一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法
阅读说明：本技术 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法 (Preparation method of nicotinamide adenine dinucleotide ) 是由 李斌 张超 刘发光 张晨晨 翁秋景 缪朱玲 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法,所述制备方法包括：向电渗析槽中加入烟酰胺单核苷酸、三磷酸腺苷、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和水,开启电渗析设备,进行反应。所述制备方法通过电渗析法将反应的副产物焦磷酸从反应体系中移除,从而打破反应平衡,促使反应向正反应方向进行,能够提高产物NAD+的生成率,并降低反应后处理的难度。(The invention provides a preparation method of nicotinamide adenine dinucleotide, which comprises the following steps: adding nicotinamide mononucleotide, adenosine triphosphate, nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase and water into an electrodialysis tank, and starting an electrodialysis device to perform reaction. According to the preparation method, the by-product pyrophosphoric acid generated in the reaction is removed from the reaction system through an electrodialysis method, so that the reaction balance is broken, the reaction is promoted to be carried out in the positive reaction direction, the generation rate of the product NAD + can be improved, and the difficulty in post-reaction treatment is reduced.)
技术领域
本发明属于制药技术领域，涉及一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)是一种传递质子的辅酶，参与物质代谢、能量合成和DNA修复等多种生理活动，对机体免疫能力亦有重要作用。有研究表明，有多种疾病与机体内NAD+浓度失衡有关。
目前，NAD+已被广泛用于治疗疾病，其合成方法主要有化学法、化学酶法和生物发酵法。化学法反应路线长，且需使用昂贵的试剂和大量有机溶剂，因此，化学酶法和生物发酵法常被用于工业化生产NAD+。
吕晓群等(吕小群，张偌瑜，徐学文，等。烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的表达、纯化及活性测定[J]。第二军医大学学报，2010(11):1251-1254。)提出了一种利用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)催化烟酰胺单核苷酸合成NAD+的方法，即能够催化烟酰胺单核苷酸(NMN)和三磷酸腺苷(ATP)一步合成NAD+，但反应转化率较低，造成原料浪费且增加后处理难度。
Rodríguez(Luis Ernesto Contreras Rodríguez,Mathias Ziegler,MaríaHelena Ramírez Hernández.Kinetic and oligomeric study of Leishmaniabraziliensis nicotinate/nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase[J].Heliyon,2020,e03733.)等报道NMNAT催化NMN和ATP合成NAD+的反应为可逆反应，反应生成NMN同时，还会生成副产物焦磷酸，当反应体系中焦磷酸达到一定的浓度，反应会达到平衡，从而不利于NMN彻底转化为NAD+。
Lu(Dongmei Lu,Guiqiu Xie,Renjun Gao Cloning,purification,andcharacterization of inorganic pyrophosphatase from the hyperthermophilicarchaea Pyrococcus horikoshii[J].Protein Expression and Purification,2014,99:94-98.)等采用焦磷酸酶分解焦磷酸，从而去除NMNAT催化NMN和ATP合成NAD+的反应中的焦磷酸，促进反应向合成NAD+的方向进行，但额外添加焦磷酸酶提高了成本，同时也会产生其它副产物，降低了NAD+的收率，并增加了后处理难度。
