纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法及其产品和应用
阅读说明：本技术 纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法及其产品和应用 (Preparation method of nano-particle bionic enzyme sensitive element, product and application thereof ) 是由 李长明 邹卓 杨鸿斌 于 2020-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法及其产品和应用,将二维纳米材料分散于溶剂中,加入含有过渡金属源的乙酸盐在一定温度下水浴一定时间,冷冻干燥去除溶剂；将得到的产物与六元杂环化合物和物质氨基酸研磨成均匀混合物,然后再惰性气氛中热解,冷却得到纳米颗粒仿生酶敏感元件；将制得的敏感元件制成传感器后不仅具有极短的响应时间、极高的反应灵敏度、较低的检测限,还具有优异的选择性；能够在实时检测活细胞释放的超氧阴离子自由基方面有重要的应用前景,该材料性能突出、取材方便,利于商业化应用。(The invention discloses a preparation method of a nano-particle bionic enzyme sensitive element and a product and application thereof.A two-dimensional nano material is dispersed in a solvent, acetate containing a transition metal source is added for water bath for a certain time at a certain temperature, and the solvent is removed by freeze drying; grinding the obtained product, a six-membered heterocyclic compound and amino acid serving as a substance into a uniform mixture, then pyrolyzing the mixture in an inert atmosphere, and cooling the mixture to obtain a nanoparticle bionic enzyme sensitive element; the prepared sensitive element is made into a sensor, so that the sensor not only has extremely short response time, extremely high reaction sensitivity and lower detection limit, but also has excellent selectivity; the material has important application prospect in the aspect of detecting superoxide anion free radicals released by living cells in real time, has outstanding performance and convenient material acquisition, and is beneficial to commercial application.)
技术领域
本发明涉及材料技术领域，具体涉及纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法，还涉及由该方法制得额产品和应用，以及利用纳米颗粒仿生酶敏感元件制得的电化学传感器。
背景技术
超氧阴离子(O2 .-)是氧分子受单一电子还原的产物，也是细胞在氧代谢过程中最先形成的自由基，其它所有活性氧(ROS)都是从O2 .-衍生而来的。O2 .-的浓度波动与诸多生物学过程和疾病的发生发展密切相关。正常生理状态下，O2 .-在细胞内的浓度会被控制在较低的范围内并保持相对稳定的动态平衡，能协助细胞进行正常的生长和新陈代谢，且具有独特的生理作用。其生理作用主要包括参与抗感染免疫；协助清除褪变、突变和衰老的细胞；参与合成前列腺素、甲状腺素和凝血酶原；参与药物和毒物的解毒等。适度水平下，O2 .-在细胞内的浓度降低或升高，会导致细胞产生一些瞬间变化，包括生殖能力减弱及防御能力降低等。与此同时，细胞也会启动自我修复和调节机制，不会产生不可逆损伤。但是当细胞产生过量O2 .-时，会导致一系列毒副作用，对细胞造成不可逆的氧化损伤并对特定信号通路产生影响，包括引起自由基失活、损伤脱氧核糖核酸(DNA)、造成基因突变、对氨基酸及蛋白质造成损伤、以及其他生物分子的损伤等。这些毒副作用对机体的影响进一步引起生理病变，包括生物体的衰老、神经元退变疾病、心血管疾病、癌症等。因此，对活细胞释放的O2 .-进行定量检测，不仅能更全面了解其在细胞生理活动中的作用，更有助于我们揭示与其相关疾病的发生机制，从而提供在病理学认知下的可靠疾病诊断。
