一种牛骨胶原蛋白肽及其生产方法
阅读说明：本技术 一种牛骨胶原蛋白肽及其生产方法 (Bovine bone collagen peptide and production method thereof ) 是由 王朝辉 于 2021-02-02 设计创作，主要内容包括：本发明属于胶原蛋白肽领域,一种牛骨胶原蛋白肽及其生产方法,生产方法包括以下步骤：(1)原料前处理；(2)原料纯化；(3)乙酸溶液震摇浸提；(4)一次酶解；(5)二次酶解；(6)活性碳过滤；(7)无机纳滤陶瓷膜过滤；(8)浓缩；(9)喷雾干燥。本发明充分利用牛类加工副产物牛骨制备胶原蛋白肽,成本低廉,胶原提取率大于85％；制备的牦牛骨胶原蛋白寡肽为白色或淡黄色粉末,纯度大于90％,分子量小于1000Da,无异味；本发明将牛骨制备成骨粉后,利用NaOH溶液、正己烷溶液和乙二胺四乙酸二钠盐浓缩溶液纯化可以将牛骨泥中的非胶原物质、脂肪和钙质基本分离去除,制备的活性肽产品不粘结,基本不含脂肪、胆固醇等杂质。(The invention belongs to the field of collagen peptide, and relates to bovine bone collagen peptide and a production method thereof, wherein the production method comprises the following steps: (1) pretreating raw materials; (2) purifying raw materials; (3) shaking and leaching the acetic acid solution; (4) carrying out primary enzymolysis; (5) carrying out secondary enzymolysis; (6) filtering with activated carbon; (7) filtering with inorganic nanofiltration ceramic membrane; (8) concentrating; (9) and (5) spray drying. The invention fully utilizes the byproducts of the processing of cattle, namely the ox bone, to prepare the collagen peptide, has low cost, and the extraction rate of the collagen is more than 85 percent; the prepared yak bone collagen oligopeptide is white or faint yellow powder, the purity is more than 90%, the molecular weight is less than 1000Da, and no peculiar smell exists; according to the invention, after the ox bone is prepared into bone powder, the non-collagen substance, fat and calcium in the ox bone paste can be basically separated and removed by using NaOH solution, n-hexane solution and ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt concentrated solution for purification, and the prepared active peptide product is not sticky and basically does not contain impurities such as fat, cholesterol and the like.)
