ID NO:40所示的多肽的变体(天然或人工)中的相应氨基酸位置。
在本发明中，野生型轮状病毒SA11、EDIM、P[4]、P[6]、P[8]的VP4蛋白的示例性氨基酸序列分别如SEQ ID NO：87-91所示。
根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。根据本发明，表述“相应氨基酸位置”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的氨基酸位点/残基。
在本发明中，术语“截短的轮状病毒VP4蛋白基因片段”是指这样的基因片段，其与野生型轮状病毒VP4蛋白基因相比，在5'端或3'端缺失编码一个或多个氨基酸的核苷酸，其中野生型轮状病毒VP4蛋白基因的全长序列从公共数据库(例如GenBank数据库)容易地获得，例如GenBank登录号JQ013506.1、D16346.1、AF039219.2、KJ940075.1、FJ183356.1和L34161.1。例如，野生型轮状病毒LLR的VP4蛋白基因的核苷酸序列可如SEQ ID NO：40所示。
根据本发明，术语“多聚体”是指，以多肽分子(例如，本发明的截短蛋白)为单体构成的聚合体，其通常可包含至少2个(例如，3个，4个，5个或更多个)多肽单体(例如，本发明的截短蛋白)。在此类多聚体中，单体分子通过分子间相互作用(例如氢键、范德华力、疏水相互作用)而聚合形成多聚体。在本发明的某些实施方案中，多聚体是包含3个单体的三聚体。在本发明的某些实施方案中，多聚体是包含多个单体、且分子量为至少600kDa的多聚体(此类多聚体在本文中也被称为高聚体)。
根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
根据本发明，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。在本发明中，特别优选地，佐剂为铝佐剂。
根据本发明，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防或治疗疾病(例如轮状病毒感染)有效量是指，能够有效预防、阻止或延迟疾病(例如轮状病毒感染)的发生、或缓解、减轻或治疗已有的疾病(例如由轮状病毒感染所导致的疾病)的严重程度的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。
根据本发明，宿主细胞的裂解/破碎可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。
根据本发明，术语“免疫原性(immunogenicity)”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。
在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义，可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中使用的，“受试者”是指动物，例如脊椎动物。优选地，受试者为哺乳动物，例如人，牛科动物，马科动物，猫科动物，犬科动物，啮齿类动物或灵长类动物。特别优选地，受试者为人。在本文中，该术语可以与“患者”互换使用。
发明的有益效果
本发明提供的截短的轮状病毒VP4蛋白和其制备方法有效地解决了本领域中存在的技术问题。
首先，本发明的截短蛋白或其变体能够在大肠杆菌中可溶性表达，实现了高产率。这为大规模工业化生产提供了有利条件。
其次，本发明的截短蛋白或其变体的纯化方式相对简单，易于操作。特别地，在大肠杆菌中进行可溶性表达后，可将所述大肠杆菌裂解，然后对裂解液进行色谱层析处理(例如通过阴离子交换层析和疏水亲和层析进行处理)，由此可获得高纯度的截短蛋白(纯度可达到至少50％或更高，例如60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％)。这为大规模的工业化生产提供了有利条件。
第三，本发明所获得的高纯度截短蛋白具有良好的均一性和稳定性。特别地，本发明的经纯化的截短蛋白能够以均一的形式存在，且不易于降解。这为批量化生产提供了有利条件，避免了不同批次间的变异性，有利于精确用药。
第四，本发明的截短蛋白或其变体能够在铝佐剂条件下，诱导机体产生高滴度的针对轮状病毒的中和抗体。由于临床中通常使用铝佐剂，而不使用弗氏佐剂，因此，本发明的截短蛋白或其变体可有利地用于临床条件，用于保护受试者，抵抗轮状病毒感染。
综合来说，本发明的截短蛋白或其变体不仅具有易于表达、易于纯化等特点，而且具有高均一性和稳定性。更重要的是，本发明的截短蛋白或其变体具有强免疫原性，能够在铝佐剂条件下诱导机体产生高滴度的中和抗体，从而在临床条件下为受试者提供强的保护作用。因此，本发明的截短蛋白或其变体使得能够大规模工业化生产高效的抗轮状病毒疫苗，从而为本领域中存在的技术问题提供了有效的解决方案。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1A显示了经纯化的VP8-5蛋白的SDS-PAGE结果。结果显示，所获得的经纯化的VP8-5蛋白的纯度达到90％以上。
图1B显示了VP8-5蛋白与用其免疫Balb/c小鼠而获得的免疫血清的间接ELISA分析的结果，其中，横坐标表示实验组(VP8-5)、阳性对照组(LLR)和阴性对照组(NC)，纵坐标表示与VP8-5蛋白具有反应性的免疫血清的最大稀释倍数(即，抗体滴度)。结果显示，在使用铝佐剂的条件下，在免疫后第42天，VP8-5能在小鼠体内诱发抗体的产生，但是效率低于灭活病毒LLR。这个结果表明，在使用铝佐剂的条件下，VP8-5蛋白具有免疫原性，能在小鼠体内诱发抗体的产生，但是其在动物体内诱发抗体产生的能力低于灭活病毒LLR。
图1C显示了VP8-5在Balb/c小鼠中诱发的免疫血清的中和抗体滴度的分析结果，其中，横坐标表示实验组(VP8-5)、阳性对照组(LLR)和阴性对照组(NC)，纵坐标表示达到50％感染抑制率的免疫血清最大稀释倍数的log值(log2NT50，中和抗体滴度)。结果显示，在使用铝佐剂的条件下，VP8-5在免疫后第42天(三次免疫后)能够在小鼠体内诱发中和抗体，但是免疫血清的中和抗体滴度(NT50)低于灭活病毒LLR。免疫程序完成后，使用VP8-5蛋白诱发的免疫血清的中和抗体滴度(NT50)仅达到64左右。这个结果表明，在使用铝佐剂的条件下，VP8-5能够诱导机体产生中和抗体，但是其所诱发的免疫血清的中和抗体滴度低于灭活病毒LLR。
图2A-2C显示了保护性实验中腹泻的评分标准。根据乳鼠腹泻的不同程度，评分分为3个等级：正常粪便计为1分(图2C)，软粪便计为2分(图2B)，不成形水样便计为3分(图2A)。
图3显示了攻毒后不同免疫组的乳鼠的腹泻评分情况，其中，纵轴表示腹泻评分；横轴表示小鼠攻毒后天数。结果显示，实验组(VP8-5)乳鼠的腹泻评分与阴性对照组(NC)无显著差异。这说明，在使用铝佐剂的条件下，VP8-5保护机体、抵抗轮状病毒感染的能力较低(低于灭活病毒)，不能充分缓解轮状病毒感染导致的腹泻。
图4A-4D显示了在大肠杆菌中表达的各个截短蛋白的SDS-PAGE结果。结果显示，除了26-311，26-331和26-381的表达量相对较低以外，其他的截短蛋白均可在大肠杆菌中高表达。
图5A-5B显示了经纯化的各种截短VP4蛋白的SDS-PAGE结果。在图5A中，泳道从左到右依次为：蛋白质分子量标记(Marker)，1-476，6-476，22-476，26-476，65-476，26-231，26-271，26-331和26-351。在图5B中，泳道从左到右依次为：蛋白质分子量标记(Marker)，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492和26-497。图5A和5B的结果显示，经过上述纯化步骤后，各截短蛋白的浓度均达到0.2mg/ml以上，且纯度大于80％。
图6显示了截短蛋白1-476、6-476、22-476、26-476、26-271、26-471、26-482、26-487、26-492、26-497的经G3000PWXL分子筛分析的结果。横坐标轴表示保留时间，纵坐标轴表示在280nm处的吸光度值。结果显示，在TB8.0条件下，截短蛋白1-476以高聚体的形式存在于样品中(出峰时间为约10-11分钟)；26-271呈单体状态(出峰时间为约16分钟)，含量超过90％；其余的截短蛋白(6-476、22-476、26-476、26-471、26-482、26-487、26-492、26-497)均为三聚体状态(出峰时间为约13-14分钟)，含量几乎都在90％以上。在盐存在的条件下(TB8.0+1M NaCl)，截短蛋白26-476、26-482、26-487、26-492和26-497转变为单体状态(出峰时间由约13-14分钟改变为约15-16分钟)，含量均超过90％。这表明，在盐存在的条件下，26-476、26-482、26-487、26-492和26-497的构象受到盐离子影响，导致三聚体发生解聚，形成单体。
图7显示了截短蛋白26-331，26-351，26-381，26-411，26-441和26-461的经G5000PWXL分子筛分析的结果。横坐标轴表示保留时间，纵坐标轴表示在280nm处的吸光度值。结果显示，在TB8.0条件下，这些截短蛋白均以高聚体的形式存在于样品中(出峰时间为约10-11分钟)。
图6和图7的结果还显示，所获得的截短VP4蛋白的主要吸收峰所占比例几乎都在80％或甚至90％以上；这说明，这些截短蛋白具有良好的均一性。
图8A显示了在50mM Tris-HCl(pH8.0)中37℃静置12小时后的截短蛋白26-476的分子筛分析结果。横坐标轴表示保留时间，纵坐标轴表示在280nm处的吸光度值。结果显示，截短蛋白26-476在50mM Tris-HCl(pH8.0)中37℃静置12小时后能够形成均一的高聚体(保留时间为12.4分钟)，并且高聚体的比例高达97.2％。
图8B显示了在50mM Tris-HCl(pH8.0)中37℃静置12小时后的截短蛋白26-476的电镜观察的结果。结果表明，截短蛋白26-476能够在体外组装成均一的高聚体。
图9显示了经酶切和未经酶切的截短蛋白26-476，26-482，26-487，26-492，26-497的SDS-PAGE结果。泳道上的数字1表示，样品未经胰酶处理；数字2表示，样品经0.1mg/ml胰酶处理。结果显示，上述截短蛋白均能被胰酶识别并发生酶切，其酶切位点是暴露的。
图10显示了各种截短的VP4蛋白(1-476、6-476、22-476、65-476、26-271、26-441、26-461、26-471、26-476，26-482，26-487，26-492，26-497)与中和抗体A3(图10A)、B1(图10B)、B5(图10C)、B6(图10D)、D6(图10E)、E2(图10F)、E5(图10G)、8F6(图10H)的间接ELISA分析的结果，其中横坐标表示各截短蛋白，纵坐标表示与各截短蛋白具有反应性的一抗(A3、B1、B5、B6、D6、E2、E5、8F6)的最低抗体浓度。结果显示，各截短蛋白均具有良好的抗原性(即，抗体反应性)。
图11A-11D显示了截短蛋白26-476与用各待测样品(1-476、6-476、22-476、65-476、26-271、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461、26-471、26-476、26-482、26-487、26-492、26-497、26-476的三聚体、26-476的高聚体、灭活病毒)免疫Balb/c小鼠而获得的免疫血清的间接ELISA分析的结果，其中，横坐标表示用于制备免疫血清的蛋白样品；纵坐标表示与26-476具有反应性的免疫血清的最大稀释倍数(即，抗体滴度)；RV：灭活的轮状病毒；NC：阴性对照(PBS)；三聚体：26-476的三聚体；高聚体：26-476的高聚体。图11A、11B、11C和11D显示了来自不同免疫批次的结果。结果显示，在使用铝佐剂的条件下，在免疫后第42天，各蛋白样品均能在小鼠体内诱发抗体(免疫血清中的抗体滴度(GMT)均可达到102-105或更高)；并且，除了26-271外，其他蛋白样品所诱发的抗体滴度均高于RV诱发的抗体滴度(1-476、6-476、22-476、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461、26-471、26-476、26-487、26-492、26-476的三聚体和26-476的高聚体)，或至少与RV诱发的抗体滴度相当(65-476、26-482和26-497)。
图12A-12D显示了各蛋白样品(1-476、6-476、22-476、65-476、26-271、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461、26-471、26-476、26-482、26-487、26-492、26-497、26-476的三聚体、26-476的高聚体、灭活病毒)在Balb/c小鼠中诱发的免疫血清的中和抗体滴度的分析结果，其中，横坐标表示用于制备免疫血清的蛋白样品；纵坐标表示达到50％感染抑制率的免疫血清最大稀释倍数(NT50，中和抗体滴度)；RV：灭活的轮状病毒；NC：阴性对照(PBS)；三聚体：26-476的三聚体；高聚体：26-476的高聚体。图12A、12B、12C和12D显示了来自不同免疫批次的结果。结果显示，在使用铝佐剂的条件下，在免疫后第42天(三次免疫后)，各蛋白样品均能在小鼠体内诱发中和抗体，中和抗体滴度(NT50)均可达到28-214或更高的水平；并且，除了26-271外，其他蛋白样品所诱发的中和抗体滴度均与RV诱发的中和抗体滴度相当(6-476、22-476、26-476、65-476、26-471、26-482、26-487、26-492、26-497和26-476的三聚体)，或甚至高于RV诱发的中和抗体滴度(1-476、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461和26-476的高聚体)。
图13A-13D显示了攻毒后1-7天来自不同免疫组(用22-476，26-476，65-476，26-271，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492，26-497，26-476的三聚体，26-476的高聚体，灭活的轮状病毒(RV，阳性对照)或PBS(NC，阴性对照)进行免疫)的乳鼠的腹泻评分情况，其中，纵轴表示平均腹泻评分；横轴表示小鼠攻毒后天数；RV：灭活的轮状病毒；NC：阴性对照(PBS)；三聚体：26-476的三聚体；高聚体：26-476的高聚体。
图14A-14D显示不同免疫组(用22-476，26-476，65-476，26-271，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492，26-497，26-476的三聚体，26-476的高聚体，灭活的轮状病毒(RV，阳性对照)或PBS(NC，阴性对照)进行免疫)的乳鼠在攻毒后的平均腹泻持续时间和攻毒后48小时的平均腹泻评分，其中，平均腹泻天数以柱形图表示，平均腹泻评分以曲线图表示，左纵轴表示平均腹泻天数；右纵轴表示腹泻评分；横轴表示各蛋白样品所对应的免疫组；RV：灭活的轮状病毒；NC：阴性对照(PBS)；三聚体：26-476的三聚体；高聚体：26-476的高聚体。