然而，O2 .-的细胞释放浓度很低且活性极高，对其定性定量检测十分困难。在诸多检测方法中，电化学方法表现出响应快、灵敏度高、操作简易、成本低等优点，非常适合在避免对活细胞新陈代谢和相关生理活动造成破坏的前提下，用于对活细胞实时释放O2 .-的浓度检测。因此，设计合成具有高灵敏度、高选择性、低检测限、成本低廉的O2 .-电化学生物传感器成为目前研究的重点和难点之一。传统O2 .-电化学传感器的敏感元件主要依赖于天然生物酶，而生物酶存在极易受到温度、湿度和pH等影响而导致其丧失催化活性的问题，且其成本相对较高。所以，开发基于仿生酶的新型O2 .-电化学传感器更具现实意义。
由于超氧化物歧化酶(SOD)是O2 .-的专一性酶，所以基于SOD构建的O2 .-电化学传感器能表现出优于其他生物酶的抗干扰能力，但其价格昂贵、产量低且易失活，故而关于能够有效替代SOD的仿生酶的研发，已成为多学科交叉的重点研究问题。近年来，科学家发现通过模仿天然酶的结合位点或活性位点，可以实现对基于仿生酶的电化学传感器的构建，尤其是结合了纳米科技的新型特殊纳米结构仿生酶，能够在生理条件下催化酶底物的反应，具有如同天然酶一样的催化效率和酶促反应动力性质。
设计高性能的仿生酶敏感元件是实现O2 .-电化学传感器更高灵敏度和选择性的关键因素。据报道，将金属分散在碳纳米材料上是一种有效的仿生酶制备方法。因此，有理由推断金属纳米颗粒修饰的杂原子掺杂碳纳米材料在改善O2 ·-氧化催化反应方面具有巨大的潜力。然而，由于这类材料通常具有高表面能，如何构建出化学稳定的此类材料仍然是一个难题。更重要的是，金属纳米颗粒修饰的原子掺杂碳纳米材料的电子结构难以捉摸，这阻碍了人们对此类材料的理解。因此，亟需开发一种新型纳米颗粒仿生酶敏感元件，用其构建电化学传感器并应用到活细胞受药物刺激释放O2 ·-的检测中。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法；本发明的目的之二在于提供由所述方法制得的纳米颗粒仿生酶敏感元件；本发明的目的之三在于提供所述纳米颗粒仿生酶敏感元件在制备检测活细胞释放超氧阴离子自由基电化学传感器中的应用；本发明的目的之四在于提供基于所述的纳米颗粒仿生酶敏感元件的电化学传感器；本发明的目的之五在于提供所述电化学传感器在检测活细胞释放超氧阴离子自由基中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法，将二维纳米材料分散于溶剂中，加入含有过渡金属源的乙酸盐在使金属离子与二维纳米材料均匀吸附，冷冻干燥去除溶剂；将得到的产物与六元杂环化合物和物质氨基酸均匀混合成混合物，然后再惰性气氛中热解形成碳结构，冷却得到纳米颗粒仿生酶敏感元件。
本发明中，所述溶剂可以为极性溶剂也可以为非剂型溶剂，优选为去离子水；本发明中冷冻干燥除了可以快速去除溶剂，还利于形成多孔结构，将得到的产物与六元杂环化合物和物质氨基酸均匀混合可以采用研磨或球磨，其他可均匀混合的方式也可。
本发明中，所述二维纳米材料为石墨烯、氧化石墨烯、碳纳米管或碳纳米纤维中的一种或多种；所述含过渡金属源的乙酸盐为含钴、镍、锰、铜或铁源的乙酸盐；所述六元杂环化合物为三聚氰胺、吡啶、吡嗪、嘧啶或哒嗪中的一种或多种；所述生物质氨基酸为丝氨酸、半胱氨基酸或丙氨酸中的一种或多种。
本发明中，二维纳米材料、含过渡金属源的乙酸盐和六元杂环化合物的质量比为400：1：200。
本发明中，均匀吸附优选为在水浴条件下，优选的，在80℃下水浴2小时。
本发明中，所述热解是在900℃下热解2小时。
2、由所述方法制得的纳米颗粒仿生酶敏感元件，所述纳米颗粒仿生酶敏感元件为过渡金属原子通过杂原子掺杂固定于纳米材料缺陷结构处。
3、所述纳米颗粒仿生酶敏感元件在制备检测活细胞释放生物活性分子电化学传感器中的应用。
优选的，所述生物活性分子为超氧阴离子自由基、多巴胺、过氧化氢或一氧化氮。根据不同的金属在不同点位下可检测不同物质。金属金、铁等可以测过氧化氢，锰、铜等可以测多巴胺，铁也可以测一氧化氮；铁、钴、镍、锰、铜等都可以测超氧阴离子。
4、所述的纳米颗粒仿生酶敏感元件的电化学传感器，所述电化学传感器的工作电极表面涂敷有所述的纳米颗粒仿生酶敏感元件。