技术领域
本发明属于胶原蛋白肽领域，特别涉及一种牛骨胶原蛋白肽及其生产方法。
背景技术
胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸。胶原蛋白是一种高分子功能性蛋白质，它是皮肤的主要组成部分，占皮肤真皮层80％的比重，它在皮肤中构成了一张细密的弹力网，牢固锁住水分，支撑着皮肤。胶原蛋白是由三条肽链拧成的螺旋纤维状蛋白质，也是人体内含量最丰富的蛋白质，广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏细胞间质及肌腔、韧带、巩膜等部位，大约占人体总蛋白质的30％以上，它富含人体需要的脯氨酸、羟脯氨酸等胶原蛋白特征氨基酸，是人体细胞特别是肌肤细胞外基质中重要组成部分。胶原蛋白是大分子蛋白质，其分子量在300,000Da以上，不能被人体直接吸收。
胶原蛋白肽是胶原蛋白水解的产物，为介于氨基酸和大分子蛋白质之间的物质，两个或以上的氨基酸脱水缩合形成若干个肽键从而组成一个肽，多个肽进行多级折叠就组成一个蛋白质分子。肽是精准的蛋白质片段，其分子只有纳米大小。现代研究表明，肽较蛋白质而言，更易于消化吸收、能迅速给机体提供能量、无蛋白质变性、低过敏性、良好的水溶性等特点，并具有多重生物活性功能。其中，从牛骨中提取的胶原蛋白肽经酶解后所得到的牛骨胶原蛋白肽在增加骨密度、预防与治疗骨关节炎和骨质疏松、抑制血管紧张 素转化酶活性、抑制血小板凝集活性、抗氧化活性、抗肿瘤活性等多方面具有特别的功能作用。
中国发明专利申请(CN201510556199.0)公开了一种牛骨胶原蛋白肽的制备方法，它涉及一种蛋白肽的制备方法。本发明的主要目的是通过对牛骨先后采用两次破碎、二次复煮、高温蒸煮和超滤膜浓缩技术并结合特定的复合酶制剂，解决现有生产工艺制备牛骨胶原蛋白肽提取率低下，易褐变，能耗大，生产周期长的问题。方法：一、筛选；二、一次破碎；三、二次破碎；四、清洗；五、高温提取；六、二次复煮；七、过滤分离；八、液液分离；九、酶解；十、杀菌灭酶；十一、固液分离；十二、超滤膜浓缩，十三、喷雾干燥；十四、包装，即得到牛骨胶原蛋白肽。
中国发明专利申请(CN201710823158.2)公开了牛骨胶原蛋白肽提取方法。包含如下步骤，一、破骨；二、上料清洗；三、上料蒸煮、排汤；四、水解过滤；五、浓缩；六、干燥喷粉。上述的方法获得的牛骨胶原蛋白肽提取率不够，而且小分子活性多肽不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单安全、易于操作、成本低、生产的产品纯度高的牛骨胶原蛋白肽及其生产方法，以充分利用牛类加工的副产物，变废为宝，开发具有广阔应用前景的牛骨胶原蛋白肽。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种牛骨胶原蛋白肽的生产方法，包括以下步骤：
（1）原料前处理：将牛骨先除去骨头上的杂质，再利用碎骨机粉碎至2～3cm的骨块，之后将经过粉碎后的牛骨清洗干净，粉碎至50目；
（2）原料纯化：粉碎后的牛骨粉置于其质量18～20倍的0.1mol/L NaOH溶液中, 在温度为3～5℃条件下震摇1～3小时，以脱除非胶原物质，经过滤后用蒸馏水反复洗涤骨样至中性，经沥干后按料液比1:6～8置于浓度10％正己烷溶液中, 在温度为3～5℃条件下震摇脱脂1～3小时，以脱除脂肪，经过滤后用蒸馏水反复洗涤骨样至中性，经沥干后按料液比1:8～10加入0.25mol/L乙二胺四乙酸二钠盐浓缩溶液中，在温度为3～5℃条件下震摇脱钙1～3小时，以脱除钙质，再经冷冻干燥得到纯化牛骨粉；
（3）将所述纯化牛骨粉按料液比1:8～10置于0.5mol/L乙酸溶液中，在温度为3～5℃条件下震摇浸提10-20h，离心收集上清液，得到牛骨胶原蛋白溶液；
（4）一次酶解：调节所述牛骨胶原蛋白溶液的pH至7～9，并加入骨胶原蛋白酶进行进行超声辅助酶解，一次酶解温度为50℃-55℃，一次酶解时间为1h-3h，骨胶原蛋白酶的加入量为牛骨胶原蛋白质量的0.1％-0.3％；酶解结束后升温至 80～85℃，恒温10～20min灭酶，得到一次酶解液；
