一种蕨菜中原蕨苷的分离纯化制备方法
阅读说明：本技术 一种蕨菜中原蕨苷的分离纯化制备方法 (Method for separating, purifying and preparing pteridophytin in fiddlehead ) 是由 陈乃东 陈乃富 郝经文 朱安玲 徐惠敏 刘孝全 李强 杨维瀚 于 2021-01-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种蕨菜中原蕨苷的分离纯化制备方法,属于医药生物技术领域。操作步骤如下：(1)将新鲜蕨菜,-50℃以下冷冻干燥,粉碎,获得冻干粉；(2)将冻干粉进行正丁醇冷凝回流提取2遍,合并滤液,减压回收正丁醇得浸膏,冷冻干燥,获得正丁醇提取物；(3)将正丁醇提取物正向硅胶柱层析分离,使用氯仿-甲醇梯度洗脱,减压浓缩,获得原蕨苷粗品；(4)将原蕨苷粗品进行C18反向柱纯化精制,30％甲醇除杂,45％甲醇洗脱,低温冷冻干燥除去溶剂,获得纯度大于98％的原蕨苷。本发明原蕨苷的提取率可达65％,为药物开发提供了可能；本发明具有分离样品量大、目标物质损失少、提取率高、装置简单、操作简便、适合工业化生产的优点。(The invention discloses a separation and purification preparation method of pteridium aquilinum glycoside in pteridium aquilinum, belonging to the technical field of medical biology. The operation steps are as follows: (1) freeze drying fresh herba Fimbristylis Dichotomae at-50 deg.C, and pulverizing to obtain lyophilized powder; (2) condensing and refluxing the freeze-dried powder with n-butanol for 2 times, mixing filtrates, recovering n-butanol under reduced pressure to obtain extract, and freeze-drying to obtain n-butanol extract; (3) separating n-butanol extract by forward silica gel column chromatography, gradient eluting with chloroform-methanol, and concentrating under reduced pressure to obtain crude pteridonin; (4) and (3) refining the crude product of the crude pteridophytin by C18 reverse column purification, removing impurities by 30% methanol, eluting by 45% methanol, and removing the solvent by low-temperature freeze drying to obtain the pteridophytin with the purity of more than 98%. The extraction rate of the pteridophytin can reach 65 percent, and the possibility is provided for drug development; the method has the advantages of large sample separation amount, less target substance loss, high extraction rate, simple device, simple and convenient operation and suitability for industrial production.)
