一种应用生物酶法制备nadp的方法
阅读说明：本技术 一种应用生物酶法制备nadp的方法 (Method for preparing NADP by applying biological enzyme method ) 是由 王康林 汪晓东 王磊 金永红 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物制药领域,具体涉及应用生物酶制备烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的方法。所述方法包括建立应用生物酶制备烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的酶促反应体系,所述生物酶选自NAD激酶,所述NAD激酶的CAS号为9032-66-0；所述酶促反应体系还包括NAD、偏磷酸盐、pH调节剂、以及Mg～(2+)和/或Co～(2+)。所述方法还包括取偏磷酸盐、NAD激酶、pH调节剂、以及含Mg～(2+)和/或Co～(2+)的物质定溶,通过连续流加底物的方式进行反应。本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中NADP合成的收率低、生产成本高,以及合成步骤繁琐、生产周期长的问题,提供一种生物酶高效制备NADP的生产方法。其工艺简单、周期短、成本低以及产物收率高,易实现产业化、规模化生产。(The invention relates to the field of biological pharmacy, in particular to a method for preparing nicotinamide adenine dinucleotide phosphate by using biological enzyme. The method comprises the steps of establishing an enzymatic reaction system for preparing nicotinamide adenine dinucleotide phosphate by using a biological enzyme, wherein the biological enzyme is selected from NAD kinase, and the CAS number of the NAD kinase is 9032-66-0; the enzymatic reaction system further comprises NAD, metaphosphate, pH regulator, and Mg 2+ And/or Co 2+ . The method further comprises taking metaphosphate, NAD kinase, pH regulator, and Mg 2+ And/or Co 2+ The substance (2) is dissolved and reacted by continuously feeding the substrate. The invention aims to solve the technical problems of low yield, high production cost, complex synthesis steps and long production period of NADP synthesis in the prior art, and provides a production method for efficiently preparing NADP by using biological enzyme. The method has the advantages of simple process, short period, low cost, high product yield and easy realization of productionIndustrialized and large-scale production.)
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及应用生物酶制剂制备烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的方法。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)又称为三磷酸吡啶核苷酸是一种广泛参与生命体氧化还原代谢及其它一系列生物化学反应的氧化型辅酶，在生物氧化过程中作为氢传递体，以还原态NADPH形式参与脂类，核苷酸以及脂肪酸等合成，是生物体内不可缺少的重要辅酶。研究表明，氧化型辅酶II能促进物质代谢、能量代谢、抵抗细胞衰老和抗氧化作用。
目前NADP的合成方法可以分为化学法、生物发酵法和生物酶法，化学法以烟酰胺为原料，经多步反应合成出NADP，化学法存在反应路线长，反应条件苛刻，选择性差，易生成副产物，产物纯度低，收率低，需用到昂贵的试剂，成本较高等不足，同时，大量有机溶剂的使用还会造成环境污染。因此，该工艺路线不适合于工业化大生产。传统的生物法是采用发酵或其它微生物培养技术，并通过对酵母或其它微生物的分离提取得到NADP。该工艺过程虽然已很成熟，但是原料耗费巨大，劳动强度大，能源消耗大，产量有限，生产成本高，产品价格高，限制了氧化型辅酶II(NADP)的广泛应用。生物酶法合成NADP的研究中，工艺存在以下缺陷：一是原料合成收率低，且不易放大生产，原料来源受到限制；二是酶催化合成NADP只能在克级范围得到高的转化率，且反应时间长，产能低；三是NADP的生产需要在ATP的存在下进行，由于ATP价格昂贵，增加了NADP的生产成本。