图13-14的结果显示，在平均腹泻评分和平均腹泻天数方面，各蛋白样品所对应的免疫组均显著优于NC组。这表明，各蛋白样品均具有显著的保护性，能够帮助小鼠抵抗轮状病毒感染和由轮状病毒感染导致的腹泻。此外，图13-14的结果还显示，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-476，26-476的三聚体，以及26-476的高聚体的保护性与RV相当，或甚至优于RV。结合实施例1的实验结果可知，在使用铝佐剂的条件下，这些蛋白样品在动物中的保护性均显著优于VP8-5。此外，图13D和图14D的实验结果还表明，截短蛋白26-476的高聚体在动物中的保护能力显著高于26-476的三聚体，可用于制备具有更高效力的疫苗。
图15显示了来源于不同病毒株的26-476蛋白的SDS-PAGE结果，其中，泳道从左到右依次为：来源于轮状病毒LLR的截短蛋白26-476；来源于轮状病毒SA11的截短蛋白26-476-SA11；来源于轮状病毒EDIM的26-476-EDIM；来源于轮状病毒P[8]的截短蛋白26-476-P[8]；来源于轮状病毒P[6]的截短蛋白26-476-P[6]；来源于轮状病毒P[4]的截短蛋白26-476-P[4]；和，蛋白质分子量标记(Marker)。结果表明，本发明的方法适用于不同的轮状病毒株；来源于不同病毒株的截短VP4蛋白(26-476)均可在大肠杆菌中有效表达，且经色谱法纯化后，其纯度均可达到80％以上。
图16显示了来源于不同毒株的的截短VP4蛋白26-476的分子筛分析结果。横坐标轴表示保留时间，纵坐标轴表示在280nm处的吸光度值。结果显示，在TB8.0条件下，来源于不同毒株的26-476蛋白均主要以三聚体的形式存在(出峰时间为约13-14分钟)，其含量均在80％以上。这表明，在TB8.0条件下，来源于不同毒株的26-476蛋白都具有良好的均一性。
图17显示各截短蛋白(26-476-P[4]、26-476-P[6]、26-476-P[8]、26-476-EDIM、26-476-SA11和来源于LLR的26-476)与用相应截短蛋白免疫Balb/c小鼠而获得的免疫血清的间接ELISA分析的结果，其中，横坐标表示用于制备免疫血清的截短蛋白所源自的病毒株，纵坐标表示与相应截短蛋白具有反应性的免疫血清的最大稀释倍数(即抗体滴度)；P[4]：26-476-P[4]；P[6]：26-476-P[6]；P[8]：26-476-P[8]；SA11：26-476-SA11；EDIM：26-476-EDIM；LLR：实施例4中制备的26-476。结果显示，在使用铝佐剂的条件下，在免疫后第42天，来源于不同病毒株的26-476蛋白均能在小鼠体内有效诱发抗体的产生，且所诱发的免疫血清中的抗体滴度(GMT)基本上相当(抗体滴度均可达到104-105或更高，显著高于阴性对照组)。这些结果表明，在使用铝佐剂的条件下，来源于不同病毒株的26-476蛋白均具有良好的免疫原性，能够在动物体内有效诱发抗体的产生；并且，来源于不同病毒株的26-476蛋白的免疫原性基本上相当，且均显著高于VP8-5。
图18显示了来源于不同病毒株的26-476蛋白(26-476-SA11、26-476-EDIM、来源于LLR的26-476)在Balb/c小鼠中诱发的免疫血清的中和抗体滴度的分析结果，其中，横坐标表示用于制备免疫血清的蛋白样品所源自的病毒株；纵坐标表示达到50％感染抑制率的免疫血清最大稀释倍数(NT50，中和抗体滴度)；SA11：26-476-SA11；EDIM：26-476-EDIM；LLR：实施例4中制备的26-476。结果显示，在使用铝佐剂的条件下，在免疫后第42天(三次免疫后)，SA11、EDIM和LLR毒株的26-476蛋白均能在小鼠体内诱发高滴度的中和抗体，中和抗体滴度(NT50)均可达到210-214或更高的水平；并且，26-476-SA11和26-476-EDIM所诱发的中和抗体滴度甚至高于来源于LLR的26-476。
图19A显示了不同免疫组(用26-476-SA11或PBS(NC，阴性对照)进行免疫)的乳鼠在用SA11病毒攻毒后1-7天的腹泻评分；图19B显示了不同免疫组(用26-476-EDIM或PBS(NC，阴性对照)进行免疫)的乳鼠用EDIM病毒攻毒后1-12天的腹泻评分；其中，横坐标表示攻毒后天数，纵坐标表示平均腹泻评分。结果显示，与来源于LLR的26-476类似，来源于SA11和EDIM的26-476蛋白均具有显著的保护性，能够帮助小鼠抵抗轮状病毒感染和由轮状病毒感染导致的腹泻。
图19C显示了在用EDIM攻毒后1-7天，经26-476-EDIM或PBS(NC，阴性对照)免疫的小鼠的粪便悬液样本中的病毒量，其中，横坐标表示攻毒后天数，纵坐标表示每ml粪便悬液样品中所含的EDIM基因组的拷贝数。结果显示，在攻毒后，在用PBS免疫的小鼠的粪便中检测到明显的排毒，而在用26-476-EDIM免疫的小鼠的粪便中，则未检测到排毒。
图19A-19C的结果表明，26-476-EDIM不仅能够使小鼠抵抗轮状病毒感染以及由轮状病毒感染导致的腹泻，而且能够抑制病毒在小鼠粪便中的排放(即，排毒)。
序列信息
本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
序列1(SEQ ID NO:1)：
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具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
除非特别指明，否则本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。在不背离本发明的精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例中使用的生物材料和试剂的来源：
轮状病毒LLR株由北京万泰生物药业股份有限公司馈赠；轮状病毒SA11株购自中国兽医保藏中心；轮状病毒Wa和DS-1株购自ATCC；轮状病毒EDIM株为病原生物学研究所馈赠；原核表达载体PTO-T7为实验室自主构建；大肠杆菌(E.coli)ER2566和BL21(DE3)购自新英格兰生物实验室公司；所使用的引物均由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。
实施例1：截短的VP8蛋白(VP8-5)的免疫原性和免疫保护性的研究
按照中国专利申请CN 201510165746.2中描述的方法表达并纯化截短的轮状病毒VP8蛋白VP8-5(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)。简言之，从轮状病毒LLR株的培养物中提取轮状病毒的基因组RNA，并通过反转录获得编码VP4蛋白的cDNA。随后，以获得的cDNA为模板，通过PCR反应，扩增获得编码VP8-5的基因片段。然后，使用获得的基因片段构建VP8-5表达质粒，并将该表达质粒转化入大肠杆菌中。在37℃下培养含有VP8-5表达质粒的大肠杆菌至OD600＝0.6左右，然后将温度降低至25℃，并加入终浓度为0.8mM的IPTG，继续培养6h。培养结束后，通过离心收集菌体，并进行超声破碎，收集可溶性级分。随后，通过阴离子交换层析来收集可溶性级分中的VP8-5蛋白，其中所使用的仪器系统为GE Healthcare公司生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱系统；所使用的层析介质为Q-sepharose-HP(GEHealthcare公司)；所使用的缓冲液为50mM Tris-HCl pH 8.0和50mM Tris-HCl pH 8.0，2MNaCl；洗脱程序为：1000mM NaCl洗脱杂蛋白，50mM NaCl洗脱目的蛋白，收集50mMNaCl洗脱产物。通过13.5％的SDS-PAGE来鉴定所获得的洗脱产物，结果示于图1中。图1的结果显示，所获得的经纯化的VP8-5蛋白的纯度达到90％以上。
中国专利申请CN 201510165746.2已利用小鼠模型证实，在使用弗氏佐剂的条件下，经纯化的VP8-5蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护性(参见，该申请的实施例5-8和图4-9)。为了进一步考察VP8-5蛋白在使用铝佐剂的条件下的免疫保护效果，通过小鼠模型来评价经纯化的VP8-5蛋白+铝佐剂的免疫原性和免疫保护性。
具体方案如下：将5-6周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为3组，每组7只小鼠，其中2组为对照组，1组为实验组。将纯化的VP8-5蛋白、等剂量的灭活病毒LLR株和PBS分别与磷酸铝佐剂按照1:1的比例混合，然后通过肌肉注射的方式免疫小鼠，免疫剂量为10μg/只，其中，实验组小鼠用VP8-5进行免疫，阳性对照组小鼠用灭活病毒LLR进行免疫，阴性对照组小鼠用PBS进行免疫。各组小鼠分别进行三次免疫，每次免疫间隔两周。在免疫程序的第0、14、28和42天分别采集小鼠的眼球血，用于抗体滴度和中和抗体滴度的检测。
抗体滴度的检测
将免疫血清梯度稀释，然后分别与包被于平板上的VP8-5进行间接ELISA分析(其中所使用的二抗为山羊抗小鼠抗体(万域美澜))，以测定与VP8-5具有反应性的免疫血清的最大稀释倍数。免疫血清的最大稀释倍数越大，免疫血清中的抗VP8-5抗体的滴度就越高，用于产生免疫血清的蛋白的免疫原性也越高。
间接ELISA的结果如图1B所示，其中，纵坐标表示与VP8-5具有反应性的免疫血清的最大稀释倍数(即，抗体滴度)。结果显示，在使用铝佐剂的条件下，在免疫后第42天，VP8-5能在小鼠体内诱发抗体的产生，但是效率低于灭活病毒LLR。上述结果表明，在使用铝佐剂的条件下，VP8-5蛋白具有免疫原性，能在小鼠体内诱发抗体的产生，但是其在动物体内诱发抗体产生的能力低于灭活病毒LLR。
中和抗体滴度的检测
将MA104细胞铺于96孔细胞培养板中(1.9*104个细胞/孔)。20小时后，通过ELISPOT检测免疫血清的中和抗体滴度(Li,Lin,Yu,et al.J Virol Methods,209 7-14,2014)。具体方案如下：将待测的免疫血清样品(含待测中和抗体)分别用加入胰酶的DMEM进行连续倍比稀释；然后取100μL各个经稀释的样品分别与稀释于DMEM中的轮状病毒液混合(TCID50＝1.5*105)；在37℃下孵育1h后，将混合物分别加入预铺有MA104细胞的96孔细胞培养板中，并在37℃培养14h；然后，如下计算各个免疫血清样品对病毒的感染抑制率。
感染抑制率＝(未加入血清的孔的病毒点计数-加入血清的孔的病毒点计数)/未加入血清的孔的病毒点计数*100％。
免疫血清中的中和抗体滴度定义为：达到50％感染抑制率的免疫血清最大稀释倍数。经50倍稀释后仍能达到50％以上感染抑制率的免疫血清样品被视为具有中和能力。
免疫血清的中和抗体滴度的分析结果如图1C所示，其中，纵坐标表示达到50％感染抑制率的免疫血清最大稀释倍数(NT50，中和抗体滴度)。结果显示，在使用铝佐剂的条件下，VP8-5在免疫后第42天(三次免疫后)能够在小鼠体内诱发中和抗体，但是免疫血清的中和抗体滴度(NT50)低于灭活病毒LLR。免疫程序完成后，使用VP8-5蛋白诱发的免疫血清的中和抗体滴度(NT50)仅达到64左右。上述结果表明，在使用铝佐剂的条件下，VP8-5能够诱导机体产生中和抗体，但是其所诱发的免疫血清的中和抗体滴度低于灭活病毒LLR。
在动物中的保护性的分析
在免疫程序完成后(免疫42天以后)，将各组小鼠按每两只母鼠配一只公鼠的比例进行交配。交配后20日左右，母鼠产下乳鼠，饲养7日。用LLR病毒株对7日龄乳鼠进行灌胃攻毒，攻毒剂量为5＊106TCID50/只。攻毒后，每天观察并记录乳鼠的腹泻情况，连续观察7天，并根据粪便的形态进行评分。评分标准如图2所示。根据乳鼠腹泻的不同程度，评分分为3个等级：正常粪便计为1分(图2C)，软粪便计为2分(图2B)，不成形水样便计为3分(图2A)。
图3显示了攻毒后不同免疫组的乳鼠的腹泻评分情况，其中，纵轴表示腹泻评分；横轴表示小鼠攻毒后天数。结果显示，实验组(VP8-5)乳鼠的腹泻评分与阴性对照组(NC)无显著差异。这说明，在使用铝佐剂的条件下，VP8-5保护机体、抵抗轮状病毒感染的能力较低(低于灭活病毒)，不能充分缓解轮状病毒感染导致的腹泻。
实施例2：编码截短的VP4蛋白的表达质粒的构建
轮状病毒LLR和SA11株用罗猴胚肾细胞系(MA-104)细胞进行培养。所用培养基为DMEM，其补充有2μg/ml的胰酶，0.5mg/ml的氨苄青霉素和0.4mg/ml的链霉素，3.7mg/ml的碳酸氢钠，0.34mg/ml的L-谷氨酰胺。
根据制造商的说明书，采用北京金麦格生物技术有限公司生产的病毒DNA/RNA提取试剂盒，提取轮状病毒的基因组RNA，并通过反转录获得编码LLR株VP4蛋白的cDNA。以获得的cDNA为模板，通过PCR反应，扩增获得编码截短的轮状病毒LLR株VP4蛋白的基因片段。
所使用的PCR引物如下：
上游引物：
5'-GGATCCCATATGATGGCTTCGCTCATTTAC-3'(SEQ ID NO:42)
5'-GGATCCCATATGTACAGACAATTACTTACGAATTC-3'(SEQ ID NO:43)
5'-GGATCCCATATGATACAGTTAATTGGATCAGAAAA-3'(SEQ ID NO:44)
5'-GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACGCAG-3'(SEQ ID NO:45)
5'-GGATCCCATATGTTGAATGGACCA-3'(SEQ ID NO:46)
下游引物：
5'-AAGCTTAGGTGTTTTGTATTGGTGG-3'(SEQ ID NO:47)
5'-AAGCTTATCTTCTAGCAACTATTGATCGT-3'(SEQ ID NO:48)
5'-AAGCTTAGTTCACTGCAGCTCTTCTAGC-3'(SEQ ID NO:49)
5'-AAGCTTACAATGACGTTTTCGATATAACTA-3'(SEQ ID NO:50)
5'-AAGCTTAGATATCTCGATTATATTGCATTTC-3'(SEQ ID NO:51)
5'-AAGCTTAAATTGAGTTTGCAAACTTAAAT-3'(SEQ ID NO:52)
5'-AAGCTTACCATTTATACCCTAGTCCACC-3'(SEQ ID NO:53)
5'-AAGCTTAATAGTTTGCTGGTTTGAATGA-3'(SEQ ID NO:54)
5'-AAGCTTATTCCTCTCCATCACGTATATATG-3'(SEQ ID NO:55)
5'-AAGCTTAATTCACTGAACATGTTGTATGTG-3'(SEQ ID NO:56)