综上所述，提供一种工艺简单、成本低且能够达到较高转化率的制备方法，对于NAD+制备领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，所述制备方法操作简单，能够提高反应的转化率，降低反应后处理的难度。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，所述制备方法包括：
向电渗析槽中加入烟酰胺单核苷酸、三磷酸腺苷、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和水，开启电渗析设备，进行反应，得到所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
本发明中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)可通过烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase，NMNAT)催化烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)合成，本发明的制备方法通过电渗析法，将反应的副产物焦磷酸从反应体系中移除，从而打破反应平衡，促使反应向正反应方向进行，提高了反应的产物NAD+的生成率，焦磷酸的去除，降低了反应后处理的难度，有利于提高产物分离纯化收率。
优选地，所述烟酰胺单核苷酸、三磷酸腺苷、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和水的质量比为1:(0.7～2.0):(0.1～10.0):(20～200)，包括但不限于1:0.9:0.2:25、1:1.2:0.3:40、1:1.5:1.5:60、1:1.6:5.5:100、1:1.7:7.5:150或1:1.9:9.5:180。
本发明中，通过控制烟酰胺单核苷酸和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的质量比为1:(0.1～10.0)，不仅能高效催化烟酰胺单核苷酸和三磷酸腺苷合成烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶，还能避免无意义的过量使用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶而造成的浪费。
优选地，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶包括固定化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶。
本发明中，采用物理或化学方法将烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶改造为固定化酶，改造后的固定化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶不溶于水但仍具有酶活性，在含有高浓度NMN和ATP的空间范围内高效催化合成NAD+，一定程度上提高了NAD的合成效率。所需固定化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的制备方法包括以下步骤：
(1)将测序验证的重组质粒(Nmnat-pET28a+)转化到感受态细胞中，并涂布于LB(100μg/mL)卡那霉素琼脂糖平板，37℃孵育过夜；
(2)将阳性克隆接种于含卡那霉素(75μg/mL)和氯霉素(37μg/mL)的2×YT或TB培养液中，37℃、200r/min振荡培养过夜后，按1:20比例稀释到含相同抗生素的培养液中，培养至OD600为0.6时，加入IPTG，于28℃或37℃进行诱导；
(3)取1mL菌液，13400×g离心1min收集菌体，菌体重悬在裂解缓冲液(20mmol/LTris-HCl，pH 7.5，2mM Mg2+和0.7mM Mn2+)中，200W超声裂解细胞，超声1s间隙9s，共超声30min。将裂解液于4℃、15000×g离心50min，收集上清液，以体积比为1:1与海藻酸钠溶液混匀，在搅拌条件下，使用注射器将其缓慢加入至0.2mol/L NaCl、0.2mol/L CaCl2溶液中，控制颗粒直径为2～3mm，搅拌45min以上，过滤收集颗粒并置于0.2mol/L NaCl、0.2mol/LCaCl2溶液中，4℃保存备用，使用时，过滤得到固定化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶。
优选地，所述反应的搅拌转速为100～300rpm，包括但不限于120rpm、150rpm、180rpm、200rpm、240rpm、260rpm或280rpm。
优选地，所述反应的温度为20～40℃，包括但不限于21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。
优选地，所述反应的时间为4～25h，包括但不限于5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h。
优选地，所述电渗析设备的开启方式为持续开启。
优选地，所述电渗析设备的开启方式为间隔开启。
优选地，所述间隔开启的间隔时间为1～2h，包括但不限于1.2h、1.4h、1.6h或1.8h。
优选地，所述间隔开启的持续时间为1～2h，包括但不限于1.2h、1.4h、1.6h或1.8h。
优选地，所述电渗析槽中反应体系的pH值为5～7。