优选的，所述涂敷为将所述纳米颗粒仿生酶敏感元件以0.5-5mg/mL的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将所述电极修饰溶液涂覆到电极上，干燥后再涂覆粘接剂，再次干燥即可。
5、所述电化学传感器在检测活细胞释放生物活性分子中的应用。
本发明的有益效果在于：纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法，根据需检测的物质或分子，进行过渡金属原子种类的优化，从而筛选最佳的过渡金属活性中心以获得高灵敏仿生酶材料。以超氧阴离子为例，提供了一种高灵敏纳米颗粒仿生酶敏感元件及其制备方法和应用；本发明在制备纳米颗粒仿生酶敏感元件，通过合理设定二维纳米材料、含过渡金属源的乙酸盐和六元杂环化合物三者的质量，同时合理选择过渡金属的种类，使以最终制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件为原料构建的电化学传感器不仅具有极短的响应时间、极高的反应灵敏度、较低的检测限，还具有优异的选择性。其中，纳米碳材料的加入可以提高仿生材料的导电性，提升其整体的电子传递性能，选择合适的过渡金属及控制其负载量，可以很好的增强仿生材料的选择性，利用催化剂对碳纳米材料进行改造能够使其更适于负载更大量均匀的金属纳米颗粒，从而使仿生材料具有更多的检测活性位点。以该纳米颗粒仿生酶材料制备的传感器相比于传统材料制备的传感器，在实时定量检测超氧阴离子自由基时，显示出了更高的性能，能够在实时检测活细胞释放的超氧阴离子自由基方面有重要的应用前景。该材料性能突出、取材方便，利于商业化应用。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的TEM图；
图2为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的HRTEM图；
图3为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的电子衍射图；
图4为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的接触角表征图；
图5为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的TEM图；
图6为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的HRTEM图；
图7为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的SEM图；
图8为在电压范围为0.3-1.0V下，实施例1中构建的传感器对O2 ·-的循环伏安响应测试结果图；
图9为在电压范围为0.3-1.0V下，实施例2中构建的传感器对O2 ·-的循环伏安响应测试结果图；
图10为在电压范围为-0.2-0.8V下，实施例3中构建的传感器对O2 ·-的循环伏安响应测试结果图；
图11为实施例1中构建的传感器对O2 ·-的计时电流响应测试结果——相对于Hg/Hg2Cl2参比电极的i-t响应图；
图12为实施例1中构建的传感器对O2 ·-在图11中稳态的电流与O2 ·-浓度之间的线性关系图；
图13为实施例1中构建的传感器对O2 ·-的响应时间图；
图14为实施例1中构建的传感器对不同干扰成分选择性测试结果图；
图15为实施例1中构建的传感器实时检测DU145细胞在酵母多糖(Zym)刺激下释放的O2 ·-时的it曲线图(图15中a为DU145细胞的光学显微镜图像；图15中b为在0.90V的固定电位下，该传感器对DU145细胞释放O2 ·-的i-t响应图)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
纳米颗粒仿生酶材料(Co-NSG)合成中，具体步骤如下：
(1)首先通过超声将100mg氧化石墨(GO)分散在30mL去离子水(DIW)中，加入2.5mgC4H6CoO4·4(H2O)；将混合物在80℃的水浴中搅拌2小时，再冷冻干燥24小时以除去DIW。随后，将所得产物与500mg C3H6N6和3g·L-1C3H7NO2S一起研磨成均匀混合物，然后在900℃下的氩气氛围中热解2小时。冷却至室温后，即获得仿生酶材料(简称为Co-NSG纳米颗粒仿生酶材料)。
涂覆仿生酶敏感元件的工作电极：
将上述制备的Co-NSG纳米颗粒仿生酶材料以1mg/mL的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将4.0μL该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上，在26℃下干燥5h后再涂覆Nafion质量分数为0.1wt％的Nafion溶液2.0μL，再次在26℃下干燥5h，制得表面涂覆纳米颗粒仿生酶敏感元件的工作电极。