5'-AAGCTTATCCTCCGTTATAGTTGAAGTC-3'(SEQ ID NO:57)
5'-AAGCTTAACGTGATATTACAAAGTCAGTTG-3'(SEQ ID NO:58)
5'-AAGCTTATACATAAGAGTTCTCTTTTATAACTTC-3'(SEQ ID NO:59)
5'-AAGCTTATGCTTGTGAATCATCCCAA-3'(SEQ ID NO:60)
5'-AAGCTTATAATGATCTCACATATACCATGTTT-3'(SEQ ID NO:61)
5'-AAGCTTATGCACATGTCACTTCATTTAAG-3'(SEQ ID NO:62)
5'-AAGCTTAAACTGGTAGTTGGAAATTATAAGTA-3'(SEQ ID NO:63)
5'-AAGCTTATGAGCCACCACTCATCACA-3'(SEQ ID NO:64)
5'-AAGCTTATAACGTTACTCCAGCTGAAC-3'(SEQ ID NO:65)
5'-AAGCTTATAATGACACAAAGTCTGTAAATTG-3'(SEQ ID NO:66)
5'-AAGCTTATGCTAAACTGAACCTAAATCTTA-3'(SEQ ID NO:67)
5'-AAGCTTACCTTGAAATAGAGAATGGCG-3'(SEQ ID NO:68)
5'-AAGCTTACGGTAACCCATATAACCCT(SEQ ID NO:69)
5'-AAGCTTAGAAGTCTCTTCCATTATTTGGA-3'(SEQ ID NO:70)
5'-AAGCTTAAATTAATGAAAATCTACCCGC-3'(SEQ ID NO:71)
5'-AGATCTAAGCTTATGATGGTACTAATAAAATTAATGAAAATC-3'(SEQ ID NO:72)
5'-AGATCTAAGCTTAAGTTTGATAATCATCATTTGATGGTACTA-3'(SEQ ID NO:73)
5'-AGATCTAAGCTTATGAGTTCATTATAGGAGTTTGATAATCAT-3'(SEQ ID NO:74)
5'-AGATCTAAGCTTATGTCTCACCGTCACTGAGTTCA-3'(SEQ ID NO:75)
5'-AGATCTAAGCTTACTGCCTCTCTAAGTCCTGTCTCA-3'(SEQ ID NO:76)
其中，以下划线标示出酶切位点，以斜体标示出引入的终止密码子。
利用上述引物，通过PCR扩增编码截短的VP4蛋白的基因，所使用的PCR反应体系如下：
用于扩增编码截短的VP4蛋白的基因的引物对如表2所示：
表2：VP4截短蛋白编码基因扩增引物
PCR反应条件如下：95℃预变性5min，35个循环的(95℃，40s；55℃，80s；72℃，1min)，72℃终延伸10min。所获得的扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
将各个PCR扩增产物连接入pMD18-T载体，并转化入大肠杆菌DH5α。然后，筛选阳性菌落，提取质粒，经Nde I/Hind III酶切鉴定，得到插入目的基因片段的阳性克隆质粒。对获得的各个阳性克隆质粒进行测序。测序结果显示，上述阳性克隆质粒中插入的目的片段的核苷酸序列与预期的一致，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2-34所示。
将上述阳性克隆质粒分别通过Nde I/Hind III进行酶切，获得各个截短的VP4蛋白的编码基因片段，并将其与经NdeI/HindIII酶切的非融合表达载体pTO-T7(罗文新等，生物工程学报，2000，16：53-57)相连接，转化入大肠杆菌DH5α。然后，筛选阳性菌落，提取质粒，经NdeI/HindIII酶切鉴定得到插入目的基因片段的阳性表达质粒。
取1μL阳性表达质粒，转化40μL感受态大肠杆菌Bl21(DE3)(购自NEB公司)。将转化后的大肠杆菌涂布于含卡那霉素(终浓度25mg/mL，下同)的固体LB培养基(LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)，并37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL液体LB培养基(含卡那霉素)中，然后在37℃，200转/分钟下振荡培养10小时。培养后，取1mL菌液，加入终浓度为10％的甘油，于-70℃保存。
实施例3：截短的VP4蛋白的表达
从-70℃取出实施例2制备的携带阳性表达质粒的大肠杆菌菌液，将其接种入50ml含卡那霉素的LB液体培养基中，在180rpm，37℃下培养大约4小时；然后转接入10瓶500ml含卡那霉素的LB培养基中(每瓶接入500ul菌液)。当培养物在600nm波长条件下的吸光值达0.5时，加入IPTG至终浓度为1mM，在180rpm，25℃下继续培养6小时。
取1ml上述菌液，进行离心，并收集菌体沉淀。向菌体沉淀中加入100μL去离子水，将菌体重悬。然后，加入20μL 6*上样缓冲液，混匀，并在沸水浴中温育10min，以裂解细胞。取10μL样品，通过12％的SDS-PAGE进行分析。SDS-PAGE结果如图4A-4D所示。结果显示，除了26-311，26-331和26-381的表达量相对较低以外，其他的截短蛋白均可在大肠杆菌中高表达。
实施例4：截短的VP4蛋白的纯化和表征
离心实施例3获得的大肠杆菌菌液，收集菌体沉淀。按照15ml/g湿菌的比例，用50mM TB8.0将表达截短的VP4蛋白的菌体重悬。然后，通过超声破碎大肠杆菌细胞，超声破碎条件为：超声2s，间隔4s，每克菌体超声破碎时间为4min。超声破碎后，以25000g进行离心，收集上清(即，含有重组表达的截短VP4蛋白的大肠杆菌裂解液可溶性级分)。
可通过两步层析法来纯化大肠杆菌裂解液可溶性级分中的截短VP4蛋白。对于26-331，26-351，26-381，26-411，26-441和26-461而言，在进行两步层析法之前，先用40％的硫酸铵处理大肠杆菌裂解液可溶性级分，然后离心并收集蛋白质沉淀；随后，将获得的蛋白质沉淀溶解于50mM Tris-HCl pH 8.0中，并应用于两步层析法。两步层析法的方案如下。
首先，通过Q-HP阴离子交换层析进行初步纯化，获得纯度约60％的截短的VP4蛋白，其具体纯化条件如下：
仪器系统：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱系统。
层析介质：Q-sepharose-HP(GE Healthcare公司)。
柱体积：5.5cm＊20cm。
缓冲液：A泵：50mM Tris-HCl pH 8.0；
B泵：50mM Tris-HCl pH 8.0，2M NaCl
流速：6mL/min。
检测器波长：280nm。
样品为之前制备的含有重组表达的截短的VP4蛋白的上清(即，大肠杆菌裂解液可溶性级分或溶解于50mM Tris-HCl pH 8.0中的蛋白质样品)。
洗脱程序为：50mM NaCl洗脱目的蛋白，1M NaCl洗脱杂蛋白。收集用50mMNaCl洗脱的级份，共获得30mL的含有重组表达的截短蛋白的经初步纯化的样品(注意：在上述初步纯化过程中，截短蛋白1-476，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441和26-461不与层析柱结合，包含在穿透级份(flow-through)中。因此，收集含有这些截短蛋白的穿透级份作为经初步纯化的样品)。
将上述经阴离子交换层析初步纯化的样品分别透析至含有2M NaCl的TB8.0缓冲液中，然后使用Phenyl sepharose-HP疏水亲和层析进行第二次纯化。
层析介质：Phenyl sepharose-HP(GE Healthcare公司)。
柱体积：5.5cm＊20cm。
缓冲液：A泵：50mM Tris-HCl pH 8.0，2M NaCl；
B泵：50mM Tris-HCl pH 8.0
流速：6mL/min。
检测器波长：280nm。
样品为经Q-HP层析柱纯化且透析至2M NaCl溶液中的产物
洗脱程序为：1.5M NaCl洗脱杂蛋白，1M NaCl洗脱目的蛋白，50mM NaCl洗脱杂蛋白。收集用1M NaCl洗脱的级份，共获得30mL经纯化的重组表达的截短的VP4蛋白(注意：在上述第二次纯化过程中，截短蛋白1-476，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461和26-471用50mM TB8.0进行洗脱，收集用50mM TB8.0洗脱的级份)。
取经上述方案纯化的样品150μL，加入30μL 6X Loading Buffer，混匀并于100℃水浴中温育10min；然后取10μl于13.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后通过考马斯亮兰染色来显示电泳条带。电泳结果示于图5中。
图5A-5B显示了经纯化的各种截短VP4蛋白的SDS-PAGE结果。在图5A中，泳道从左到右依次为：蛋白质分子量标记(Marker)，1-476，6-476，22-476，26-476，65-476，26-231，26-271，26-331和26-351。在图5B中，泳道从左到右依次为：蛋白质分子量标记(Marker)，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492和26-497。图5A和5B的结果显示，经过上述纯化步骤后，截短蛋白1-476，6-476，22-476，26-476，65-476，26-231，26-271，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492和26-497的浓度均达到0.2mg/ml以上，且纯度大于80％。
另外，还使用HPLC对上述经纯化的样品在不同缓冲条件下的均一性进行了分析。所使用的仪器为安捷伦1200高效液相色谱仪，层析柱为G3000PWXL或G5000PWXL，柱体积为7.8*300mm，流速为0.5ml/min，检测波长为280nm；其中，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441和26-461的均一性用G5000PWXL来进行检测；其他蛋白使用G3000PWXL来进行检测。SEC-HPLC的分析结果示于图6和图7中。
结果显示：在TB8.0的条件下，截短蛋白1-476，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441和26-461的保留时间均在11min左右，其分子量超过600kDa；这说明，这些截短蛋白主要以高聚体的形式存在。截短蛋白26-271的保留时间为约16min；这说明，该蛋白主要以单体形式存在。其余蛋白(6-476、22-476、26-476、26-471、26-482、26-487、26-492、26-497)的保留时间均为约13-14min，与IgG(150kDa)的保留时间相当；这说明，这些蛋白主要以三聚体的形式存在。
另外，在TB8.0+1M NaCl的条件下，截短的VP4蛋白26-476，26-482，26-487，26-492和26-497的保留时间均为约15min，与VP8二聚体(40kDa)相当；这说明，这些截短蛋白在TB8.0+1M NaCl条件下主要以单体形式存在。这进而表明，在盐存在的条件下，26-476，26-482，26-487，26-492，26-497的构象受到盐离子影响，导致三聚体发生解聚，形成单体。
此外，图6和图7的结果还显示，所获得的截短VP4蛋白的主要吸收峰所占比例几乎都在80％或甚至90％以上；这说明，这些截短蛋白具有良好的均一性，适合于工业化批量生产，且有利于准确确定用药剂量。
图6和图7的实验结果还概述于下面的表3中。
表3
实施例5：截短的VP4蛋白的体外组装及表征
通过下述方案来进行截短蛋白26-476的体外组装。在室温条件下，将截短蛋白26-476由TB8.0缓冲液透析至表4指定的透析缓冲液中，6小时后更换透析缓冲液一次。透析结束后，以12000rpm/min离心蛋白溶液10分钟，留取上清液。随后，将上清液在表4指定的温度下静置30分钟到24小时。静置后，将上清液迅速冰浴，并以12000rpm/min离心10分钟。收集第二次离心后的上清液(其含有体外组装的26-476)，用于下一步分析。
通过HPLC来分析所获得的上清液中由截短蛋白26-476体外组装所形成的高聚体的均一性。HPLC分析所用仪器为安捷伦公司生产的1200高效液相色谱仪或Waters公司生产的E2695高效液相色谱仪，层析柱为G5000PWXL，柱体积为7.8*300mm，流速为0.5ml/min，检测波长为280nm。SEC-HPLC的分析结果示于表4和图8A中。
表4：截短蛋白的体外组装的条件及结果
图8A显示了在50mM Tris-HCl(pH8.0)中37℃静置12小时后的截短蛋白26-476的分子筛分析结果。结果显示，截短蛋白26-476在50mM Tris-HCl(pH8.0)中37℃静置12小时后能够形成均一的高聚体(保留时间为12.4分钟)，并且高聚体的比例高达97.2％。
从表4和图8A的结果可以看出，在pH7.4-9.6的范围内，截短蛋白26-476在37℃-50℃的温度下静置后，能够组装形成均一的高聚体，并且高聚体的比例可超过90％。此外，表4的结果还显示，盐离子(例如NaCl)的存在可抑制截短蛋白26-476形成高聚体。盐离子(例如NaCl)的浓度越高，所形成的高聚体的比例就越低。
此外，还使用电镜来观察由截短蛋白26-476体外组装所形成的高聚体，所使用的仪器为FEI公司生产的G2 Spirit电镜。简言之，将样品固定于喷炭的铜网上，并用2％的磷钨酸(pH7.4)负染30分钟，随后使用电镜进行观察。结果示于图8B，其中可见大量不对称结构的颗粒，半径为约10nm。这些结果表明，截短蛋白26-476能够在体外组装成均一的高聚体。
实施例6：截短的VP4蛋白的酶切验证
将实施例4中获得的经纯化的截短的VP4蛋白在37℃下用胰蛋白酶酶切1小时。取酶切后的组分100ul，加入20μL 6X Loading Buffer，混匀并于100℃水浴中温育10min。随后取10μl于13.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后通过考马斯亮兰染色来显示电泳条带。电泳结果示于图9。
图9显示了经酶切和未经酶切的截短蛋白26-476，26-482，26-487，26-492，26-497的SDS-PAGE结果。泳道上的数字1表示，样品未经胰酶处理；数字2表示，样品经0.1mg/ml胰酶处理。最右侧的泳道所使用的样品为VP8-5，用作对照。图9的结果显示，上述截短蛋白均能被胰酶识别并发生酶切，其酶切位点是暴露的。
实施例7：截短的VP4蛋白的抗原性分析
将实施例4中获得的经纯化的截短VP4蛋白包被于平板上，获得经包被的平板。将中和抗体A3、B1、B5、B6、D6、E2、E5、8F6(本实验室通过杂交瘤技术自制，浓度均为1mg/ml)梯度稀释，然后按照实施例1中描述的间接ELISA方法进行检测。
