一种n-甲基邻碳硼烷-l-丙酰胺的生物合成方法及其应用
阅读说明：本技术 一种n-甲基邻碳硼烷-l-丙酰胺的生物合成方法及其应用 (Biosynthesis method and application of N-methyl o-carborane-L-propionamide ) 是由 张红夺 金峰 金涛 王雯 金成福 李仙洛 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种N-甲基邻碳硼烷-L-丙酰胺的生物合成方法,包括步骤1,以D,L-丙氨酸和氨水为原料通过漆酶为催化剂合成L-丙胺酰胺,经过过滤除去漆酶,通入氯化氢气体,即生成L-丙胺酰胺盐酸盐。步骤2,在有机溶剂或离子液体中,碱性条件下,与1-溴甲基邻碳硼烷反应,得到相应的邻碳硼烷衍生物。本发明,通过漆酶的对胺和醇类的降解特性,意外发现其具有合成L-丙胺酰胺的功能,同时收率高,安全无污染等特点。通过对邻碳硼烷和相对亲水性基团L-丙酰胺的化学合成修饰,达到了增加化合物极性和细胞亲和度的目的,从而实现了硼离子在肿瘤细胞中靶向富集高浓度的技术效果。(The invention discloses a biosynthesis method of N-methyl o-carborane-L-propionamide, which comprises the following steps of 1, synthesizing L-propylamine amide by taking D, L-alanine and ammonia water as raw materials and taking laccase as a catalyst, filtering to remove the laccase, and introducing hydrogen chloride gas to generate L-propylamine amide hydrochloride. And 2, reacting with 1-bromomethyl o-carborane in an organic solvent or an ionic liquid under an alkaline condition to obtain the corresponding o-carborane derivative. According to the invention, the degradation characteristic of laccase on amines and alcohols is used for unexpectedly finding that the laccase has the function of synthesizing L-propylamine amide, and has the characteristics of high yield, safety, no pollution and the like. The chemical synthesis modification of o-carborane and a relatively hydrophilic group L-propionamide achieves the aim of increasing the polarity and the cell affinity of the compound, thereby realizing the technical effect of targeted enrichment of boron ions in tumor cells.)
技术领域
本申请涉及有机合成技术领域，具体而言，涉及一种N-甲基邻碳硼烷-L-丙酰胺的生物合成方法及其应用。
背景技术
L-丙酰胺盐酸盐是一种白色结晶，其在水中易溶，在乙醇中溶解，在乙醚或正丁醇中不溶解。L-丙氨酰胺盐酸盐的化学式为：C3H8N2O·HCl，分子量：124.57，是一种应用广泛的氨基酸衍生物，主要用于医药领域，随着一些下游产品的开发对L-丙酰胺盐酸盐需求越来越广，但是L-丙酰胺盐酸盐的制备则通过化学合成方法.工业上生产异丙胺主要有以下方法：