构建超氧阴离子自由基电化学传感器：
将制得的表面涂覆纳米颗粒仿生酶敏感元件的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(Hg/HgCl2电极)、电解池和电解液(浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液)一起组装成超氧阴离子自由基电化学传感器。
图1为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的TEM图，由图1可知，负载着金属钴纳米颗粒的杂原子掺杂石墨烯基仿生酶合成，测量可知Co纳米颗粒的平均直径在60nm左右。
图2为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的HRTEM图，由图2可知，钴纳米颗粒在杂原子掺杂的石墨烯上分散良好。
图3为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的电子衍射图，由图3可知，钴纳米颗粒在杂原子掺杂的石墨烯上固定良好。
图4为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的接触角表征图，由图4可知，该仿生酶的接触角为77.51°，小于90°，这证明该材料具备良好细胞应用潜力。
本实施例中氧化石墨烯可以但不限于用还原氧化石墨烯、碳纳米管、碳纳米纤维等碳纳米材料替换；乙酸钴四水合物可以但不限于用钴、镍、锰、铜或铁等过渡金属源的乙酸盐替换；三聚氰胺可以但不限于用吡啶、吡嗪、嘧啶和哒嗪等六元杂环化合物替换；半膀氨基酸可以但不限于用丝氨酸和丙氨酸等生物质氨基酸替换。
实施例2
超氧化物歧化酶仿生酶材料，具体步骤如下：
将100mg GO与500mg C3H6N6和3g·L-1C3H7NO2S一起研磨成均匀混合物，在1000℃下的氩气氛围中热解2小时。冷却至室温后，即获得仿生酶材料(简称为NSG仿生酶材料)；
涂覆NSG仿生酶材料的工作电极：
将制备的NSG仿生酶材料以1mg/mL的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上，在26℃下干燥5h后再涂覆Nafion质量分数为0.1wt％的Nafion溶液，再次在26℃下干燥5h，制得表面涂覆超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极。
构建超氧阴离子自由基电化学传感器：
将中制得的表面涂覆超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(Hg/HgCl2电极)、电解池和电解液(浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液)一起组装成超氧阴离子自由基电化学传感器。
图5为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的TEM图，由图5可知，杂原子掺杂的石墨烯仿生酶材料合成。
图6为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的HRTEM图，由图6可知，杂原子掺杂的石墨烯仿生酶材料是无定形的。
实施例3
超氧化物歧化酶仿生酶材料，具体步骤如下：
配制45mL磷酸盐缓冲溶液，再将0.1014g硫酸锰加入2mL去离子水中，将两种溶液混合均匀，26℃下搅拌反应8h后以5000r/min的速度离心10min后取沉淀，将沉淀以去离子水洗涤后在80℃下真空干燥12h，制得超氧化物歧化酶仿生酶材料。
涂覆仿生酶敏感元件的工作电极：
将制备的超氧化物歧化酶仿生材料以1.5mg/mL的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上，在26℃下干燥5h后再涂覆Nafion质量分数为0.1wt％的Nafion溶液，再次在26℃下干燥5h，制得表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极；
构建超氧阴离子自由基电化学传感器：
将制得的表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(Hg/HgCl2电极)、电解池和电解液(浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液)一起组装成超氧阴离子自由基电化学传感器。
图7为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的FESEM图，由图7可知，片状磷酸锰仿生酶材料合成，尺度为微米级。