检测结果示于图10中，其中横坐标表示各截短蛋白，纵坐标表示与各截短蛋白发生反应(OD450/620高于0.2)的最低抗体浓度。结果显示，各截短的VP4蛋白均具有良好的抗原性(即，抗体反应性)。
实施例8：截短的VP4蛋白的免疫原性的分析
将实施例4中获得的经纯化的截短蛋白26-476包被于平板上，获得经包被的平板。按照实施例1中描述的方案，在使用铝佐剂的条件下，用各待测样品(实施例4中获得的各种截短VP4蛋白、26-476的三聚体、实施例5中获得的26-476的高聚体、灭活病毒(RV，用作阳性对照)和PBS(NC，阴性对照))来分别免疫Balb/c小鼠，并收集小鼠血清。随后，按照实施例1中描述的方案，使用包被了26-476的平板通过间接ELISA来检测小鼠血清中的抗体滴度。
间接ELISA的结果如图11A-11D所示，其中，横坐标表示用于制备免疫血清的蛋白样品，纵坐标表示与26-476具有反应性的免疫血清的最大稀释倍数(即，抗体滴度)；并且，图11A、11B、11C和11D显示了来自不同免疫批次的结果。结果显示，在使用铝佐剂的条件下，在免疫后第42天，各蛋白样品均能在小鼠体内诱发抗体(免疫血清中的抗体滴度(GMT)均可达到102-105或更高)；并且，除了26-271外，其他蛋白样品所诱发的抗体滴度均高于RV诱发的抗体滴度(1-476、6-476、22-476、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461、26-471、26-476、26-487、26-492、26-476的三聚体和26-476的高聚体)，或至少与RV诱发的抗体滴度相当(65-476、26-482和26-497)。
结合实施例1的实验结果可知，在使用铝佐剂的条件下，各蛋白样品(除了26-271外)均具有良好的免疫原性，能够刺激小鼠产生高滴度的抗体；其免疫原性显著强于VP8-5，免疫血清中的抗体滴度显著高于来自用VP8-5免疫的小鼠的血清。此外，图11D的实验结果还表明，截短蛋白26-476的高聚体的免疫原性显著高于26-476的三聚体(p＝0.005)。
实施例9：截短的VP4蛋白的免疫中和活性的分析
使用实施例1中描述的方案，用各待测样品(实施例4中获得的各种截短VP4蛋白、26-476的三聚体、实施例5中获得的26-476的高聚体、灭活病毒(RV，用作阳性对照)和PBS(NC，阴性对照))来免疫实验组Balb/c小鼠(每组7只小鼠)，并收集免疫血清。
随后，按照实施例1中描述的检测方法，评价所收集的各个免疫血清样品中的中和抗体滴度。免疫血清的中和抗体滴度的分析结果如图12A-12D所示，其中，横坐标表示用于制备免疫血清的蛋白样品，纵坐标表示达到50％感染抑制率的免疫血清最大稀释倍数(NT50，中和抗体滴度)。图12A、12B、12C和12D显示了来自不同免疫批次的结果。结果显示，在使用铝佐剂的条件下，在免疫后第42天(三次免疫后)，各蛋白样品均能在小鼠体内诱发中和抗体，中和抗体滴度(NT50)均可达到28-214或更高的水平；并且，除了26-271外，其他蛋白样品所诱发的中和抗体滴度均与RV诱发的中和抗体滴度相当(6-476、22-476、26-476、65-476、26-471、26-482、26-487、26-492、26-497和26-476的三聚体)，或甚至高于RV诱发的中和抗体滴度(1-476、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461和26-476的高聚体)。
结合实施例1的实验结果可知，在使用铝佐剂的条件下，各蛋白样品(除了26-271外)均具有强的诱导机体产生中和抗体的能力，能够在动物体内诱发具有高中和抗体滴度的免疫血清，所述免疫血清能够有效抑制轮状病毒的感染。各蛋白样品(除了26-271外)诱导机体产生中和抗体的能力均显著优于VP8-5，从而具有更强的抵抗/预防RV感染的能力。此外，图12D的实验结果还表明，截短蛋白26-476的高聚体诱导机体产生中和抗体的能力显著高于26-476的三聚体(p<0.001)，具有显著更强的抵抗/预防RV感染的能力。
实施例10：截短的VP4蛋白在动物中的保护性的评价
使用实施例1中所述的方案，用各待测样品(实施例4中获得的截短VP4蛋白、26-476的三聚体、实施例5中获得的26-476的高聚体、灭活病毒(RV，用作阳性对照)和PBS(NC，阴性对照))免疫Balb/c小鼠(每组7只小鼠)，并收集血清。
按照实施例1中所述的方案来评价各蛋白样品在动物中的保护性。除1-476和6-476免疫组(这两组的动物未交配成功)之外，其余免疫组的实验结果如图13-14所示。
图13A-13D显示了攻毒后1-7天来自不同免疫组(用22-476，26-476，65-476，26-271，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492，26-497，26-476的三聚体，26-476的高聚体，灭活的轮状病毒(RV，阳性对照)或PBS(NC，阴性对照)进行免疫)的乳鼠的腹泻评分情况，其中，纵轴表示平均腹泻评分；横轴表示小鼠攻毒后天数；RV：灭活的轮状病毒；NC：阴性对照(PBS)；三聚体：26-476的三聚体；高聚体：26-476的高聚体。图14A-14D显示了不同免疫组(用22-476，26-476，65-476，26-271，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492，26-497，26-476的三聚体，26-476的高聚体，灭活的轮状病毒(RV，阳性对照)或PBS(NC，阴性对照)进行免疫)的乳鼠在攻毒后的平均腹泻持续时间和攻毒后48小时的平均腹泻评分，其中，平均腹泻天数以柱形图表示，平均腹泻评分以曲线图表示，左纵轴表示平均腹泻天数；右纵轴表示腹泻评分；横轴表示各蛋白样品所对应的免疫组。
结果显示，在平均腹泻评分和平均腹泻天数方面，各蛋白样品所对应的免疫组均显著优于NC组。这表明，各蛋白样品均具有显著的保护性，能够帮助小鼠抵抗轮状病毒感染和由轮状病毒感染导致的腹泻。此外，结果还显示，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-476，26-476的三聚体，以及26-476的高聚体的保护性与RV相当，或甚至优于RV。结合实施例1的实验结果可知，在使用铝佐剂的条件下，这些蛋白样品在动物中的保护性均显著优于VP8-5。此外，图13D和图14D的实验结果还表明，截短蛋白26-476的高聚体在动物中的保护能力显著高于26-476的三聚体，可用于制备具有更高效力的疫苗。
实施例11：来源于不同病毒株的截短VP4蛋白的表达、纯化以及其免疫保护性的评价
根据Gene bank中提供的EDIM毒株的VP4基因序列(登录号：AF039219.2)，由上海生工生物技术有限公司合成编码来源于轮状病毒EDIM株的26-476的基因片段。另外，根据Gene bank中提供的轮状病毒P[6]的VP4基因序列(登录号：FJ183356.1)，由上海生工生物技术有限公司合成编码来源于轮状病毒P[6]的26-476的基因片段。随后，以合成的基因片段为模板，通过PCR反应，扩增获得编码来源于轮状病毒P[6]和EDIM的截短蛋白26-476的基因片段。
另外，如实施例2中所述，用罗猴胚胎肾细胞系(MA-104)细胞培养轮状病毒SA11株，获得轮状病毒SA11的病毒培养物。轮状病毒P[4]和P[8]来源于重庆医科大学附属儿童医院收集的腹泻标本，标本编号为20131281(P[4])和编号20131028(P[8])。
根据制造商的说明书，采用北京金麦格生物技术有限公司生产的病毒DNA/RNA提取试剂盒，从病毒培养物或病毒标本中提取轮状病毒SA11、P[4]、P[8]的基因组RNA，并通过反转录获得编码来源于各个毒株的VP4蛋白的cDNA。以获得的cDNA为模板，通过PCR反应，扩增获得编码来源于毒株SA11、P[4]、P[8]的截短蛋白26-476的基因片段。
按照实施例2中描述的方法构建克隆质粒和表达质粒，所使用的PCR引物如下：
上游引物：
5'-GGATCCCATATGGGATCGGAGAAAACTCAA-3'(SEQ ID NO：77)
5'-GGATCCCATATGGGATCAGAGAAAAGTCAAAAT-3'(SEQ ID NO:79)
5'-GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACTCAAAATG-3'(SEQ ID NO：81)
5'-GGATCCCATATGGGAGCAGAGAAGACACA-3'(SEQ ID NO：83)
5'-GGATCCCATATGGGATCAACTAAATCACAAAATG-3'(SEQ ID NO：85)
下游引物：
5'-AAGCTTAATTAGTTGGAACTAAAGAAATAAGT-3'(SEQ ID NO:78)
5'-AAGCTTAATTAGACGGTACTAATGAAA-3'(SEQ ID NO:80)
5'-AAGCTTAGTTGGTTGGAACTAAAGAAA-3'(SEQ ID NO:82)
5'-AAGCTTAATCGTTGGACGGCAC-3'(SEQ ID NO:84)
5'-AAGCTTATGATGGCACTAATGATATAAGT-3'(SEQ ID NO:86)
其中，以下划线标示出酶切位点，以斜体标示出引入的终止密码子。
用于扩增各基因片段的引物对如表5所示：
表5：用于扩增来源于不同毒株的26-476的编码基因的引物对
截短蛋白26-476-P[4]、26-476-P[6]、26-476-P[8]、26-476-EDIM、26-476-SA11的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:35-39所示。
按照实施例3-4中描述的方法，在大肠杆菌中表达来源于不同病毒株的截短蛋白26-476(即，26-476-P[4]、26-476-P[6]、26-476-P[8]、26-476-EDIM、26-476-SA11)，并通过两步层析法进行纯化；然后通过SDS-PAGE鉴定所纯化的蛋白。
SDS-PAGE结果如图15所示，其中，泳道从左到右依次为：来源于轮状病毒LLR的截短蛋白26-476；来源于轮状病毒SA11的截短蛋白26-476-SA11；来源于轮状病毒EDIM的26-476-EDIM；来源于轮状病毒P[8]的截短蛋白26-476-P[8]；来源于轮状病毒P[6]的截短蛋白26-476-P[6]；来源于轮状病毒P[4]的截短蛋白26-476-P[4]；和，蛋白质分子量标记(Marker)。
结果表明，本发明的方法适用于不同的病毒株。来源于不同病毒株的截短VP4蛋白(26-476)均可在大肠杆菌中有效表达，且经色谱法纯化后，其纯度均可达到80％以上。
另外，还按照实施例4描述的方法，使用HPLC对上述经纯化的截短蛋白26-476在50mM TB8.0条件下的均一性进行了分析。SEC-HPLC的分析结果示于图16中。
结果显示：在TB8.0的条件下，来源于不同毒株的截短VP4蛋白26-476的保留时间均在13-14min左右，与IgG(150kDa)的保留时间相当；这说明这些蛋白主要以三聚体的形式存在。此外，图16的结果还显示，所获得的截短蛋白26-476的主要吸收峰所占比例几乎都在80％以上；这说明这些截短蛋白均具有较高的均一性，适合于工业化批量生产，且有利于准确确定用药剂量。
进一步，将来源于不同轮状病毒毒株的截短蛋白26-476分别包被于平板上，获得经包被的平板。按照实施例1中描述的方案，使用如上获得的经纯化的截短蛋白26-476(即，26-476-P[4]、26-476-P[6]、26-476-P[8]、26-476-EDIM、26-476-SA11，来源于LLR的26-476和PBS(阴性对照))来免疫Balb/c小鼠，并收集小鼠血清。随后，按照实施例1中描述的方案，使用经包被的平板通过间接ELISA来检测小鼠血清中的抗体滴度。
间接ELISA的结果如图17所示，其中，横坐标表示用于制备免疫血清的截短蛋白所源自的病毒株，纵坐标表示与相应截短蛋白具有反应性的免疫血清的最大稀释倍数(即，抗体滴度)；P[4]：26-476-P[4]；P[6]：26-476-P[6]；P[8]：26-476-P[8]；SA11：26-476-SA11；EDIM：26-476-EDIM；LLR：实施例4中制备的26-476。
结果显示，在使用铝佐剂的条件下，在免疫后第42天，来源于不同病毒株的26-476蛋白均能在小鼠体内有效诱发抗体的产生，且所诱发的免疫血清中的抗体滴度(GMT)基本上相当(抗体滴度均可达到104-105或更高，显著高于阴性对照组)。这些结果表明，在使用铝佐剂的条件下，来源于不同病毒株的26-476蛋白均具有良好的免疫原性，能够在动物体内有效诱发抗体的产生；并且，来源于不同病毒株的26-476蛋白的免疫原性基本上相当，且均显著强于VP8-5。
进一步地，使用实施例1中描述的方案，用来源于不同病毒株的26-476蛋白(26-476-SA11；26-476-EDIM；来源于LLR的26-476)免疫实验组Balb/c小鼠(每组7只小鼠)，并收集免疫血清。随后，按照实施例1中描述的检测方法，评价所收集的各个免疫血清样品中的中和抗体滴度。免疫血清的中和抗体滴度的分析结果如图18所示，其中，横坐标表示用于制备免疫血清的蛋白样品所源自的病毒株；纵坐标表示达到50％感染抑制率的免疫血清最大稀释倍数(NT50，中和抗体滴度)；SA11：26-476-SA11；EDIM：26-476-EDIM；LLR：实施例4中制备的26-476。
结果显示，在使用铝佐剂的条件下，在免疫后第42天(三次免疫后)，SA11、EDIM和LLR毒株的26-476蛋白均能在小鼠体内诱发高滴度的中和抗体，中和抗体滴度(NT50)均可达到210-214或更高的水平；并且，26-476-SA11和26-476-EDIM所诱发的中和抗体滴度甚至高于来源于LLR的26-476。由此可见，来源于SA11毒株和EDIM毒株的26-476蛋白的免疫中和活性甚至优于来源于LLR的26-476蛋白。
此外，通过类似的方法还可证实，来源于轮状病毒P[4]、P[6]和P[8]的26-476蛋白具有良好的免疫中和活性，能够在小鼠体内诱发高滴度的中和抗体。
这些结果表明，在使用铝佐剂的条件下，来源于不同病毒株的26-476蛋白均具有强的诱导机体产生中和抗体的能力，能够在动物体内诱发具有高中和抗体滴度的免疫血清。
进一步地，使用实施例1中所述的方案，用来源于不同病毒株的26-476蛋白(26-476-SA11，26-476-EDIM和PBS(NC，阴性对照))免疫Balb/c小鼠(每组7只小鼠)，并收集血清。随后，按照实施例1中所述的方案来评价各蛋白样品在动物中的保护性。实验结果如图19A-19B所示。
图19A显示了不同免疫组(用26-476-SA11或PBS(NC，阴性对照)进行免疫)的乳鼠用SA11病毒攻毒后1-7天的腹泻评分；图19B显示了不同免疫组(用26-476-EDIM或PBS(NC，阴性对照)进行免疫)的乳鼠用EDIM病毒攻毒后1-12天的腹泻评分；其中，横坐标表示攻毒后天数，纵坐标表示平均腹泻评分。结果显示，与来源于LLR的26-476类似，来源于SA11和EDIM的26-476蛋白均具有显著的保护性，能够帮助小鼠抵抗轮状病毒感染和由轮状病毒感染导致的腹泻。