将L-丙氨酸溶于甲醇中，加入适量的氯化物催化剂进行酯化反应，所述氯化物是氯化亚砜或氯化氢气体，酯化后的产物通入氨气进行氨解反应，氨解后的反应液真空升温除氨，然后过滤掉氯化铵，过滤后的反应液加酸调整pH值，然后加入适量的酮，析出晶体即L-丙氨酰胺盐酸盐。
此方法存在条件苛刻能耗高，污染环境，所以一条绿色环保低能耗的合成工艺需要被开发。
同时中子治疗即硼中子俘获治疗(Boron Neutron Capture Therapy,简称BNCT)。硼中子俘获治疗通过在肿瘤细胞内的原子核反应来摧毁癌细胞。它的原理是这样的：先给病人注射一种含硼的特殊化合物，这种化合物与癌细胞有很强的亲和力，进入人体后，迅速聚集于癌细胞内，而其他组织内分布很少。这种含硼化合物对人体无毒无害，对癌症也无治疗作用。这时，用一种中子射线进行照射，这种射线对人体的损伤不大，但中子与进入癌细胞里的硼能发生很强的核反应，释放出一种杀伤力极强的射线，这种射线的射程很短，只有一个癌细胞的长度。所以只杀死癌细胞，不损伤周围组织。这种有选择的只杀死形状复杂的癌细胞而不损伤正常组织的技术，称为硼中子俘获治疗技术。
目前对-硼烷苯丙氨酸(BPA)一直被认为是BNCT最好的药物。BPA是具有苯丙氨酸结构的含硼化合物。区别肿瘤细胞与正常细胞的因素之一是称为LAT1氨基酸转运蛋白的特殊结构的过多，该结构识别并允许将苯丙氨酸转运到细胞中。因此，当BPA存在于肿瘤细胞外部时，细胞表面的这些转运蛋白使其进入肿瘤细胞，从而成功实现BNCT的治疗目的。但是BPA有一个缺点：一旦肿瘤细胞中的BPA水平升高，就会通过“反转运”机制将其排出，这使BNCT具有某种程度的局限性。因此，需要患者连续输注BPA 30至60分钟，以维持细胞内所需的量以使反应成功。
为了克服这些缺点，开发出更加安全有效的BNCT药物成为科学界研究的焦点。
发明内容
本申请的主要目的在于提供一种N-甲基邻碳硼烷-L-丙酰胺的生物合成方法及其在BNCT疗法中的应用。
本发明所述的N-甲基邻碳硼烷-L-丙酰胺的生物合成方法，按照如下合成线路进行：
具体的，所述的N-甲基邻碳硼烷-L-丙酰胺的生物合成方法，包括如下步骤：步骤1，以D,L-丙氨酸和25％氨水为原料，以漆酶为催化剂，在38-40度条件下反应，得到L-丙酰胺；然后经过过滤除去漆酶，通入氯化氢气体，析出L-丙酰胺盐酸盐固体；
步骤2，在有机溶剂或离子液体中，碱性条件下，将上述的L-丙酰胺盐酸盐固体与1-溴甲基邻碳硼烷反应，得到相应邻碳硼烷衍生物，即N-甲基邻碳硼烷-L-丙酰胺。
具体的，所述步骤1中，D,L-丙氨酸和25％氨水体积比例为1：5。
具体的，所述的漆酶，所述的漆酶为生漆中所提取的漆酶，含四个铜离子的多酚氧化酶。漆酶使用量为L-丙氨酸质量的百分之一。
具体的，步骤1中，反应时间为16-24小时，反应温度为38-40℃。
具体的，步骤2中，所述的离子液体包括1-己基-2，3-二甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-2，3-二甲基咪唑四氟硼酸盐，1-十二基-2，3-二甲基咪唑四氟硼酸盐中的一种或几种；碱包括三乙胺，N,N-二异丙基乙胺；有机溶剂为四氢呋喃。
具体的，步骤2中，反应时间为6-8小时，反应温度为60-70℃。
本发明还提供了上述的N-甲基邻碳硼烷-L-丙酰胺的生物合成方法的应用，即在BNCT疗法中的应用。
有益效果：本发明，采用体外实验进行新型邻碳硼烷衍生物结构筛选的方式，通过对邻碳硼烷和相对亲水性基团L-丙酰胺的化学合成修饰，达到了增加化合物极性和细胞亲和度的目的，从而实现了硼离子在肿瘤细胞中靶向富集高浓度的技术效果，进而解决了对-硼烷苯丙氨酸(BPA)在肿瘤细胞内浓度达到一定数量后“反转运”机制将其排出的技术瓶颈。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1～3为L-丙酰胺盐酸盐的制备实施例
实施例1
在250毫升单口烧瓶内加入D,L-丙氨酸10克和25％的氨水50克，加入水60克进行稀释后搅拌条件下，体系温度升到35-37℃，加入漆酶0.1克，反应16-18小时，待反应完毕后，过滤出漆酶并冷冻保管，准备下次套用。滤液直接进行通入氯化氢待体系PH值达到4.3-4.5之间析出固体，过滤并干燥得到L-丙酰胺盐酸盐啊8.4克。收率以D,L-丙氨酸质量计算为84％.