（5）二次酶解：调节所述一次酶解液的pH至5～7，并加入二次复合酶进行超声辅助酶解，所述二次复合酶采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，待二次酶解反应结束，得到二次酶解液；对所述二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到灭酶酶解液；
（6）活性碳过滤：向灭酶酶解液中加入活性碳，活性碳的加入量为其质量的2％-4％，将灭酶酶解液升温至80℃-100℃，并保温 5min-10min；然后降温至70℃-80℃，通过硅藻土分离，脱色并去除腥味，得到酶解液；
（7）无机纳滤陶瓷膜过滤：将活性碳过滤后的所述酶解液采用截留分子量为800Da的无机纳滤陶瓷膜进行过滤，所得透过液为高纯度牛骨胶原蛋白肽溶液；
（8）浓缩：物料温度控制在55～65℃，在0.06～0.08Mpa真空度下，每批打入浓缩器的物料浓缩时间不超过30分钟，浓缩至波美度20～22Bé，浓缩液进入浓缩液贮存罐暂存；
(9)喷雾干燥：物料温度45～50℃，波美度20～22Bé，喷雾塔进风温度调节在180～190℃范围，出风温度在85～95℃范围，干燥成粉。
进一步的，步骤（7）中所述无机纳滤陶瓷膜的滤芯采用硅质、铝质、镁质、硅铝质和硅镁质中的任意一种材料制作而成。在酶解之后采用无机纳滤陶瓷膜过滤的技术手段，去除不易溶解的物质和易吸潮的糖类成分，提高最终得到的胶原蛋白肽成品的水复溶性，并且成品储藏过程中不易吸潮结块。无机纳滤陶瓷膜与有机纳滤膜相比，具有耐有机溶剂、耐高温、耐酸碱、机械强度高、通量大和寿命长的优势。本发明只需采用一次纳滤膜处理，比既需要采用超滤膜截留大分子物质、又需要采用纳滤膜脱盐浓缩的现有技术相比，显著简化工艺步骤，并且膜处理的作用不同。
进一步的，所述的方法生产得到的牛骨胶原蛋白肽。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）本发明充分利用牛类加工副产物牛骨制备胶原蛋白肽，成本低廉，胶原提取率大于 85％；制备的牦牛骨胶原蛋白寡肽为白色或淡黄色粉末，纯度大于90％，分子量小于 1000Da，无异味；
（2）本发明将牛骨制备成骨粉后，利用NaOH溶液、正己烷溶液和乙二胺四乙酸二钠盐浓缩溶液纯化可以将牛骨泥中的非胶原物质、脂肪和钙质基本分离去除，制备的活性肽产品不粘结，基本不含脂肪、胆固醇等杂质；
（3）采用二次酶解协同活性炭过滤、无机纳滤陶瓷膜过滤纯化牛骨胶原蛋白肽，除杂和浓缩效果好，适合规模化工业生产。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
一种牛骨胶原蛋白肽的生产方法，包括以下步骤：
（1）原料前处理：将牛骨先除去骨头上的杂质，再利用碎骨机粉碎至2cm的骨块，之后将经过粉碎后的牛骨清洗干净，粉碎至50目；
（2）原料纯化：粉碎后的牛骨粉置于其质量18倍的0.1mol/L NaOH溶液中, 在温度为3℃条件下震摇3小时，以脱除非胶原物质，经过滤后用蒸馏水反复洗涤骨样至中性，经沥干后按料液比1:6置于浓度10％正己烷溶液中, 在温度为3℃条件下震摇脱脂3小时，以脱除脂肪，经过滤后用蒸馏水反复洗涤骨样至中性，经沥干后按料液比1:8加入0.25mol/L乙二胺四乙酸二钠盐浓缩溶液中，在温度为3℃条件下震摇脱钙3小时，以脱除钙质，再经冷冻干燥得到纯化牛骨粉；
（3）将所述纯化牛骨粉按料液比1:8置于0.5mol/L乙酸溶液中，在温度为3条件下震摇浸提20h，离心收集上清液，得到牛骨胶原蛋白溶液；
（4）一次酶解：调节所述牛骨胶原蛋白溶液的pH至7，并加入骨胶原蛋白酶进行进行超声辅助酶解，一次酶解温度为50℃，一次酶解时间为3h，骨胶原蛋白酶的加入量为牛骨胶原蛋白质量的0.1％；酶解结束后升温至 80℃，恒温10min灭酶，得到一次酶解液；