此外，还按照实施例1中描述的方案，用26-476-EDIM或PBS(NC，阴性对照)来对成年小鼠进行免疫(共免疫三次)。免疫程序完成后，用500μL的EDIM病毒(2*107copies/ml)来攻击这些小鼠，并在攻毒后1-7天，每天收集小鼠的粪便标本，并用PBS重悬为1％的粪便悬液。随后，通过荧光定量PCR法对各个粪便悬液样本中的病毒进行定量检测。实验结果如图19C所示。
图19C显示了在攻毒后1-7天，来自经26-476-EDIM或PBS免疫的小鼠的粪便悬液样本中的病毒量，其中，横坐标表示攻毒后天数，纵坐标表示每ml粪便悬液样品中所含的EDIM基因组的拷贝数。由于荧光定量PCR检测试剂盒的检测下限为104copies/ml，因此，将阴性检测结果定义为103copies/ml。结果显示，在攻毒后，在用PBS免疫的小鼠的粪便中检测到明显的排毒，而在用26-476-EDIM免疫的小鼠的粪便中，则未检测到排毒。图19A-19C的结果表明，26-476-EDIM不仅能够使小鼠抵抗轮状病毒感染以及由轮状病毒感染导致的腹泻，而且能够抑制病毒在小鼠粪便中的排放(即，排毒)。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 截短的轮状病毒VP4蛋白及其用途
<130> IIC202139
<150> CN201510260020.7
<151> 2015-05-21
<160> 91
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 1
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
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<220>
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210 215 220
Gly Tyr Lys Trp Ser Glu Ile Ser Phe Lys Pro Ala Asn Tyr Gln Tyr
225 230 235 240
Thr Tyr Ile Arg Asp Gly Glu Glu Val Thr Ala His Thr Thr Cys Ser
245 250 255
Val Asn Gly Val Asn Asp Phe Asn Tyr Asn Gly Gly Ser Leu Pro Thr
260 265 270
Asp Phe Val Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Tyr Val
275 280 285
Tyr Ile Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Gln Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr
290 295 300
Val Arg Ser Leu Ala Ala Asp Leu Asn Glu Val Thr Cys Ala Gly Gly
305 310 315 320
Thr Tyr Asn Phe Gln Leu Pro Val Gly Gln Trp Pro Val Met Ser Gly
325 330 335
Gly Ser Val Ser Leu Arg Ser Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe
340 345 350
Thr Asp Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Ser Leu Ala
355 360 365
Val Glu Glu Pro Pro Phe Ser Ile Ser Arg Thr Arg Ile Ser Gly Leu
370 375 380
Tyr Gly Leu Pro Ala Ala Asn Pro Asn Asn Gly Arg Asp Phe Tyr Glu
385 390 395 400
Ile Ala Gly Arg Phe Ser Leu Ile Leu Leu Val Pro Ser
405 410
<210> 6
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 6
Met Gly Ser Glu Lys Thr Gln Arg Thr Thr Val Asn Pro Gly Pro Phe
1 5 10 15
Ala Gln Thr Gly Tyr Ala Pro Val Asn Trp Gly Pro Gly Glu Thr Ser
20 25 30
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65 70 75 80
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100 105 110
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195 200 205
Val Val Pro Leu Ala Leu Ser Ser Arg Ser Ile Val Ala Arg Arg
210 215 220
<210> 7
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 7
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Ala Val Asn
225
<210> 8
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 8
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225 230 235
<210> 9
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 9
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245
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 10
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Ile
<210> 11
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 11
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 12
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275
<210> 13
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 13
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<210> 14
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 16
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 17
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325
<210> 18
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 18
Met Gly Ser Glu Lys Thr Gln Arg Thr Thr Val Asn Pro Gly Pro Phe
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<220>
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<400> 28
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<220>
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<400> 29
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<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 30
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<220>
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Val Asn Glu Asp Ile Ile Ile Ser Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met
225 230 235 240
Gln Tyr Asn Arg Asp Ile Ile Ile Arg Phe Lys Phe Asn Asn Ser Ile
245 250 255
Val Lys Leu Gly Gly Leu Gly Tyr Lys Trp Ser Glu Ile Ser Phe Lys
260 265 270
Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Ser Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr
275 280 285
Ala His Thr Thr Cys Ser Val Asn Gly Val Asn Asn Phe Ser Tyr Asn
290 295 300
Gly Gly Ser Leu Pro Thr Asp Phe Ser Val Ser Arg Tyr Glu Val Ile
305 310 315 320
Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Val Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Gln Ala
325 330 335
Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg Ser Leu Ala Ala Asn Leu Asn Ser
340 345 350
Val Lys Cys Ser Gly Gly Asn Tyr Asn Phe Gln Ile Pro Val Gly Ala
355 360 365
Trp Pro Val Met Ser Gly Gly Ala Val Ser Leu His Phe Ala Gly Val
370 375 380
Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr Asp Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg
385 390 395 400
Phe Arg Phe Ser Leu Thr Val Glu Glu Pro Pro Phe Ser Ile Leu Arg
405 410 415
Thr Arg Val Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Pro Ala Phe Asn Pro Asn Asn
420 425 430
Gly His Glu Tyr Tyr Glu Ile Ala Gly Arg Phe Ser Leu Ile Ser Leu
435 440 445
Val Pro Ser Asn
450
<210> 37
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 37
Met Gly Ser Glu Lys Thr Gln Asn Val Thr Ile Asn Pro Ser Pro Phe
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ile Phe Gly Glu Ser Lys Gln Phe Asn Val Ser Asn Asp Ser Asn Lys
100 105 110
Trp Lys Phe Leu Glu Met Phe Arg Ser Ser Ser Gln Asn Glu Phe Tyr
115 120 125
Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Asp Thr Arg Phe Val Gly Ile Leu Lys
130 135 140
Tyr Gly Gly Arg Val Trp Thr Phe His Gly Glu Thr Pro Arg Ala Thr
145 150 155 160
Thr Asp Ser Ser Ser Thr Ala Asn Leu Asn Asn Ile Ser Ile Thr Ile
165 170 175
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Val Asn Glu Asp Ile Ile Val Ser Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met
225 230 235 240
Gln Tyr Asn Arg Asp Ile Ile Ile Arg Phe Lys Phe Gly Asn Ser Ile
245 250 255
Val Lys Met Gly Gly Leu Gly Tyr Lys Trp Ser Glu Ile Ser Tyr Lys
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Gly Gly Phe Leu Pro Thr Asp Phe Gly Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile
305 310 315 320
Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Val Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Lys Ala
325 330 335
Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg Ser Leu Ala Ala Asn Leu Asn Ser
340 345 350
Val Lys Cys Thr Gly Gly Ser Tyr Asn Phe Ser Ile Pro Val Gly Ala
355 360 365