实施例2
在250毫升单口烧瓶内加入D,L-丙氨酸10克和25％的氨水50克，加入水60克进行稀释后搅拌条件下，体系温度升到38-40℃，加入漆酶0.1克，反应16-18小时，待反应完毕后，过滤出漆酶并冷冻保管，准备下次套用。滤液直接进行通入氯化氢待体系PH值达到4.3-4.5之间析出固体，过滤并干燥得到L-丙酰胺盐酸盐啊9.2克。收率以D,L-丙氨酸质量计算为92％.
实施例3
在250毫升单口烧瓶内加入D,L-丙氨酸10克和25％的氨水50克，加入水60克进行稀释后搅拌条件下，体系温度升到41-43℃，加入漆酶0.1克，反应16-18小时，待反应完毕后，过滤出漆酶并冷冻保管，准备下次套用。滤液直接进行通入氯化氢待体系PH值达到4.3-4.5之间析出固体，过滤并干燥得到L-丙酰胺盐酸盐啊8.8克。收率以D,L-丙氨酸质量计算为88％.
实施例4～实施例11为邻碳硼烷衍生物I的制备实施例
实施例4
100毫升单口烧瓶内加入L-丙酰胺盐酸盐2.2g，四氢呋喃40ml，加入三乙胺8g，1-溴甲基邻碳硼烷2.4g，温度升至60-70℃反应8h，待反应完毕后，温度降至室温，减压蒸馏溶剂，加入蒸馏水100ml与二氯甲烷100ml进行萃取，得到的有机溶剂加入MgSO4干燥，过滤母液减压蒸馏得到2.7g化合物I收率74％。
实施例5
100毫升单口烧瓶内加入L-丙酰胺盐酸盐2.2g，四氢呋喃40ml，加入N,N-二异丙基乙基胺8.4g，1-溴甲基邻碳硼烷2.4g，温度升至60-70℃反应8h，待反应完毕后，温度降至室温，减压蒸馏溶剂，加入蒸馏水100ml与二氯甲烷100ml进行萃取，得到的有机溶剂加入MgSO4干燥，过滤母液减压蒸馏得到3.0g化合物I收率81％。
实施例6
100毫升单口烧瓶内加入L-丙酰胺盐酸2.2g，1-己基-2，3-二甲基咪唑四氟硼酸盐40ml，加入三乙胺8g，1-溴甲基邻碳硼烷2.4g，温度升至60-70℃反应6h，待反应完毕后，温度降至室温，减压蒸馏溶剂，加入蒸馏水100ml与二氯甲烷100ml进行萃取，得到的有机溶剂加入MgSO4干燥，过滤母液减压蒸馏得到3.11g化合物I收率84％。
实施例7
100毫升单口烧瓶内加入L-丙酰胺盐酸2.2g，1-丁基-2，3-二甲基咪唑四氟硼酸盐40ml，加入三乙胺8g，1-溴甲基邻碳硼烷2.4g，温度升至60-70℃反应6h，待反应完毕后，温度降至室温，减压蒸馏溶剂，加入蒸馏水100ml与二氯甲烷100ml进行萃取，得到的有机溶剂加入MgSO4干燥，过滤母液减压蒸馏得到3.4g化合物I收率91％。
实施例8
100毫升单口烧瓶内加入L-丙酰胺盐酸2.2g，1-十二基-2，3-二甲基咪唑四氟硼酸盐40ml，加入三乙胺8g，1-溴甲基邻碳硼烷2.4g，温度升至60-70℃反应6h，待反应完毕后，温度降至室温，减压蒸馏溶剂，加入蒸馏水100ml与二氯甲烷100ml进行萃取，得到的有机溶剂加入MgSO4干燥，过滤母液减压蒸馏得到3.3g化合物I收率87％。
实施例9
100毫升单口烧瓶内加入L-丙酰胺盐酸2.2g，1-己基-2，3-二甲基咪唑四氟硼酸盐40ml，加入N,N-二异丙基乙基胺8.4g，1-溴甲基邻碳硼烷2.4g，温度升至60-70℃反应6h，待反应完毕后，温度降至室温，减压蒸馏溶剂，加入蒸馏水100ml与二氯甲烷100ml进行萃取，得到的有机溶剂加入MgSO4干燥，过滤母液减压蒸馏得到3.15g化合物I收率85％。
