一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法
阅读说明：本技术 一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法 (Preparation method of beta-nicotinamide ribodinucleotide ) 是由 王杰 颜祥飞 彭文静 李卓 王姝昕 宋辉 冯晓燕 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物酶催化制备领域,具体涉及一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法。该方法首先通过高密度发酵法制备烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶,然后烟酰胺核糖和ATP在烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶作用下生产β-烟酰胺核糖二核苷酸。本发明提供制备烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的高密度发酵方法,方法中使用发酵培养基中含有适合大肠杆菌生长的必需元素,在诱导剂IPTG的作用下,使得大肠杆菌在发酵培养基中良好生长并且能够高产烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶,酶活比较高。本发明提供β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法效率高,操作简单,收率高,使用的烟酰胺核糖和ATP是常见的原料,成本低,适合产业化生产。(The invention relates to the field of bio-enzyme catalytic preparation, and in particular relates to a preparation method of beta-nicotinamide ribodinucleotide. The method comprises the steps of firstly preparing nicotinamide ribokinase and nicotinamide mononucleotide transferase by a high-density fermentation method, and then producing beta-nicotinamide ribodinucleotide by nicotinamide ribose and ATP under the action of the nicotinamide ribokinase and the nicotinamide mononucleotide transferase. The invention provides a high-density fermentation method for preparing nicotinamide ribokinase and nicotinamide mononucleotide transferase, which uses a fermentation culture medium containing essential elements suitable for growth of escherichia coli, enables the escherichia coli to grow well in the fermentation culture medium under the action of an inducer IPTG, can produce high-yield nicotinamide ribokinase and nicotinamide mononucleotide transferase, and has high enzyme activity. The preparation method of the beta-nicotinamide riboside provided by the invention has the advantages of high efficiency, simple operation and high yield, and the used nicotinamide riboside and ATP are common raw materials, so that the cost is low, and the preparation method is suitable for industrial production.)
技术领域