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370 375 380
Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr Asp Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg
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Phe Arg Phe Ser Leu Thr Val Asp Glu Pro Pro Phe Ser Ile Leu Arg
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420 425 430
Gly Asn Glu Tyr Tyr Glu Ile Ser Gly Arg Phe Ser Leu Ile Tyr Leu
435 440 445
Val Pro Thr Asn
450
<210> 38
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 38
Met Gly Ala Glu Lys Thr Gln Asn Val Thr Val Asn Pro Gly Pro Phe
1 5 10 15
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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450
<210> 39
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工制备的蛋白
<400> 39
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275 280 285
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<212> PRT
<213> 轮状病毒毒株 LLR
<400> 40
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245 250 255
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275 280 285
Tyr Lys Trp Ser Glu Ile Ser Phe Lys Pro Ala Asn Tyr Gln Tyr Thr
290 295 300
Tyr Ile Arg Asp Gly Glu Glu Val Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val
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325 330 335
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340 345 350
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<210> 41
<211> 2331
<212> DNA
<213> 轮状病毒毒株 LLR
<400> 41
atggcttcgc tcatttacag acaattactt acgaattcat atacagtgaa tctttcagat 60
gaaatacagt taattggatc agaaaaaacg cagagaacta cagtaaatcc aggtccattt 120
gcacaaactg gttatgcacc agtgaattgg gggcctgggg aaacgagtga ttccactact 180
gttgagccag tgttgaatgg accatatcag ccgacgactt tcaatccacc agtagaatat 240
tggatgcttc tagcaccaac atcagaaggg gtagttgttg aaggtactaa tggtacggat 300
agatggctag ctacaatact tatagaacca aatgtgcctg agacgactag aaattacaca 360
ttatttgggg aaacagcgag tatatcagta gcaaacccat cacaaagtaa atggcgtttt 420
gttgacgtag ctaagaccac tgcaaatgga acatattcac aatatggacc attactatca 480
gatacaaaac tgtatggagt aatgaaatac aacgggaagt tgtatacgta taatggtgaa 540
actccgaatg ctacaacaaa ttattattca actacaaatt atgactcagt gaatatgaca 600
tcttattgcg atttttacat tataccaaga gcacaagaat caaagtgcac agaatacgta 660
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cgatcaatag ttgctagaag agctgcagtg aacgaagaca tagttatatc gaaaacgtca 780
ttgtggaaag aaatgcaata taatcgagat atcataataa gatttaagtt tgcaaactca 840
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tatcaatata catatatacg tgatggagag gaagtaactg cacatacaac atgttcagtg 960
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cgttatgaag ttataaaaga gaactcttat gtatatatag attattggga tgattcacaa 1080
gcattcagaa acatggtata tgtgagatca ttagctgcgg acttaaatga agtgacatgt 1140
gcagggggta cttataattt ccaactacca gttggacaat ggcctgtgat gagtggtggc 1200
tcagtatcat tgcgttcagc tggagtaacg ttatcaactc aatttacaga ctttgtgtca 1260
ttaaattcgt taagatttag gttcagttta gcagtagaag aaccgccatt ctctatttca 1320
aggacacgga tatcagggtt atatgggtta ccggcagcca atccaaataa tggaagagac 1380
ttctatgaaa ttgcgggtag attttcatta attttattag taccatcaaa tgatgattat 1440
caaactccta taatgaactc agtgacggtg agacaggact tagagaggca gttaggagaa 1500
ttgagagaag aatttaacgc attatcacaa gagatagcta tgtcacaatt gatagatcta 1560
gctttactac cattggacat gttctcaatg ttttcaggaa ttaaaacaac gatagatgca 1620
gctaaatcaa tggccactaa tgtaatgaag aagtttaaaa gctcaggctt ggccacgtct 1680
gtatccacgt tgacagactc attatctgac gccgcatcag cggtatcaag gaacagctca 1740
ataagatcaa ttggatcaac agcatcagct tggacagaca tttcttcaca aatagtggat 1800
acgcaagcat cagtcaatac gttggcaact caaacgtcaa ctatcagcaa gagattaagg 1860
ttaaaagaaa ttgcgactca aacagaggga atgaatttcg acgacatatc agcagctgtg 1920
ttaaaaacta aaattgacaa atcatcacaa ataggaccaa gtactttacc agatattgtt 1980
actgaagcgt cggagaagtt tataccaaat agaacgtata gagtaattga cgatgatact 2040
gtgtttgaag caggaacaga tgggagattt tacgcatata gagtcgagac gtttgaggaa 2100
gttccatttg atgtgcaaaa attcgcagat ttagtaactg actctccagt aatctcggcc 2160
attatagact ttaaaacgct taaaaacttg aatgataact atggaattac tcgttcgcaa 2220
gcattaaatc taattagatc agatccaagg gttctgcgag aatttatcaa tcaagataat 2280
ccaataataa gaaacaggat agagcagtta attctgcaat gtagattgta a 2331
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
ggatcccata tgatggcttc gctcatttac 30
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
ggatcccata tgtacagaca attacttacg aattc 35
<210> 44
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
ggatcccata tgatacagtt aattggatca gaaaa 35
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
ggatcccata tgggatcaga aaaaacgcag 30
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
ggatcccata tgttgaatgg acca 24
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
aagcttaggt gttttgtatt ggtgg 25
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
aagcttatct tctagcaact attgatcgt 29
<210> 49
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
aagcttagtt cactgcagct cttctagc 28
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
aagcttacaa tgacgttttc gatataacta 30
<210> 51
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
aagcttagat atctcgatta tattgcattt c 31
<210> 52
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
aagcttaaat tgagtttgca aacttaaat 29
<210> 53
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
aagcttacca tttataccct agtccacc 28
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
aagcttaata gtttgctggt ttgaatga 28
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
aagcttattc ctctccatca cgtatatatg 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
aagcttaatt cactgaacat gttgtatgtg 30
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
aagcttatcc tccgttatag ttgaagtc 28
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
aagcttaacg tgatattaca aagtcagttg 30
<210> 59
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
aagcttatac ataagagttc tcttttataa cttc 34
<210> 60
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
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<210> 61
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
aagcttataa tgatctcaca tataccatgt tt 32
<210> 62
<211> 29
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 62
aagcttatgc acatgtcact tcatttaag 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
aagcttaaac tggtagttgg aaattataag ta 32
<210> 64
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
aagcttatga gccaccactc atcaca 26
<210> 65
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
aagcttataa cgttactcca gctgaac 27
<210> 66
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
aagcttataa tgacacaaag tctgtaaatt g 31
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