优选地，所述反应体系的电导率小于10000μs/cm，包括但不限于8000μs/cm、7000μs/cm、6000μs/cm、5000μs/cm、3000μs/cm或2500μs/cm，优选为3000～5000μs/cm。
作为优选的技术方案，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法包括：
向电渗析槽中加入烟酰胺单核苷酸、三磷酸腺苷和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和水，所述烟酰胺单核苷酸、三磷酸腺苷和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和水的质量比为1:(0.7～2.0):(0.1～10.0):(20～200)，持续开启电渗析设备，反应器中反应体系的电导率小于10000μs/cm，pH为5～7，于20～40℃、100～300rpm下反应4～25h，得到所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
作为优选的技术方案，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法包括：
向电渗析槽中加入烟酰胺单核苷酸、三磷酸腺苷和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和水，所述烟酰胺单核苷酸、三磷酸腺苷和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和水的质量比为1:(0.7～2.0):(0.1～10.0):(20～200)，间隔开启电渗析设备，间隔时间为1～2h，开启的持续时间为1～2h，控制反应器中反应体系的电导率小于10000μs/cm，pH为5～7，于20～40℃、100～300rpm下反应4～25h，得到所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明的制备方法，通过电渗析法将反应的副产物焦磷酸从反应体系中移除，从而打破反应平衡，促使反应向正反应方向进行，提高了反应产物NAD+的生成率，产物NAD+的生成率高于73.5％，最高为96％；
(2)本发明进一步通过控制反应器中反应体系的pH为5～7、电导率为3000～5000μs/cm，电渗析设备持续开启或间隔1～2h开启，提高了产物NAD+的生成，产物NAD+的生成率高于92％，此外，焦磷酸的去除，降低了后处理的难度；
(3)本发明的制备方法操作简单，转化率高且产物容易分离，在制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为开启电渗析设备前的反应液中焦磷酸检测结果；
图2为开启电渗析设备后的反应液中焦磷酸检测结果；
图3为分离槽中溶液中的焦磷酸检测结果。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明实施例中的电渗析装置为杭州蓝然环境技术股份有限公司EX-10电渗析实验装置。
固定化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的制备方法包括以下步骤：
(1)将测序验证的重组质粒(Nmnat-pET28a+)转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布于LB(100μg/mL)卡那霉素琼脂糖平板，37℃孵育过夜，所述重组质粒的序列参考吕晓群等(吕小群，张偌瑜，徐学文，等。烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的表达、纯化及活性测定[J]。第二军医大学学报，2010(11):1251-1254。)的研究；
(2)将阳性克隆接种于含75μg/mL卡那霉素和37μg/mL氯霉素的2×YT培养液中，37℃、200r/min振荡培养过夜后，按1:20比例稀释到含相同抗生素的2×YT培养液中，培养至OD600为0.6时，加入IPTG，于37℃进行诱导；
(3)取1mL诱导后菌液，13400×g离心1min收集菌体，将菌体重悬于20mmol/LTris-HCl(pH 7.5，含有2mM Mg2+和0.7mM Mn2+)中，200W超声裂解细胞，超声1s间隙9s，共超声30min，将裂解液于4℃、15000×g离心50min，收集上清液，以体积比为1:1与海藻酸钠溶液混匀，在搅拌条件下，使用注射器将混合后溶液缓慢加入0.2mol/L NaCl、0.2mol/LCaCl2溶液中，控制颗粒直径为2～3mm，搅拌45min，过滤收集颗粒并置于0.2mol/L NaCl、0.2mol/L CaCl2溶液中，4℃保存备用，使用时，过滤得到固定化烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(固定化NMNAT)。
高效液相色谱条件：NUCLEODUER C18 Pyramid，4.6mm×250mm，5μm；流速1.0mL/min，260nm紫外检测，柱温：30℃，进样体积：10μL，流动相：0.1％TFA。
实施例1
本实施例提供一种NAD+的制备方法，所述制备方法包括：
向电渗析槽中加入4L水、80g NMN和120g ATP，100rpm、25℃下加入20g固定化NMNAT，开启电渗析设备，控制pH值为5.0±0.2，除去反应产生的焦磷酸，电渗析设备持续开启，并保持反应池中反应体系的电导率为3000μs/cm；反应15h，取样并使用高效液相色谱(HPLC)检测产物NAD+生成率。