（5）二次酶解：调节所述一次酶解液的pH至5，并加入二次复合酶进行超声辅助酶解，所述二次复合酶采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，待二次酶解反应结束，得到二次酶解液；对所述二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到灭酶酶解液；
（6）活性碳过滤：向灭酶酶解液中加入活性碳，活性碳的加入量为其质量的2％，将灭酶酶解液升温至80℃，并保温 5min；然后降温至70℃，通过硅藻土分离，脱色并去除腥味，得到酶解液；
（7）无机纳滤陶瓷膜过滤：将活性碳过滤后的所述酶解液采用截留分子量为800Da的无机纳滤陶瓷膜进行过滤，所得透过液为高纯度牛骨胶原蛋白肽溶液；
（8）浓缩：物料温度控制在55℃，在0.06Mpa真空度下，每批打入浓缩器的物料浓缩时间不超过30分钟，浓缩至波美度20Bé，浓缩液进入浓缩液贮存罐暂存；
(9)喷雾干燥：物料温度45℃，波美度20Bé，喷雾塔进风温度调节在180℃范围，出风温度在85℃范围，干燥成粉。
步骤（7）中所述无机纳滤陶瓷膜的滤芯采用硅质、铝质、镁质、硅铝质和硅镁质中的任意一种材料制作而成。
实施例2
一种牛骨胶原蛋白肽的生产方法，包括以下步骤：
（1）原料前处理：将牛骨先除去骨头上的杂质，再利用碎骨机粉碎至2cm的骨块，之后将经过粉碎后的牛骨清洗干净，粉碎至50目；
（2）原料纯化：粉碎后的牛骨粉置于其质量20倍的0.1mol/L NaOH溶液中, 在温度为4℃条件下震摇3小时，以脱除非胶原物质，经过滤后用蒸馏水反复洗涤骨样至中性，经沥干后按料液比1:7置于浓度10％正己烷溶液中, 在温度为4℃条件下震摇脱脂3小时，以脱除脂肪，经过滤后用蒸馏水反复洗涤骨样至中性，经沥干后按料液比1:8加入0.25mol/L乙二胺四乙酸二钠盐浓缩溶液中，在温度为4℃条件下震摇脱钙3小时，以脱除钙质，再经冷冻干燥得到纯化牛骨粉；
（3）将所述纯化牛骨粉按料液比1:8置于0.5mol/L乙酸溶液中，在温度为4℃条件下震摇浸提20h，离心收集上清液，得到牛骨胶原蛋白溶液；
（4）一次酶解：调节所述牛骨胶原蛋白溶液的pH至8，并加入骨胶原蛋白酶进行进行超声辅助酶解，一次酶解温度为53℃，一次酶解时间为3h，骨胶原蛋白酶的加入量为牛骨胶原蛋白质量的0.1％；酶解结束后升温至 83℃，恒温20min灭酶，得到一次酶解液；
（5）二次酶解：调节所述一次酶解液的pH至6，并加入二次复合酶进行超声辅助酶解，所述二次复合酶采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，待二次酶解反应结束，得到二次酶解液；对所述二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到灭酶酶解液；
（6）活性碳过滤：向灭酶酶解液中加入活性碳，活性碳的加入量为其质量的3％，将灭酶酶解液升温至90℃，并保温10min；然后降温至80℃，通过硅藻土分离，脱色并去除腥味，得到酶解液；
（7）无机纳滤陶瓷膜过滤：将活性碳过滤后的所述酶解液采用截留分子量为800Da的无机纳滤陶瓷膜进行过滤，所得透过液为高纯度牛骨胶原蛋白肽溶液；
（8）浓缩：物料温度控制在60℃，在0.07Mpa真空度下，每批打入浓缩器的物料浓缩时间不超过30分钟，浓缩至波美度21Bé，浓缩液进入浓缩液贮存罐暂存；
(9)喷雾干燥：物料温度47℃，波美度21Bé，喷雾塔进风温度调节在185℃范围，出风温度在90℃范围，干燥成粉。
步骤（7）中所述无机纳滤陶瓷膜的滤芯采用硅质、铝质、镁质、硅铝质和硅镁质中的任意一种材料制作而成。
实施例3
一种牛骨胶原蛋白肽的生产方法，包括以下步骤：
（1）原料前处理：将牛骨先除去骨头上的杂质，再利用碎骨机粉碎至2cm的骨块，之后将经过粉碎后的牛骨清洗干净，粉碎至50目；
（2）原料纯化：粉碎后的牛骨粉置于其质量20倍的0.1mol/L NaOH溶液中, 在温度为5℃条件下震摇3小时，以脱除非胶原物质，经过滤后用蒸馏水反复洗涤骨样至中性，经沥干后按料液比1: 8置于浓度10％正己烷溶液中, 在温度为5℃条件下震摇脱脂3小时，以脱除脂肪，经过滤后用蒸馏水反复洗涤骨样至中性，经沥干后按料液比1: 10加入0.25mol/L乙二胺四乙酸二钠盐浓缩溶液中，在温度为5℃条件下震摇脱钙3小时，以脱除钙质，再经冷冻干燥得到纯化牛骨粉；