aagcttatgc taaactgaac ctaaatctta 30
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
aagcttacct tgaaatagag aatggcg 27
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
aagcttacgg taacccatat aaccct 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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aagcttagaa gtctcttcca ttatttgga 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
aagcttaaat taatgaaaat ctacccgc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
agatctaagc ttatgatggt actaataaaa ttaatgaaaa tc 42
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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agatctaagc ttaagtttga taatcatcat ttgatggtac ta 42
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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agatctaagc ttactgcctc tctaagtcct gtctca 36
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 83
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<400> 84
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
aagcttatga tggcactaat gatataagt 29
<210> 87
<211> 776
<212> PRT
<213> 轮状病毒毒株 SA11
<400> 87
Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Thr Val
1 5 10 15
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Asn Tyr Asp Ser Val Asn Met Thr Ala Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile
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Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Leu Ser Leu Thr Ala
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Arg Asp Val Ile His Tyr Arg Ala Gln Ala Asn Glu Asp Ile Val Ile
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Ile Arg Phe Lys Phe Ala Asn Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu Gly
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Tyr Thr Arg Asp Gly Glu Glu Val Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val
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Asn Gly Val Asn Asp Phe Ser Phe Asn Gly Gly Ser Leu Pro Thr Asp
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Ile Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Gln Ala Phe Arg Asn Val Met Tyr Val
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Ala Val Ser Leu His Ser Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr
405 410 415
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Glu Glu Pro His Phe Lys Leu Thr Arg Thr Arg Leu Asp Arg Leu Tyr
435 440 445
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450 455 460
Ala Gly Arg Phe Ser Leu Ile Ser Leu Val Pro Ser Asn Asp Asp Tyr
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Gln Thr Pro Ile Ala Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Ser Met Phe Ser Gly Ile Lys Ser Thr Ile Asp Ala Ala Lys Ser Met
530 535 540
Ala Thr Asn Val Met Lys Lys Phe Lys Lys Ser Gly Leu Ala Asn Ser
545 550 555 560
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565 570 575
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595 600 605
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Leu Lys Thr Lys Ile Asp Lys Ser Thr Gln Ile Ser Pro Asn Thr Ile
645 650 655
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705 710 715 720
Ile Ile Asp Phe Lys Thr Leu Lys Asn Leu Asn Asp Asn Tyr Gly Ile
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Thr Lys Gln Gln Ala Phe Asn Leu Leu Arg Ser Asp Pro Arg Val Leu
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755 760 765
Gln Leu Ile Met Gln Cys Arg Leu
770 775
<210> 88
<211> 774
<212> PRT
<213> 轮状病毒毒株 EDIM
<400> 88
Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Phe Thr Val
1 5 10 15
Asp Ile Ser Asp Glu Ile Glu Thr Ile Gly Ala Glu Lys Thr Gln Asn
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Asn Trp Gly Pro Gly Glu Thr Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val
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65 70 75 80
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Asn Thr Val Asn Arg Trp Ile Ala Ile Ile Ala Ile Glu Pro Asn Val
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Asn Ile Phe Asn Leu Thr Ala His Cys Asp Phe Tyr Ile Ile Pro Trp
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Ile Ile Thr Gln Arg Ala Gln Ala Asn Glu Asp Ile Val Val Ser Lys
245 250 255
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Phe Lys Phe Ala Asn Ala Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu Gly Tyr Lys
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305 310 315 320
Val Asn Asn Phe Asp Phe Phe Gly Gly Ser Leu Pro Thr Asp Phe Gly
325 330 335
Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Phe Val Tyr Ile Asp
340 345 350
Tyr Trp Asp Asp Ser Gln Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg Ser
355 360 365
Leu Ala Ala Asp Leu Asn Thr Val Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr Ser
370 375 380
Phe Ser Leu Pro Val Gly Gln Trp Pro Val Met Thr Gly Gly Ala Val
385 390 395 400
Ser Leu Arg Ala Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr Asp Phe
405 410 415
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Pro Ser Phe Ser Ile Thr Arg Thr Arg Val Ser Gly Leu Tyr Gly Leu
435 440 445
Pro Ala Ala Asp Pro Asn Asn Gly Arg Glu Tyr Tyr Glu Ile Ala Gly
450 455 460
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465 470 475 480
Pro Ile Met Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg Gln Leu
485 490 495
Gly Glu Leu Arg Glu Glu Phe Asn Ala Leu Ser Gln Glu Ile Ala Leu
500 505 510
Ser Gln Leu Val Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe Ser Met
515 520 525
Phe Ser Gly Ile Lys Ala Thr Leu Asp Val Ala Lys Ser Met Ala Thr
530 535 540
Asn Val Met Lys Lys Phe Lys Lys Ser Gly Leu Ala Thr Ser Ile Ser
545 550 555 560
Ala Met Thr Glu Ser Leu Ser Asp Ala Ala Ser Ser Val Ser Arg Ser
565 570 575
Gly Ala Ile Arg Ser Val Ser Ser Thr Ser Ser Ala Trp Thr Asp Val
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Gln Thr Glu Gly Met Asn Phe Asp Asp Ile Ser Ala Ala Val Leu Lys
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Thr Lys Leu Asp Lys Ser Val Arg Ile Ala Pro Asn Thr Leu Pro Asp
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Val Ile Asn Asn Asn Glu Ala Phe Glu Thr Gly Thr Asp Gly Arg Phe
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Lys Phe Ala Asp Leu Val Ala Glu Ser Pro Val Ile Ser Ala Ile Ile
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Glu Gln Ala Phe Ser Leu Leu Arg Ser Asp Pro Arg Val Leu Arg Glu
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Phe Ile Asn Gln Gly Asn Pro Ile Ile Arg Asn Arg Ile Glu Gln Leu
755 760 765
Ile Met Gln Cys Arg Leu
770
<210> 89
<211> 775
<212> PRT
<213> 轮状病毒基因型 P[4]
<400> 89
Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Ser Val
1 5 10 15