实施例4
将含有8μmol·L-1O2 ·-的磷酸缓冲溶液(PBS)加入到实施例1中构建的传感器的电解液中，在电压范围为0.3-1.0V下测试该传感器对O2 ·-的循环伏安响应，同时以该传感器对PBS的循环伏安响应作为空白对照。结果如图8所示，由图8可知，在含有8μmol·L-1O2 ·-的PBS中，氧化峰电流比不含O2 ·-的PBS中的氧化峰电流明显增加，说明该传感器对O2 ·-有明显的电化学催化氧化能力。
实施例5
将含有8μmol·L-1O2 ·-的磷酸缓冲溶液(PBS)加入到实施例2中构建的传感器的电解液中，在电压范围为0.3-1.0V下测试该传感器对O2 ·-的循环伏安响应，同时以该传感器对PBS的循环伏安响应作为空白对照。结果如图9所示，由图9可知，在含有8μmol·L-1O2 ·-的PBS中，在含有8μmol·L-1O2 ·-的PBS中，没有观察到明显的氧化峰，说明该传感器不具备对O2 ·-明显的电化学催化氧化能力。
实施例6
将含有8μmol·L-1O2 ·-的磷酸缓冲溶液(PBS)加入到实施例3中构建的传感器的电解液中，在电压范围为0.3-1.0V下测试该传感器对O2 ·-的循环伏安响应，同时以该传感器对PBS的循环伏安响应作为空白对照。结果如图10所示，由图10可知，在含有8μmol·L-1O2 ·-的PBS中，氧化峰电流比不含O2 ·-的PBS中的氧化峰电流稍微增大，说明该传感器对O2 ·-有电化学催化氧化能力，但不如实施例1中的传感器性能好。
实施例7
测试实施例1中构建的传感器对O2 ·-的计时电流响应，测试时连续向实施例1中构建的传感器的电解液中加入不同浓度的O2 ·-溶液，时间间隔为50s，记录响应时间与电流值的关系曲线，即得该传感器对O2 ·-的安倍响应图，结果如图11所示，当向电解液中连续添加不同浓度O2 ·-时，实施例1中构建的工作电极相对于Hg/Hg2Cl2参比电极的i-t响应图，图12为实施例1中构建的传感器检测到的稳态电流与O2 ·-浓度之间的线性关系图。由图12可知，响应电流随着O2 ·-浓度的增加而增长，响应电流与O2 ·-浓度的线性方程可以表示为：I(μA)＝0.044C(nmol·L-1)+0.409(R2＝0.998)，灵敏度为628.86μA·(μmol·L-1·cm2)-1，检测限为1.67nmol·L-1(信噪比S/N＝3)。
图13为实施例1中构建的传感器对O2 ·-的响应时间图，由图13可知，在注入O2 ·-后，传感器的响应非常迅速，且在1.35秒内即形成了稳态电流。
实施例8
将不同物质的溶液依次加入到实施例1中构建的传感器的电解液中，测试该传感器对不同干扰成分的计时电流响应，每隔50s分别依次连续地向传感器中的电解液中加入50nmol·L-1的O2 ·-、3μmol·L-1的Glucose、AA、UA、DA和1μmol·L-1的H2O2，得到该传感器对不同干扰成分选择性测试的安培响应曲线，结果如图14所示，由图14可知，3μmol·L-1的Glucose、AA、UA、DA和1μmol·L-1的H2O2均不会对该传感器检测50nmol·L-1的O2 ·-引起干扰，说明该传感器对O2 ·-具有良好的特异性。
实施例9
将实施例1中构建的传感器用于DU145细胞检测，细胞密度为1×105个/mL，具体为通过计时电流法在如下三种情况下实时检测DU145细胞在zym刺激下释放的O2 ·-：(1)向细胞注射0.2mg·mL-1zym；(2)向细胞注射0.2mg·mL-1zym和300U·mL-1SOD的混合液；(3)向未加入细胞的电解液中加入0.2mg·mL-1zym。结果如图15所示，其中，图15中a为DU145细胞的光学显微镜图像，图15中b该传感器对DU145细胞释放O2 ·-的i-t响应图，由图15可知，当加入0.2mg·mL-1zym促使细胞释放O2 ·-，检测到较大的电流响应(如图15中b中曲线Ⅰ所示)，而加入0.2mg·mL-1zym和300U·mL-1SOD的混合液并未引起显著的电流变化(如图15中b中曲线Ⅱ所示)，表明细胞释放的O2 ·-已被SOD消耗掉，在相同试验条件下，向不存在DU145细胞的电解液中加入0.2mg·mL-1zym同样检测不到显著的电流变化(如图15中b中曲线Ⅲ所示)。因此，可以证实曲线Ⅰ展示的电流响应是由DU145细胞在zym刺激下释放的O2 ·-被传感器中工作电极上的仿生材料捕获并在其表面发生氧化反应而产生的。进而可根据标准线性方程计算出2.0mg·mL-1zym刺激DU145细胞释放的O2 ·-浓度。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
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