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及蕨菜中原蕨苷的分离纯化制备方法。
背景技术
蕨(学名:Pteridium aquilinum(L.)Kuhn var.latiusculum(Desv.)Underw.exHeller)是蕨科蕨属欧洲蕨的一个变种，植株高可达1米。根状茎长而横走，密被锈黄色柔毛，以后逐渐脱落；叶远生，柄长20-80厘米，基部粗3-6毫米，褐棕色或棕禾秆色；叶片阔三角形或长圆三角形，长30-60厘米，宽20-45厘米，先端渐尖，基部圆楔形，三回羽状。蕨资源丰富，广布于中国及世界各地。
蕨菜来源于蕨(Pteridium aquilinum(L.)Kuhn)的幼苗、嫩芽，别名拳头菜、如意菜、龙爪菜等，据《本草纲目》记载：蕨味甘寒，具有清热，滑肠，降气，驱风，化痰等功效。蕨菜因其生长在林间、山野、松林内，少受污染，加之富含多种对人体有益的营养成分，为深受人们喜爱的山珍野菜，长期被人们食用，有“山菜之王”之美誉。
19世纪时，人们注意到过量食用蕨菜能造成牛的中毒甚至死亡，1960年，Rosenberger和Heeschen等人通过对牛的蕨菜中毒症状研究中发现蕨菜可能存在致癌作用,1965年，Evans和Mason通过对小鼠喂养蕨菜的实验中，发现小鼠出现了多种肠道癌变现象，表明蕨菜中可能含有某种致癌成分。1983年-1984年，日本科学家Niwa和荷兰科学家Hoeven从蕨菜中分离出来了一种可使实验动物致癌的物质——原蕨苷(Ptaquiloside，简称PTA，CAS：87625-62-5，图1.)，综合已有文献报道表明，在蕨及蕨菜中，原蕨苷的含量在0.0μg/g-12945μg/g，平均含量约为0.64％。
药理活性追踪研究显示，原蕨苷可诱发实验动物的尿道和胃肠道病变出现肿瘤，据此，原蕨苷被世界癌症组织评级为3类致癌物。研究制备原蕨苷的制备方法，获得高纯度原蕨苷，对蕨菜及其产品的安全性评价和质量控制具有重要意义。
Shahin等人研究发现原蕨苷有相关的免疫调节作用，在长期使用原蕨苷的活性物质蕨菜二烯酮能够使单核细胞增多，可以增加肿瘤坏死因子的数目，Latorre等人研究发现同时使用硒进行同时处理或者事后处理时，原蕨苷的这种致癌作用便可以逆转，将硒与原蕨苷进行结合使用，会对癌症有治疗作用。最新的研究显示，原蕨苷等含1-茚酮结构的蕨素倍半萜类物质，具有抗炎、抗风湿、抗阿尔茨海默病/老年痴呆症、抗病毒等生物活性，在药物验研究领域有着广阔的应用前景。蕨及蕨菜资源在我国乃至全世界极为丰富，建立一种从蕨菜中快速制备高纯度原蕨苷的方法，对新药研发和蕨资源的深度开发具有重要意义。
原蕨苷在有机试剂中较为稳定，但在水溶液中不稳定，在热水、酸性及碱性溶剂中极不稳定，极易发生脱糖和芳香化，生成蕨素B(Pterosin B，CAS:34175-96-7，图1)。
由于原蕨苷结构复杂，人工合成困难，主要通过蕨菜获得该物质，如代娟等在中国专利文献CN106083593中报道了采用水提、聚酰胺树脂及大孔树脂纯化从蕨菜中制备分离原蕨苷，原蕨苷提取率为25％；日本学者Haruki Niwa和Makoto Oiika，采用沸水提取、树脂XAD-2吸附后甲醇洗脱部分，正丁醇萃取，硅胶柱纯化后制备液相精制，获得了原蕨苷，提取得率为0.01％，提取率约为16.7％；Yoshida等人采用0.5％乙酸-甲醇提取，提取物溶于0.1％醋酸后正己烷-乙醚萃取，萃取物以甲醇-乙醇溶解，滤液浓缩得原蕨苷粗品，再用反相高效液相色谱法分离得到原蕨苷，提取得率为0.006％，提取率仅1％。