产物NAD+生成率如表1所示。
实施例2
本实施例提供一种NAD+的制备方法，所述制备方法包括：
向电渗析槽中加入4L水、80g NMN和120g ATP，300rpm、20℃下加入20g固定化NMNAT，开启电渗析设备，控制pH值为6.0±0.2，除去反应产生的焦磷酸，电渗析设备每间隔1h开启，每次运行时间持续1h，并保持反应池中反应体系的电导率为4000μs/cm；反应25h，取样并使用高效液相色谱(HPLC)检测产物NAD+生成率。反应液经过滤回收固定化酶(可套用)，滤液经过纳滤浓缩，析晶，得到产品NAD+纯度为99.1％。
产物NAD+生成率如表1所示。
实施例3
本实施例提供一种NAD的制备方法，所述制备方法包括：
向电渗析槽中加入4L水、20g NMN和40g ATP，300rpm、35℃下加入200g NMNAT，开启电渗析设备，控制pH值为7.0±0.2，除去反应产生的焦磷酸，电渗析设备每间隔2h开启，每次运行时间持续2h，并保持反应池中反应体系的电导率为5000μs/cm；反应8h，取样并使用高效液相色谱(HPLC)检测产物NAD+生成率。
产物NAD+生成率如表1所示。
实施例4
本实施例提供一种NAD+的制备方法，所述制备方法包括：
向电渗析槽中加入4L水、200g NMN和140g ATP，300rpm、40℃下加入20g固定化NMNAT，开启电渗析设备，控制pH值为4.0±0.2，除去反应产生的焦磷酸，电渗析设备每间隔1.5h开启，每次运行时间持续1.5h，并保持反应池中反应体系的电导率为3000μs/cm；反应4h，取样并使用高效液相色谱(HPLC)检测产物NAD+生成率。
产物NAD+生成率如表1所示。
实施例5
与实施例1相比，区别仅在于步骤(2)中控制pH值为8.0±0.2，其它与实施例1相同。
实施例6
与实施例1相比，区别仅在于步骤(2)中控制电导率为8000μs/cm，其它与实施例1相同。
实施例7
与实施例1相比，区别仅在于步骤(2)中控制电导率为7000μs/cm，其它与实施例1相同。
实施例8
与实施例1相比，区别仅在于步骤(2)中控制电导率为6000μs/cm，其它与实施例1相同。
实施例9
与实施例2相比，区别仅在于步骤(2)电渗析设备间隔3h开启，其它与实施例2相同。
对比例1
本对比例提供一种NAD+的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)向反应池中加入4L水、80g NMN和120g ATP，300rpm、20℃下加入20g固定化NMNAT，控制pH值为6.0±0.2；
(2)反应25h，取样并使用高效液相色谱(HPLC)检测产物NAD+生成率。
产物NAD+生成率如表1所示。
表1
编号
产物NAD+生成率
实施例1
95％
实施例2
96％
实施例3
92％
实施例4
78％
实施例5
74.7％
实施例6
73.5％
实施例7
82％
实施例8
86.7％
实施例9
84.8％
对比例1
62％
如表1所示，实施例1-9中采用电渗析法，产物NAD+生成率均高于73.5％，最高为96％，而对比例未采用电渗析法，产物NAD+生成率仅为62％，说明本发明通过电渗析法，将反应的副产物焦磷酸从反应体系中移除，从而打破反应平衡，促使反应向正反应方向进行，提高了反应产物NAD+的生成率。
实施例1-3中控制反应器中反应体系的pH为5～7、电导率为3000～5000μs/cm，电渗析设备持续开启或间隔1～2h开启，反应产物NAD+的生成率高于92％，与之相比，实施例4和实施例5中未控制反应器中反应体系的pH为5～7，反应产物NAD+的生成率较低，最高仅为78％；实施例6-8中未控制反应器中反应体系的电导率为3000～5000μs/cm，产物NAD+的生成率最高仅为86.7％；实施例9中未控制电渗析设备持续开启或间隔1～2h开启，产物NAD+的生成率为84.8％；综合上述表明，本发明通过控制反应器中反应体系的pH、电导率以及电渗析设备的开启方式，能够进一步提高产物NAD+的生成率。
试验例1
本试验例对电渗析设备去除反应体系中焦磷酸的效果进行检测。
以实施例1为例，电渗析设备具有多个槽，在一个槽中加入各反应原料，进行反应，该槽为反应槽，开启电渗析设备后，反应槽中的焦磷酸会被转移到相邻的槽中，该槽为分离槽。分别取10mL开启电渗析设备前的反应液、10mL开启电渗析设备后的反应液以及10mL电渗析设备分离槽中的溶液，分别滴入1滴0.1％硝酸银溶液，观察溶液浑浊状况。
开启电渗析设备前的反应液，溶液浑浊(如图1所示)，表明反应液中存在高浓度焦磷酸，开启电渗析设备后的反应液，溶液澄清(如图2所示)，表明其中不含或含有较低浓度的焦磷酸，分离槽中的溶液，溶液浑浊(如图3所示)，表明其中含有高浓度焦磷酸，综合上述表明，本发明使用电渗析法能够有效将反应体系中的焦磷酸移除。
综上所述，本发明的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，通过电渗析法将酶反应与移除副产物焦磷酸偶联在一起，从而打破反应平衡，促使反应向正反应方向进行，提高了反应产物NAD+的生成率，产物NAD+的生成率高于73.5％，最高为96％，降低了后处理的难度，在制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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