实施例10
100毫升单口烧瓶内加入L-丙酰胺盐酸2.2g，1-丁基-2，3-二甲基咪唑四氟硼酸盐40ml，加入三乙胺8g，1-溴甲基邻碳硼烷2.4g，温度升至60-70℃反应6h，待反应完毕后，温度降至室温，减压蒸馏溶剂，加入蒸馏水100ml与二氯甲烷100ml进行萃取，得到的有机溶剂加入MgSO4干燥，过滤母液减压蒸馏得到3.38g化合物I收率92％。
实施例11
100毫升单口烧瓶内加入L-丙酰胺盐酸2.2g，1-十二基-2，3-二甲基咪唑四氟硼酸盐40ml，加入三乙胺8g，1-溴甲基邻碳硼烷2.4g，温度升至60-70℃反应6h，待反应完毕后，温度降至室温，减压蒸馏溶剂，加入蒸馏水100ml与二氯甲烷100ml进行萃取，得到的有机溶剂加入MgSO4干燥，过滤母液减压蒸馏得到3.25g化合物I收率89％。
实施例1～实施例8的收率列表如下
从上述试验结果可以看出，对于以离子液体代替有机溶剂为反应物生成邻碳硼烷衍生物I的反应来说，离子液体条件明显优于传统有机溶剂条件，因此，可以看出，最佳的反应步骤及条件为离子液体与邻碳硼烷底物重量比为16.7：1，在60-70℃反应6个小时。
对于化合物相关性能指标的测定均为本领域常规通用方法。
1、IC50的测定
在不同样品浓度下，给药48h后，通过通用的MTT法检测化合物对A549,HCT-116,SGC-7901,HeLa,U251细胞和结肠肿瘤细胞CT26生长抑制情况，最后计算出IC50，以抑制细胞存活所需的药物浓度从半数致死量确定，并且结果代表平均值±。。
MTT为四甲基偶氮唑盐，是一种能接受氢离子的黄色染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)和细胞色素C(cytochromeC)，可使MTT生成蓝紫色的甲瓒(formazan)结晶而析出沉淀，而死细胞无此功能。将生成的甲瓒结晶溶于二甲基亚砜(DMSO)后，可通过酶联免疫检测仪测定490nM或570nM处溶液的吸光值，来监测甲瓒的生成量。而甲瓒结晶的生成量与活细胞数成正比，故可以检测药物对细胞活力的影响。该方法因灵敏度高、经济等特点，广泛用于抗肿瘤药物筛选测试中。
具体的实验方法是：各种细胞离心后配成5×103个/mL的细胞悬液，在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液,常规培养24h后，吸去原培养液，加入200μL配置好的化合物I,II或硼苯丙氨酸(BPA)样品，各样品的最终浓度分为0.137μM、0.046μM、1.235μM、0.412μM、3.704μM共5个浓度，每个浓度做4个复孔，96孔板四周的孔用PBS封孔，并留出阴性对照组和空白对照组，化合物作用72h后，每孔加入MTT溶液20μL，继续培养4h，小心吸弃孔内培养基，加入DMSO150μL震荡10min，在酶标仪490nM处测定各孔的OD值，按下式计算样品在不同浓度下的抑制率：抑制率＝(对照孔OD值－给药孔OD值)/对照孔OD值×100％。最后应用相关软件计算样品的IC50值。
操作方法：
(1)结肠肿瘤CT26细胞(5×105个细胞)在96多孔板中进行有氧和无氧培养。有氧培养条件为36.5～37℃状态下，提供无菌去离子氧，供氧速度为每分钟/0.3cm2，且充分给于时间在12小时。无氧培养条件为36.5～37℃状态下，无菌无氧密封干燥箱条件，且充分给于时间在12小时。