综合已有文献报道，从蕨菜中分离原蕨苷主要步骤如下：(1)提取方法多为热水浸提或含酸有机试剂提取；(2)分离方法有：提取物溶于水后采用聚酰胺树脂柱、大孔树脂柱等纯化，C18制备柱分离。
然而，热水浸提或含酸有机试剂提取，会导致原蕨苷大量分解，降低原蕨苷的得率；C18柱分离前，提取物需溶于水后采用聚酰胺树脂柱、大孔树脂柱等手段富集，多次使用水做溶剂和洗脱剂，进一步加大了原蕨苷的分解，使得原蕨苷的提取率进一步降低。亟需构建一个高效的原蕨苷制备分离方法。
发明内容
为解决现有原蕨苷分离制备中存在的问题，本发明提供了一种蕨菜中原蕨苷的分离纯化制备方法。
一种蕨菜中原蕨苷的分离纯化制备的操作步骤如下：
(1)制备冻干粉
将新鲜的蕨菜，在温度-50℃以下冷冻干燥，粉碎，获得冻干粉；
(2)制备正丁醇提取物
将冻干粉进行正丁醇冷凝回流提取，过滤，滤渣进行正丁醇冷凝回流提取，合并滤液，减压回收正丁醇得浸膏，-50冷冻干燥至恒重，获得正丁醇提取物；
(3)制备原蕨苷粗品
将正丁醇提取物进行正向硅胶柱层析分离，采用按体积比30：1的氯仿-甲醇、按体积比15：1的氯仿-甲醇和按体积比10：1氯仿-甲醇依次进行梯度洗脱，收集体积比10：1的氯仿-甲醇洗脱液减压浓缩，获得原蕨苷粗品；
(4)制备原蕨苷
将原蕨苷粗品进行C18反向柱纯化，用浓度30％的甲醇溶液除杂，用浓度45％的甲醇溶液洗脱，收集浓度45％的甲醇溶液洗脱部分，低温冷冻干燥除去溶剂，甲醇重结晶，获得纯度大于98％的原蕨苷，所述原蕨苷为白色粉未状。
进一步限定的技术方案如下：
步骤(1)中，粉碎过40目筛。
步骤(2)中，按照料液比1g:15mL在冻干粉中加入正丁醇，温度85℃条件下回流提取1.5h。
步骤(3)中，将正丁醇提取物溶解于甲醇中，加入200-300目正向硅胶混匀，减压浓缩至完全干燥，得到拌样硅胶，过200目筛；将200-300目正向硅胶装入层析柱并压实，将分离硅胶表面震荡平整，依次加入拌样硅胶、保护硅胶；采用体积比30：1的氯仿-甲醇进行洗脱，以除去浸膏中部分极性较原蕨苷小的杂质；继以体积比15：1的氯仿-甲醇进行洗脱，以除去浸膏中与原蕨苷极性更为接近的小极性杂质；最后用体积比10：1的氯仿-甲醇进行洗脱，收集体积比10：1的氯仿-甲醇洗脱液，45℃减压浓缩，获得原蕨苷粗品。
步骤(4)中，将C18反向硅胶填料装入玻璃层析柱，活化后依次用双蒸水洗脱、体积浓度10％的甲醇溶液平衡；将原蕨苷粗品溶解在体积浓度10％的甲醇溶液中，0.22μm滤膜过滤，滤液缓慢滴加到经双蒸水洗脱、浓度10％的甲醇溶液平衡的C18反向柱上，以体积浓度10％甲醇溶液、体积浓度30％的甲醇溶液依次洗脱，除去部分极性大于原蕨苷的杂质，然后使用体积浓度45％的甲醇溶液洗脱，收集体积浓度45％的甲醇溶液洗脱部分，-20℃预冻24h后，使用冷冻干燥机在-105℃下将洗脱液冻干，甲醇重结晶3次，获得纯度98％的原蕨苷。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
(1)本发明的创新在于全程的几乎无水操作，因为原蕨苷在水中易分解，现有的方法都是在含水甚至是酸水环境下进行。将新鲜的蕨及蕨菜原料采用-50℃以下冷冻干燥脱水，相对于文献报道的烘干脱水，既减少烘烤脱水过程中引发的原蕨苷分解，又可利用水分在低温下结冰膨胀来破坏新鲜的蕨及蕨菜的植物组织、细胞的结构，有利于后续提取过程中原蕨苷的溶出，提高原蕨苷的提取率。
(2)本发明采用正丁醇提取，可减少水提或含酸有机试剂提取过程中原蕨苷的分解，提高原蕨苷的提取率，且提取溶剂回收后可重复使用，降低成本，适合工厂化生产。
(3)本发明采用硅胶柱层析分离，使用有机试剂氯仿-甲醇为洗脱剂，减少分离过程中原蕨苷的分解。
(4)原蕨苷的精制过程中，收集体积浓度45％的甲醇溶液洗脱部分，采用低温冷冻干燥除去溶剂，相对于传统的减压浓缩，有效减少了原蕨苷的分解，提高了原蕨苷的得率。
(5)本发明提供了一种普通C18反相柱精制原蕨苷，适合工厂化生产。
(6)本发明方法的原蕨苷的提取率可达65％，显著高于文献报道1～25％。
附图说明
图1为原蕨苷的化学转化图；