（3）将所述纯化牛骨粉按料液比1: 10置于0.5mol/L乙酸溶液中，在温度为5℃条件下震摇浸提20h，离心收集上清液，得到牛骨胶原蛋白溶液；
（4）一次酶解：调节所述牛骨胶原蛋白溶液的pH至9，并加入骨胶原蛋白酶进行进行超声辅助酶解，一次酶解温度为55℃，一次酶解时间为3h，骨胶原蛋白酶的加入量为牛骨胶原蛋白质量的0.3％；酶解结束后升温至 85℃，恒温20min灭酶，得到一次酶解液；
（5）二次酶解：调节所述一次酶解液的pH至7，并加入二次复合酶进行超声辅助酶解，所述二次复合酶采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，待二次酶解反应结束，得到二次酶解液；对所述二次酶解液进行微波灭酶处理，待微波灭酶结束，得到灭酶酶解液；
（6）活性碳过滤：向灭酶酶解液中加入活性碳，活性碳的加入量为其质量的4％，将灭酶酶解液升温至100℃，并保温 10min；然后降温至80℃，通过硅藻土分离，脱色并去除腥味，得到酶解液；
（7）无机纳滤陶瓷膜过滤：将活性碳过滤后的所述酶解液采用截留分子量为800Da的无机纳滤陶瓷膜进行过滤，所得透过液为高纯度牛骨胶原蛋白肽溶液；
（8）浓缩：物料温度控制在65℃，在0.08Mpa真空度下，每批打入浓缩器的物料浓缩时间不超过30分钟，浓缩至波美度22Bé，浓缩液进入浓缩液贮存罐暂存；
(9)喷雾干燥：物料温度50℃，波美度22Bé，喷雾塔进风温度调节在190℃范围，出风温度在95℃范围，干燥成粉。
步骤（7）中所述无机纳滤陶瓷膜的滤芯采用硅质、铝质、镁质、硅铝质和硅镁质中的任意一种材料制作而成。
(1)高效率复配酶制剂酶解效果检测：
实施例1～3中，牛骨经过原料前处理、油水分离后，利用高效率复配酶制剂在不调节pH值、不控制温度条件下进行酶解，为了评估酶解效果，酶解结束后，采用《中华人民共和国国家标准GB/T 22729-2008》附录A中的方法进行酶解产物检测，结果如下表1所示：
表1
由表1的结果可知，实施例1～3的酶解产物分子量小且集中，酶解产物游离氨基酸含量低(小于200Da的比例小于5％)，分子量小于1000Da的胶原蛋白肽比例达到了100％，介于200～1000Da的胶原蛋白肽比例达到了95％以上。由此可以说明，采用本发明提供的特定两次酶解、高效率复合酶酶解的组合技术手段，能够显著提高酶解胶原蛋白的酶解效率。
(2)牛骨胶原蛋白肽成品的水复溶性和牛骨胶原蛋白肽溶液的透光率检测：
分别将实施例1～3获得的牛骨胶原蛋白肽成品粉末8g倒入不同杯中，用300mL 60℃左右温开水冲调，1s时间内即全部溶解，得到牛骨胶原蛋白肽溶解液，肉眼观察溶解液澄清透明、无任何沉淀。使用紫外分光光度计在620nm下检测以上几种牛骨胶原蛋白肽溶解液的透光率，结果如下表4所示：
表2
实施例1
实施例2
实施例3
项目透光率(％)
96
94
95
由表2的结果可知，采用无机纳滤陶瓷膜过滤的技术手段，去除不易溶解的物质，再采用肽溶液的高温高压处理的技术手段，进一步提高成品的溶解性能，使得获得的牛骨胶原蛋白肽成品极易溶于水、水复溶性极佳，溶于水后的溶解液澄清透明、无任何沉淀、透光率高，消费者冲泡此产品时，不需搅拌，食用方便、食用体验佳。
(3)牛骨胶原蛋白肽成品的货架期试验：
分别将实施例1～3获得的牛骨胶原蛋白肽成品粉末8g倒入包装袋中，室温敞口放置于室内展架上，肉眼观察成品出现结块的时间，结果如下表3所示：
表3
实施例1
实施例2
实施例3
项目出现结块的时间(天)
56
54
53
现有技术生产的牛骨胶原蛋白肽在贮藏过程中，容易吸潮结块，影响产品的销售。由表3的结果可知，本发明采用无机纳滤陶瓷膜过滤的技术手段，可以去除易吸潮的糖类成分，使得成品储藏过程中不易吸潮结块，易于储藏，是现有技术达不到的技术效果。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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