Asp Leu His Asp Glu Ile Glu Gln Ile Gly Ser Glu Lys Thr Gln Asn
20 25 30
Val Thr Val Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Pro Val
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Asn Trp Gly His Gly Glu Ile Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val
50 55 60
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65 70 75 80
Trp Leu Leu Ile Ser Ser Asn Thr Asp Gly Val Val Tyr Glu Ser Thr
85 90 95
Asn Asn Ser Asp Phe Trp Thr Ala Val Ile Ala Val Glu Pro His Val
100 105 110
Ser Gln Thr Asn Arg Gln Tyr Val Leu Phe Gly Glu Asn Lys Gln Phe
115 120 125
Asn Ile Glu Asn Ser Ser Asp Lys Trp Lys Phe Leu Glu Met Phe Arg
130 135 140
Gly Ser Gly Gln Ser Asp Phe Ser Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Asn
145 150 155 160
Asn Arg Leu Val Gly Met Leu Lys Tyr Gly Gly Arg Val Trp Thr Phe
165 170 175
His Gly Glu Thr Pro Arg Ala Thr Thr Asp Ser Ser Asn Thr Ala Asp
180 185 190
Leu Asn Asn Ile Ser Ile Ile Ile His Ser Glu Phe Tyr Ile Ile Pro
195 200 205
Arg Ser Gln Glu Ser Lys Cys Asn Glu Tyr Ile Asn Asn Gly Leu Pro
210 215 220
Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Leu Ser Leu Ser Ser Arg
225 230 235 240
Ser Ile Gln Tyr Arg Arg Ala Gln Val Asn Glu Asp Ile Thr Ile Ser
245 250 255
Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met Gln Tyr Asn Arg Asp Ile Ile Ile
260 265 270
Arg Phe Lys Phe Gly Asn Ser Val Ile Lys Leu Gly Gly Leu Gly Tyr
275 280 285
Lys Trp Ser Glu Ile Ser Tyr Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Ser Tyr
290 295 300
Ser Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val Asn
305 310 315 320
Gly Val Asn Asn Phe Ser Tyr Asn Gly Gly Ser Leu Pro Thr Asp Phe
325 330 335
Ser Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Ile
340 345 350
Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Lys Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg
355 360 365
Ser Leu Ala Ala Asn Leu Asn Ser Val Lys Cys Val Gly Gly Ser Tyr
370 375 380
Asp Phe Arg Leu Pro Val Gly Glu Trp Pro Ile Met Asn Gly Gly Ala
385 390 395 400
Val Ser Leu His Phe Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr Asp
405 410 415
Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Ser Leu Thr Val Asp
420 425 430
Glu Pro Ser Phe Ser Ile Ile Arg Thr Arg Thr Met Asn Leu Tyr Gly
435 440 445
Leu Pro Ala Ala Asn Pro Asn Asn Gly Asn Glu Tyr Tyr Glu Val Ser
450 455 460
Gly Arg Phe Ser Leu Ile Ser Leu Val Pro Thr Asn Asp Asp Tyr Gln
465 470 475 480
Thr Pro Ile Met Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg Gln
485 490 495
Leu Asn Asp Leu Arg Glu Glu Phe Asn Ser Leu Ser Gln Glu Ile Ala
500 505 510
Met Ser Gln Leu Ile Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe Ser
515 520 525
Met Phe Ser Gly Ile Lys Ser Thr Ile Asp Leu Thr Lys Ser Met Ala
530 535 540
Thr Ser Val Met Lys Lys Phe Arg Lys Ser Lys Leu Ala Thr Ser Ile
545 550 555 560
Ser Glu Met Thr Asn Ser Leu Ser Asp Ala Ala Ser Ser Ala Ser Arg
565 570 575
Ser Ala Ser Ile Arg Ser Asn Leu Ser Thr Ile Ser Asn Trp Ser Asp
580 585 590
Ala Ser Lys Ser Val Leu Asn Val Thr Asp Ser Val Asn Asp Val Ser
595 600 605
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610 615 620
Thr Gln Thr Glu Gly Ile Ser Phe Asp Asp Ile Ser Ala Ala Val Leu
625 630 635 640
Lys Thr Lys Ile Asp Met Ser Thr Gln Ile Gly Lys Asn Thr Leu Pro
645 650 655
Asp Ile Val Thr Glu Ala Ser Glu Lys Phe Ile Pro Lys Arg Ser Tyr
660 665 670
Arg Val Leu Lys Asp Asp Glu Val Met Glu Val Asn Thr Glu Gly Lys
675 680 685
Phe Phe Ala Tyr Lys Val Asp Thr Leu Asn Glu Ile Pro Phe Asp Ile
690 695 700
Asn Lys Phe Ala Glu Leu Val Thr Asp Ser Pro Val Ile Ser Ala Ile
705 710 715 720
Ile Asp Phe Lys Thr Leu Lys Asn Leu Asn Asp Asn Tyr Gly Ile Thr
725 730 735
Arg Ile Glu Ala Leu Asn Leu Ile Lys Ser Asn Pro Asn Val Leu Arg
740 745 750
Asn Phe Ile Asn Gln Asn Asn Pro Ile Ile Arg Asn Arg Ile Glu Gln
755 760 765
Leu Ile Leu Gln Cys Lys Leu
770 775
<210> 90
<211> 775
<212> PRT
<213> 轮状病毒基因型 P[6]
<400> 90
Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Thr Val
1 5 10 15
Glu Leu Ser Asp Glu Ile Asn Thr Ile Gly Ser Glu Lys Ser Gln Asn
20 25 30
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Trp Ile Leu Leu Asn Pro Thr Asn Gln Gln Val Val Leu Glu Gly Thr
85 90 95
Asn Lys Thr Asp Ile Trp Val Ala Leu Leu Leu Val Glu Pro Asn Val
100 105 110
Thr Asn Gln Ser Arg Gln Tyr Thr Leu Phe Gly Glu Thr Lys Gln Ile
115 120 125
Thr Val Glu Asn Asn Thr Asn Lys Trp Lys Phe Phe Glu Met Phe Arg
130 135 140
Ser Asn Val Asn Ala Glu Phe Gln His Lys Arg Thr Leu Thr Ser Asp
145 150 155 160
Thr Lys Leu Ala Gly Phe Met Lys Phe Tyr Asn Ser Val Trp Thr Phe
165 170 175
His Gly Glu Thr Pro His Ala Thr Thr Asp Tyr Ser Ser Thr Ser Asn
180 185 190
Leu Ser Glu Val Glu Thr Val Ile His Val Glu Phe Tyr Ile Ile Pro
195 200 205
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Ser Val Thr Tyr Gln Arg Ala Gln Val Asn Glu Asp Ile Ile Ile Ser
245 250 255
Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met Gln Tyr Asn Arg Asp Ile Ile Ile
260 265 270
Arg Phe Lys Phe Asn Asn Ser Ile Val Lys Leu Gly Gly Leu Gly Tyr
275 280 285
Lys Trp Ser Glu Ile Ser Phe Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Ser Tyr
290 295 300
Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val Asn
305 310 315 320
Gly Val Asn Asn Phe Ser Tyr Asn Gly Gly Ser Leu Pro Thr Asp Phe
325 330 335
Ser Val Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Val
340 345 350
Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Gln Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg
355 360 365
Ser Leu Ala Ala Asn Leu Asn Ser Val Lys Cys Ser Gly Gly Asn Tyr
370 375 380
Asn Phe Gln Ile Pro Val Gly Ala Trp Pro Val Met Ser Gly Gly Ala
385 390 395 400
Val Ser Leu His Phe Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr Asp
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Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Ser Leu Thr Val Glu
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Glu Pro Pro Phe Ser Ile Leu Arg Thr Arg Val Ser Gly Leu Tyr Gly
435 440 445
Leu Pro Ala Phe Asn Pro Asn Asn Gly His Glu Tyr Tyr Glu Ile Ala
450 455 460
Gly Arg Phe Ser Leu Ile Ser Leu Val Pro Ser Asn Asp Asp Tyr Gln
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Thr Pro Ile Met Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg Gln
485 490 495
Leu Gly Asp Leu Arg Glu Glu Phe Asn Ser Leu Ser Gln Glu Ile Ala
500 505 510
Met Thr Gln Leu Ile Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe Ser
515 520 525
Met Phe Ser Gly Ile Lys Ser Thr Ile Asp Val Ala Lys Ser Met Val
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595 600 605
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