酶是一种具有特异性的高效生物催化剂，绝大多数的酶是活细胞产生的蛋白质。酶的催化条件温和，在常温、常压下即可进行。酶催化的反应称为酶促反应，要比相应的非催化反应快103-107倍。酶促反应动力学简称酶动力学，主要研究酶促反应的速度和底物(即反应物)浓度以及其他因素的关系。酶促反应中温度、酸碱度、酶的浓度、底物浓度、抑制剂、激活剂等的选择都会对反应结果和效率产生重大影响。因此，选择合适的生物酶促反应条件至关重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中NADP合成的收率低、生产成本高，以及合成步骤繁琐、生产周期长的问题，提供一种生物酶高效制备NADP的生产方法。其工艺简单、周期短、成本低以及产物收率高，易实现产业化、规模化生产。
本发明的目的是这样实现的：
本发明提供了一种应用生物酶制备烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的方法，
所述方法包括建立应用生物酶制备烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的酶促反应体系，所述生物酶选自NAD激酶，所述NAD激酶的CAS号为9032-66-0；所述酶促反应体系还包括NAD、偏磷酸盐、pH调节剂、以及Mg2+和/或Co2+。
优选地，所述酶促反应体系中的Mg2+为0.01-0.1mol/L和/或Co2+为0.01-0.1mol/L；优选地，所述酶促反应体系中的Mg2+为0.05mol/L和/或Co2+为0.03mol/L。
优选地，所述酶促反应体系中按质量分数计算含NAD 5-15％，和/或偏磷酸盐10-30％，和/或酶底比5:1-50:1，和/或pH调节剂调节酶促反应体系的pH为6.0-8.0。
优选地，所述偏磷酸盐包括三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三偏磷酸钾、四偏磷酸钾、六偏磷酸钾，和/或pH调节剂包括PBS缓冲液、醋酸-醋酸钠、硼酸盐；和/或所述Mg2+选自MgSO4·7H2O，所述Co2+选自CoCl2。
优选地，所述酶促反应体系中按质量分数计算含NAD 10％，和/或偏磷酸盐20％，和/或酶底比30:1，和/或pH调节剂调节组合物pH为7.0。
所述方法具体包括：取偏磷酸盐、NAD激酶、pH调节剂、以及含Mg2+和/或Co2+的物质定溶，通过连续流加底物的方式进行反应。
优选地，所述反应的温度为28-43℃；优选为37℃。
优选地，所述反应中溶液的转速为100-1000r/min；优选为250r/min。
优选地，所述反应的时间为0.5-10h；优选为3h；优选地，所述反应的时间为3h。
本发明通过对NAD激酶酶促机理的研究，筛选添加适宜浓度的酶激活剂，激活酶的活力同时在酶与底物结合时起桥梁作用，大大提高了烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的转化率。另外，本发明用偏磷酸盐代替ATP作为磷酸基团供体，大大降低原料成本，操作简单，反应彻底，易实现产业化、规模化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些图获得其他的附图。
图1不同激活剂及浓度对NAD激酶活力的影响
图2不同NAD添加浓度对酶促反应转化率的影响
图3不同酶底比对酶促反应转化率的影响
图4不同反应温度对酶促反应转化率的影响
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的技术方案：
一种利用生物酶制剂高效制备烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的方法。选用商业化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(NAD激酶，CAS：9032-66-0，北京百奥莱博科技有限公司)，在对其机理研究的基础上，通过筛选添加酶的激活剂，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和偏磷酸盐为原料，在对酶促反应条件如底物浓度、酶底比、激活剂添加量、pH、温度等优化后，获得高效制备烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的方法。
其中，NAD激酶的酶活测定：(1)测定反应体系(100mL)：25mmol/L的底物NAD，110mmol/L的三偏磷酸钠，0.2mol/LpH7.0PBS缓冲液，NAD激酶5g。(2)将按上述体系配制的测定溶液摇匀后，在37℃条件下，以250r/min转速搅拌反应，每1h取样，通过HPLC于280nm下测定NADP峰面积，连续测定10h。以峰面积对时间作图，取反应最初线性部分计算△S值。根据公式计算酶活力。酶活力单位(U)定义为：37℃条件下，每小时催化生成1μmolNADP的酶量为一个单位。计算公式为：
式中：△S为280nmNADP峰面积变化值，S为NADP标准品1g/mL对应峰面积，V为酶促反应体积(mL),743为NADP分子量，m为加入体系中NAD激酶的量(g)。
HPLC检测NADP的含量方法：C18 HPLC色谱柱，150mm×4.6mm；流动相：25mmol/LpH＝7.0Tris-HAC，甲醇；紫外检测器，波长280nm，柱温30℃，流速0.8mL/min，进样量5μL。
实施例1
本实施例说明酶激活剂种类对酶促产烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的影响，向NAD激酶的酶活测定体系中添加不同浓度的Fe3+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+、Co2+等金属离子无机盐。考察其对酶促反应的影响，用相对酶活来确定金属离子的种类和浓度，结果见图1。实验结果表明，添加Mg2+或Co2+对NAD激酶有激活作用，其中Co2+或Mg2+添加分别为0.03mol/L和0.05mol/L时激活作用最好。
实施例2