本发明涉及生物酶催化制备领域，具体涉及一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法。
背景技术
在目前所有发现的酶中，约有30-35%为氧化还原酶。在工业生物技术，特别是生物药物和精细化工行业中，氧化还原酶是重要的酶类。在氧化还原酶所催化的反应中，生成产物的同时接需要消耗一定的辅酶以进行电子和质子的转移。据统计约80%的反应需要以烟酰胺核糖二核苷酸即氧化型辅酶I（简称NAD +）作为辅酶，NAD +中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，又名氧化型辅酶II，(NADP + )是一种重要的辅酶。氧化型辅酶II通过氧化还原反应的形式传递质子、电子及能量，并且参与到细胞很多代谢反应中，脂类、脂肪酸和核苷酸的合成，能活化多酶系统，促进核酸、蛋白质、多糖的合成及代谢，提高物质转运和调节控制，改善代谢功能。研究表明，氧化型辅酶II能促进物质代谢、能量代谢、抵抗细胞衰老和抗氧化作用。
NAD+在生物中广泛存在，但含量极低，从生物中提取的NAD+每公斤市场价格在数万元。工业化生产中使用NAD+ ，但其生产方法较少。目前NAD+的化学法和生物酶法。化学法以烟酰胺核糖为原料，同样会用到昂贵试剂和易爆试剂，成本高还会发生事故。生物酶催化因为其固有的高效率、绿色环保等优点逐渐成为工业制备烟酰胺核糖二核苷酸(NAD+)的主流方法，但现有的生物酶法操作复杂，并且收率不高。
发明内容
针对现有技术关于β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法存在操作复杂且收率不高的问题，本发明的目的是提供一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法，具体包括以下步骤。
步骤一、将大肠杆菌接种到LB的固体培养基在37℃的条件下培养12～18h，得到含有大肠杆菌的固体斜面。
步骤二、将含有大肠杆菌的斜面接种量接入经过灭菌的种子液中，在温度为37℃，摇床转速为180～200r/min的条件下，培养至OD600为3.2时，摇瓶种子液长好。
步骤三、通过高密度发酵法制备烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶，发酵培养基是由以下质量百分比的原料组成：蛋白胨1.0-2.0%、酵母浸粉0.2-1.0%、磷酸二氢钾0.05-0.15%、磷酸氢二钾0.03-0.10%、甘油0.5-1.0%、硫酸镁0.05-0.2%、消泡剂0.05-0.10%、其余是饮用水；培养基使用蒸汽灭菌后，分别接种含有烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶基因的大肠杆菌，温度33-37℃，通气量3-10L/min，搅拌是300-600rpm，在发酵罐里培养5-6小时加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG 0.5g诱导，继续培养15～22小时，得到培养液。
步骤四、分别把步骤三中两种培养液经过离心取菌体，使用0.2-0.6MPa压力匀浆破碎后过滤取滤液，把滤液使用中空膜过滤浓缩得到酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的酶浓缩液。
步骤五、把烟酰胺核糖34g、ATP 100g和8-16g氯化镁溶解到2L纯化水里，分别加入步骤四中烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的酶浓缩液20-80g，温度控制在30-37℃，过程使用氢氧化钠溶液控制pH6.40-6.60之间，检测烟酰胺核糖的残留和生成的β-烟酰胺核糖二核苷酸，在酶的作用下在4小时之内烟酰胺核糖残留在0.02g/L以下，生成的β-烟酰胺核糖二核苷酸达到浓度最高。
步骤六、反应液经过后处理超滤﹑纳滤﹑树脂吸附洗脱和结晶得到产品。
进一步地，步骤三中的发酵培养基是由以下质量百分比的原料组成：蛋白胨1.0-1.5%、酵母浸粉0.5-0.8%、磷酸二氢钾0.05-0.10%、磷酸氢二钾0.05-0.08%、甘油0.5-0.8%、硫酸镁0.10-0.15%、消泡剂0.05-0.08%、其余为水。
进一步地，步骤五中加入氯化镁的量是10-15g。
进一步地，步骤五中加入烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的酶浓缩液的量为30-60g。
进一步地，步骤五中温度控制为35-37℃。
进一步地，步骤五中pH控制在6.45-6.55。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