(2)邻碳硼烷化合物I,II和硼苯丙氨酸(BPA)依次在(3mM to 1mM)下72小时进行处理。
(3)依次加入3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐溶液，培养4小时。
(4)在用二甲亚砜150μL稀释震荡。
(5)通过酶联免疫检测仪测定蛋白质含量595nm测试。
2、硼吸收
p-35细胞(5×103细胞)在化合物I,II和硼苯丙氨酸(BPA)(统一硼浓度为10.8ppm)的存在下处理3小时。3滴磷酸缓冲盐溶液洗涤三次后；
(4)高氯酸/过氧酸进行分析。
(5)70℃下进行有氧和无氧培养。有氧培养条件为36.5～37℃状态下，提供无菌去离子氧，供养速度为每分钟/0.3cm2，且充分给于时间在12小时。无氧培养条件为36.5～37℃状态下，无菌无氧密封干燥箱条件，且充分给于时间在12小时。
(6)等离子体发射光谱法测试。
操作方法：
(1)结肠肿瘤CT26细胞(5×105个细胞)在p-35细胞皿中进行有氧和无氧培养。有氧培养条件为36.5～37℃状态下，提供无菌去离子氧，供养速度为每分钟/0.3cm2，且充分给于时间在12小时。无氧培养条件为36.5～37℃状态下，无菌无氧密封干燥箱条件，且充分给于时间在12小时。
(2)邻碳硼烷衍生物I,II,III依次在(硼浓度为10.8ppm)下3小时进行处理。
(3)再用3滴磷酸缓冲盐溶液洗涤三次。
(4)然后用高氯酸/过氧酸进行活性分析。
(5)70℃下进行有氧和无氧培养。有氧培养条件为36.5～37℃状态下，提供无菌去离子氧，供养速度为每分钟/0.3cm2，且充分给于时间在12小时。无氧培养条件为36.5～37℃状态下，无菌无氧密封干燥箱条件，且充分给于时间在12小时。
(6)等离子体发射光谱法测试。
下表为：不同化合物的IC50和硼积聚浓度表
结果如表中所示，BPA的IC50活性分别为4.49×10-5(±0.30),5.32×10-5(±0.12),4.68×10-5(±0.54),7.18×10-5(±0.52),5.34×10-5(±0.24)及6.43×10-5(±0.22)同时硼的聚集浓度为0.083±0.012ppm，而发明所设计的化合物I达到BPA的20倍以上高聚集浓度，化合物I的IC50活性分别为0.34×10-5(±0.02)，0.87×10-5(±0.03)，1.89×10-5(±0.33)，1.90×10-5(±0.21)，1.81×10-5(±0.13)，0.85×10-5(±0.10)；硼聚集浓度分别为2.115±0.12ppm；硼聚集浓度分别为2.115±0.12ppm充分得到了最初设计的聚集效应。在肿瘤细胞和肿瘤细胞抑制活性方面也非常突出，均达到1～3倍抑制效果。通过体外试验可以得知硼烷药物自身结构具有一定的抑制活性，外加导入硼烷使得细胞内增加了硼的浓度，新型结构使得硼离子更易于聚集在肿瘤细胞内到达高硼聚集效果。当肿瘤细胞内高硼聚集后，通过外部原子能照射，产生重粒子α粒子(氦原子核)和高能Li核，进而选择性的杀灭肿瘤细胞。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请。