本实施例说明不同底物浓度对酶促反应产烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的影响，在酶促反应其他条件相同的情况下，具体为：三偏磷酸钠20％，酶底比15：1，Co2+和Mg2+添加分别为0.03mol/L和0.05mol/L，PBS缓冲液(pH＝7.0)定溶，在温度35℃、转速250r/min下反应3h。
NAD添加浓度分别为5％、10％、15％、20％、25％。实验结果表明，当底物浓度为10％时，酶促反应产烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸转化率最高。
实施例3
本实施例说明不同的酶底比对酶促反应产烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的影响，与实施例2类似，在酶促反应其他条件相同的情况下，分别考察酶底比为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1。实验结果表明，当酶底比为30:1时，酶促反应产烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸转化率最高。所述的酶底比指酶活力(U)：NAD(g)。
实施例4
本实施例说明不同的反应温度对酶促反应产烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的影响，与实施例2类似，在酶促反应其他条件相同的情况下，分别考察反应温度为28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃。实验结果表明，当反应温度为37℃时，酶促反应产烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸转化率最高。
实施例5
取50g NAD，三偏磷酸钠100g，24g NAD激酶，MgSO4·7H2O 0.025mol，CoCl20.015mol，PBS缓冲液(pH＝7.0)定溶至500mL，在温度37℃、转速250r/min下反应3h，体系中烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸浓度达到85g/L，转化率为85％。
实施例6
取150g NAD，三偏磷酸钠300g，72g NAD激酶，MgSO4·7H2O 0.075mol，CoCl20.045mol，PBS缓冲液(pH＝7.0)定溶至1500mL，在温度37℃、转速250r/min下反应3h，体系中烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸浓度达到83g/L，转化率83％左右。
实施例7
取200g NAD，三偏磷酸钠400g，96g NAD激酶，MgSO4·7H2O 0.1mol，CoCl20.06mol，PBS缓冲液(pH＝7.0)定溶至2000mL，在温度37℃、转速250r/min下反应3h，体系中烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸浓度达到70g/L，转化率只有70％左右。
实施例8
三偏磷酸钠400g，96g NAD激酶，MgSO4·7H2O 0.1mol，CoCl2 0.06mol，PBS缓冲液(pH＝7.0)定溶至2000mL，底物通过连续流加方式添加到反应体系中，NAD添加量为200g，在温度37℃、转速250r/min下反应3h，体系中烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸浓度达到95g/L，转化率达到95％左右。
实施例9
三偏磷酸钠2800g，672g NAD激酶，MgSO4·7H2O 0.7mol，CoCl2 0.42mol，PBS缓冲液(pH＝7.0)定溶至14L，底物通过连续流加方式添加到反应体系中，NAD添加量为1400g，在温度37℃、转速250r/min下反应3h，体系中烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸浓度达到98g/L，转化率达到98.5％左右。
通过实施例5-9结果可知，随着底物NAD添加量的增加，其对酶促反应的抑制作用增强，当体系中一次性添加量达到200g时存在显著抑制作用，导致酶促反应转化率显著下降。本发明通过改变底物添加方式，采用连续流加的方式，避免底物对反应的抑制作用，保持较高转化率，实现产业化生产。
另外，通过上述实施例，可以得知Mg2+、Co2+对酶有较好的激活作用，当添加0.05mol/L Mg2+和0.03mol/L Co2+时激活作用最显著。同时，关于酶促反应体系最优条件为：NAD 10％，三偏磷酸钠20％，酶底比30：1，0.05mol/L Mg2+，0.03mol/L Co2+，PBS缓冲液(pH＝7.0)定溶，在温度37℃、转速250r/min下通过连续流加底物反应3h，烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸转化率最高可达98.5％左右。
本发明通过对NAD激酶酶促机理的研究，筛选添加适宜浓度的酶激活剂，激活酶的活力同时在酶与底物结合时起桥梁作用，在此基础上，通过对酶促反应温度、底物浓度、酶底比、底物添加方式等优化后，烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸浓度达到98g/L，转化率达到98.5％左右，是目前文献报道的最高水平。通过酶激活剂的作用构筑酶促反应通道，将酶促反应时间缩短至3h，同时将底物添加方式改为连续流加避免底物对反应的抑制作用，实现了体系放大后高转化率生产。
另外，本发明用偏磷酸盐代替ATP作为磷酸基团供体，大大降低原料成本，操作简单，反应彻底，易实现产业化、规模化生产。
本发明的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些实例中，并未详细示出公知的方法、结构和技术，以便不模糊对本说明书的理解。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。