图2为本发明制备的原蕨苷的一级质谱图；
图3为本发明制备的原蕨苷的二级质谱图；
图4为制备的原蕨苷HPLC色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
蕨菜中原蕨苷的分离纯化制备的操作步骤如下：
(1)制备冻干粉
新采集的新鲜蕨菜，自来水清洗除去表面浮尘，切成约0.5cm的小段，-20℃冰箱预冻24h后转移至-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥48h，粉碎，过40目筛，获得冻干粉。
(2)制备正丁醇提取物
称取冻干粉200g，按照料液比1g:15mL加入正丁醇，温度85℃条件下回流提取1.5h，过滤，收集滤液，滤渣按照以上方法同法提取滤液，合并两次收集的滤液，旋转蒸发仪70℃减压回收正丁醇得浸膏，-50冷冻干燥至恒重，得正丁醇提取物19.2g。
(3)制备原蕨苷粗品
称取正丁醇提取物18.0g，溶解于120mL的甲醇中，加入200-300目正向硅胶26g、混匀，减压浓缩至完全干燥，得到拌样硅胶，过200目筛；称取200-300目正向硅胶360g，装入层析柱并压实，将分离硅胶表面震荡平整，依次加入拌样硅胶、2cm厚的保护硅胶；采用7.6L体积比30：1的氯仿-甲醇进行洗脱，以除去浸膏中部分极性较原蕨苷小的部分杂质；继以4.0L体积比15：1的氯仿-甲醇进行洗脱，以除去浸膏中与原蕨苷极性更为接近的小极性杂质；最后用4.5L体积比10：1的氯仿-甲醇进行洗脱，收集体积比10：1的氯仿-甲醇洗脱液，45℃减压浓缩，获得原蕨苷粗品120.0mg。
(4)制备原蕨苷
称取C18反向硅胶填料60克，装入玻璃层析柱，活化后依次用双蒸水洗脱、10％甲醇平衡；将120.0mg原蕨苷粗品溶解在3.0mL体积浓度10％的甲醇水溶液中，0.22μm滤膜过滤，滤液缓慢滴加到经双蒸水洗脱、浓度10％的甲醇溶液平衡的C18反向柱上，体积浓度10％的甲醇水溶液洗脱180mL后，以体积浓度30％的甲醇水溶液洗脱300mL，除去部分极性大于原蕨苷的杂质，然后使用体积浓度45％的甲醇水溶液洗脱450mL。收集体积浓度45％的甲醇水溶液洗脱部分，-20℃预冻24h后，使用冷冻干燥机在-105℃下将洗脱液冻干，甲醇重结晶3次，获得白色粉末36.2mg，一级质谱检测结果见图2，显示其分子离子峰m/Z＝421.1839([M+Na]+)，二级质谱检测结果见图3，显示有离子碎片m/Z＝201.1278、m/Z＝219.1380、m/Z＝241.1208，与标准品原蕨苷一级质谱、二级质谱检测结果完全相同，鉴定分离的白色粉末为原蕨苷。经HPLC检测，分离制备的白色粉末中原蕨苷的纯度为98％。
原蕨苷的结构式如下：
精密称取原蕨苷标准品，溶于甲醇，制得不同浓度梯度的原蕨苷标准溶液，采用HPLC法测的原蕨苷标准曲线方程为：Y＝4.44x-1.86(R2＝0.999)。液相条件：C18反向色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇，梯度洗脱；检测波长214nm；柱温30℃；流速：1.0mL·min-1；色谱柱：Waters Atlantis C18反向色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇，检测波长214nm；柱温30℃；流速：1.0mL·min-1；进样量10μL；梯度洗脱：0-5min,20-40％B；5-10min,40-45％B；10-20min,45-50％B；20-25min，50-57％B；25-27min，57-100％B；27-35min，100％B。本实施例制备分离的原蕨苷HPLC色谱图如图4所示，测得其原蕨苷含量为98％。
精密称取正丁醇提取物，溶于甲醇，制得0.5mg/mL，采用测定标准曲线相同的HPLC法，测定取正丁醇提取物原蕨苷含量。进一步计算显示，采用实施例1所述材料与方法，原蕨苷的提取率为64.6％，原蕨苷提取得率为0.197％。