本发明提供的制备β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法中的烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的酶活性高，能使烟酰胺核糖和ATP迅速转化成β-烟酰胺核糖二核苷酸，转化率高，生产的NAD+纯度高，发酵工艺简单，提取也容易，成本低，容易工业化生产。
本发明供的发酵培养基及用该发酵培养基发酵烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的方法，该发酵培养基中含有适合大肠杆菌生长的必需元素，在诱导剂IPTG的作用下，使得大肠杆菌在该发酵培养基中良好生长并且能够高产烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶，酶活比较高，该培养基成分简单、成本低、运用前景广阔，该发酵方法简单实用，易于操作。
本发明提供了烟酰胺核糖二核苷酸的酶反应方法，该方法效率高，操作简单，收率高，使用的烟酰胺核糖和ATP是常见的原料，成本低，能产业化。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面结合具体实施例进行进一步阐述，但下述实施例不限制本发明的保护范围。在以下各实施例中，未详细阐述的各实验过程和方法为本领域公知的常规手段。
实施例1 酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的发酵方法。
酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的发酵方法，具体步骤如下。
步骤一、将大肠杆菌接种到LB的固体培养基在37℃的条件下培养14h，得到含有大肠杆菌的固体斜面。
步骤二、将含有大肠杆菌的斜面接种量接入经过灭菌的种子液中，在温度为37℃，摇床转速为200r/min的条件下，培养至OD600为3.2时，摇瓶种子液长好。
步骤三、按发酵培养基蛋白胨1.5%、酵母浸粉0.5%、磷酸二氢钾0.10%、磷酸氢二钾0.05%、甘油0.5%、硫酸镁0.10%、消泡剂0.05%、其余是饮用水配制到10L罐里，按6.0L计料配制，使用蒸汽灭菌121-123℃30min，把长好的摇瓶种子液接种到发酵罐里，接种量150ml，罐温33-37℃，罐压0.03-0.06MPa,通气量3-10L/min转速300-600rpm，培养到6小时时加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG 0.5g诱导剂，培养周期22小时。放罐时OD600nm=56。
步骤四、把步骤3得到的培养液通过离心后，丢弃上清液，取菌体使用匀浆机使用0.4Mpa压力匀浆破碎后过滤，用纯化水洗2遍菌体，合并过滤液。然后通过分子量是20000的中空膜浓缩，得到烟酰胺核糖激酶820ml的粗酶液，按同样的方法得到烟酰胺单核苷酸转移酶850ml的粗酶液。
两种酶酶活的检测方法：使用ATP 2g和烟酰胺核糖0.68g，硫酸镁0.14g，使用50ml定容，加入两种酶液各1ml，过程控制温度37℃，过程使用0.4g/L的氢氧化钠溶液控制pH6.40-6.50之间，1小时后检测降温至20℃以下，使用盐酸调至pH3.8-4.0,离心后检测烟酰胺残留，上述两种酶的酶活=消耗的烟酰胺核糖毫克数。上述两种酶的酶活是300。
实施例2酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的发酵方法。
酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的发酵方法，具体步骤如下。
步骤一、将大肠杆菌接种到LB的固体培养基在37℃的条件下培养14h，得到含有大肠杆菌的固体斜面。
步骤二、将含有大肠杆菌的斜面接种量接入经过灭菌的种子液中，在温度为37℃，摇床转速为200r/min的条件下，培养至OD600为3.2时，摇瓶种子液长好。
步骤三、按发酵培养基蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.8%、磷酸二氢钾0.10%、磷酸氢二钾0.05%、甘油0.8%、硫酸镁0.10%、消泡剂0.05%、其余是饮用水，配制到10L罐里，按6.0L计料配制，使用蒸汽灭菌121-123℃ 30min，把长好的摇瓶种子液接种到发酵罐里，接种量150ml，罐温33-37℃，罐压0.03-0.06MPa，通气量3-10L/min，转速300-600rpm，培养到5-6小时时加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG 0.5g诱导剂，培养周期22小时。放罐时OD600nm=65。
步骤四、把步骤3得到的培养液通过离心后，丢弃上清液，取菌体使用匀浆机使用0.4Mpa压力匀浆破碎后过滤，用纯化水洗2遍菌体，合并过滤液。然后通过分子量是20000的中空膜浓缩，得到烟酰胺核糖激酶850ml的粗酶液。按同样的方法得到烟酰胺单核苷酸转移酶900ml的粗酶液。
两种酶酶活的检测方法：使用ATP 2g和烟酰胺核糖0.68g，硫酸镁0.14g，使用50ml定容，加入两种酶液各1ml，过程控制温度37℃，过程使用0.4g/L的氢氧化钠溶液控制pH6.40-6.50之间，1小时后检测降温至20℃以下，使用盐酸调至pH3.8-4.0离心后检测烟酰胺残留，上述两种酶的酶活=消耗的烟酰胺核糖毫克数。上述两种酶的酶活是360。
实施例3 烟酰胺核糖二核苷酸的酶反应方法。
烟酰胺核糖和ATP在烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶作用下生产β-烟酰胺核糖二核苷酸。
步骤一、把烟酰胺核糖34g、ATP 100g和10-15g氯化镁溶解到2L纯化水里，温度控制在36.0-37.0℃，使用4%的氢氧化钠溶液调pH6.50，然后加入烟酰胺核糖激酶浓缩液30g和烟酰胺单核苷酸转移酶浓缩液30g，过程使用4%氢氧化钠溶液控制pH6.40-6.50，过程使用高效液相检测烟酰胺核糖的残留和生成的β-烟酰胺核糖二核苷酸，烟酰胺核糖低于0.02g/L，转化率超过99.5%，4小时反应结束，降温至20℃以下，使用10%盐酸调节pH3.8-4.0，反应终止。
步骤二、反应液通抽滤后得到滤液，滤液经过5000分子量的超滤膜得到透过液，透过液再经过500分子量的纳滤得到β-烟酰胺核糖二核苷酸的浓缩液。
步骤三、β-烟酰胺核糖二核苷酸的浓缩液经过树脂吸附洗脱后，得到纯度在98.0%以上的洗脱液，再经过浓缩结晶烘干后得到纯度在98.5%的高纯度产品。
实施例4 烟酰胺核糖二核苷酸的酶反应方法。
烟酰胺核糖和ATP在烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶作用下生产β-烟酰胺核糖二核苷酸。
步骤一、把烟酰胺核糖34g、ATP 100g和10-15g氯化镁溶解到2L纯化水里，温度控制在36.0-37.0℃，使用4%的氢氧化钠溶液调pH6.50，然后加入烟酰胺核糖激酶浓缩液30g和烟酰胺单核苷酸转移酶浓缩液40g，过程使用4%氢氧化钠溶液控制pH6.40-6.50，过程使用高效液相检测烟酰胺核糖的残留和生成的β-烟酰胺核糖二核苷酸，烟酰胺核糖低于0.02g/L，转化率超过99%，2小时反应结束，降温至20℃以下，使用10%盐酸调节pH3.8-4.0，反应终止。
步骤二、反应液通抽滤后得到滤液，滤液经过5000分子量的超滤膜得到透过液，透过液再经过500分子量的纳滤得到β-烟酰胺核糖二核苷酸的浓缩液。
步骤三、β-烟酰胺核糖二核苷酸的浓缩液经过树脂吸附洗脱后，得到纯度在98%以上的洗脱液，再经过浓缩结晶烘干后得到纯度在99.1%的高纯度产品。
实施例5 烟酰胺核糖二核苷酸的酶反应方法。
烟酰胺核糖和ATP在烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶作用下生产β-烟酰胺核糖二核苷酸。
步骤一、把烟酰胺核糖34g、ATP 100g和10-15g氯化镁溶解到2L纯化水里，温度控制在36.0-37.0℃，使用4%的氢氧化钠溶液调pH6.50，然后加入烟酰胺核糖激酶浓缩液30g和烟酰胺单核苷酸转移酶浓缩液60g，过程使用4%氢氧化钠溶液控制pH6.40-6.50，过程使用高效液相检测烟酰胺核糖的残留和生成的β-烟酰胺核糖二核苷酸，烟酰胺核糖低于0.02g/L，转化率超过99%，3小时反应结束，降温至20℃以下，使用10%盐酸调节pH3.8-4.0，反应终止。
步骤二、反应液通抽滤后得到滤液，滤液经过5000分子量的超滤膜得到透过液，透过液再经过500分子量的纳滤得到β-烟酰胺核糖二核苷酸的浓缩液。
步骤三、β-烟酰胺核糖二核苷酸的浓缩液经过树脂吸附洗脱后，得到纯度在98%以上的洗脱液，再经过浓缩结晶烘干后得到纯度在98.9%的高纯度产品。
实施例一至实施例二提供了一种发酵培养基及用该发酵培养基发酵烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的方法，该发酵培养基中含有适合大肠杆菌生长的必需元素，在诱导剂IPTG的作用下，使得大肠杆菌在该发酵培养基中良好生长并且能够高产烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶，酶活比较高，得出的酶酶活在200以上，在生产时4小时之内反应完毕，该培养基成分简单、成本低、运用前景广阔，该发酵方法简单实用，易于操作。
实施例三至实施例五提供了烟酰胺核糖二核苷酸的酶反应方法，该方法效率高，在4小时之内烟酰胺核糖反应完毕，转化率超过99.5%，操作简单，转化率高，使用的烟酰胺核糖和ATP是常见的原料，成本低，能产业化。