具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1可溶性猪PD-1重组蛋白的制备方法

(1)猪PD-1蛋白胞外区基因大肠杆菌密码子改造

遵循大肠杆菌密码子偏嗜性表、基因序列G+C含量不能高于60％和尊重基因原始密码子的原则下改造猪PD-1蛋白胞外区基因，并且在基因序列引物设计时也进行大肠杆菌密码子偏嗜性的改造，加上酶切位点具体的引物序列见表1。主要氨基酸位点的改造如下：ACA→ACC，GAG→GAA，CCC→CCG，CTC→CTG，CGC→CGT，AGG→CGT。所得大肠杆菌偏嗜性可溶性猪PD-1蛋白的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。将设计改造好的基因序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 猪PD-1胞外区基因片段扩增引物

(2)可溶性猪PD-1蛋白的诱导表达

将实施例1改造所得大肠杆菌偏嗜性可溶性猪PD-1蛋白的DNA通过PCR扩增，克隆至pMD-18T构建克隆质粒。通过PCR、酶切和序列测定，鉴定正确的PD-1基因通过酶切克隆至pET-32a(+)中。再经过PCR和序列测定，筛选获得组表达载体pET-32a-PD1。将pET-32a-PD1经过测序验证后转化至大肠杆菌Rosetta工程菌株。挑取单菌落于37℃过夜培养作为种子液。取上述种子液按体积比1:100接种于新鲜的含Amp(100μg/mL)2×YT培养液(16g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5gNaCl，100mg氨苄青霉素，定容至1000mL)，37℃培养至OD₆₀₀值为0.5～1.0，再加入不同浓度的IPTG，进行诱导培养。确定其最佳诱导条件为：28℃、IPTG浓度为0.5mmol/L下诱导4h。

(3)可溶性猪PD-1重组蛋白的纯化及浓度测定

大量诱导重组菌pET-32a-PD1/Rosetta表达获得PD-1重组蛋白，表达产物经Ni-NTA Resin柱层析纯化并浓缩，最终得到纯度高达95％的重组目的蛋白。确定洗脱缓冲液中最佳咪唑浓度为200mmol/L。

用BECKMAN Coulter公司DU800紫外分光光度计测定纯化后蛋白含量。用PBS缓冲液调零后，测定样品A260(260nm的吸光度)和A280(280nm的吸光度)的值。根据公式：蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.45×A280－0.74×A260)×稀释倍数，经测定纯化后的PD-1蛋白的浓度为0.9mg/mL。

所得可溶性猪PD-1重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2可溶性猪PD-1重组蛋白作为疫苗增强剂的体外活性鉴定方法

(1)Western blotting(蛋白质印迹)鉴定PD-1重组蛋白活性

Western blotting鉴定诱导表达的可溶性猪PD-1重组蛋白，具体步骤如下：

1)制胶：首先在烧杯中按照表2体系依次加入各组分配制12％的分离胶，待凝胶凝固，用滤纸吸去玻璃板中多余水分，然后开始按照表3配制浓缩胶。

表2 12％分离胶的配制

表3 5％浓缩胶的配制

2)待上样、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，将玻璃板撬开轻取下蛋白凝胶，用甲醇将PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)活化60s，分别将蛋白凝胶、海绵垫、滤纸以及PVDF膜放在膜转移缓冲液中浸泡至少30min。然后将海绵垫、滤纸、蛋白凝胶以及PVDF膜依次夹好放入转膜仪中，在350mA条件下转膜1h。

3)封闭：转膜完成后取下PVDF膜，用TBST(TBS+Tween-20)冲洗。5％脱脂奶粉-TBST，37℃摇床封闭2h；TBST溶液清洗3次，5min/次。

4)杂交：将实验室制备的抗PD-1单克隆抗体，按体积比1:1000倍稀释，加入放有PVDF膜的孵育盒中，覆盖PVDF膜，4℃孵育过夜；收集一抗，并用TBST洗膜3次，5min/次。加入体积比1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗于孵育盒中，覆盖PVDF膜，37℃摇床孵育2h，收集二抗，TBST洗膜3次，5min/次。

5)显色：用镊子取出膜，将膜完全浸入并与DAB显色液充分接触。待显色完全后马上用双蒸水冲掉终止反应，拍照分析结果。结果如图1所示。

(2)可溶性猪PD-1重组蛋白与PBMCs的结合

将分离的猪PBMCs计数后，用RPMI1640不完全培养基调整至1×10⁶个/mL，加入PCV2细胞毒后用可溶性猪PD-1重组蛋白阻断PD-1/PD-L1通路(B组)。培养36h后，收集细胞，PBS洗3次，加入PBS稀释为体积比1:1000抗His多抗。37℃结合1h，PBS重复洗涤3次；加入按体积比1:50倍稀释的IgG-FITC，37℃结合1h，PBS重复洗涤3次；加入1mL PBS悬液，200目滤网过滤，计2×10⁴个细胞，流式术检测荧光信号强度，分析可溶性猪PD-1重组蛋白与PBMCs结合情况，同时设置PCV2单独感染组(A组)。结果如图2所示。

(3)可溶性猪PD-1重组蛋白对PBMCs的增殖作用

将分离的猪PBMCs计数后，用RPMI1640不完全培养基调整至1×10⁶个/mL，在96孔板中每孔加细胞悬浮液100μL。PCV2接毒后，用可溶性猪PD-1重组蛋白处理PCV2感染的PBMCs(B组)，使其终质量浓度为10μg/mL，利用CFSE染料进行标记，培养4d后，流式细胞术检测PBMCs的增殖。同时设置PCV2病毒对照组(A组)。结果如图3所示。

(4)荧光定量PCR检测可溶性猪PD-1重组蛋白阻断后PBMCs中PCV2的病毒载量

猪PBMCs计数后，用RPMI1640不完全培养基调整至1×10⁶个/mL置于12孔板中，向加PCV2细胞毒的PBMCs中加入10μg/mL可溶性猪PD-1重组蛋白，培养36h后。将孔板-80℃反复冻融3次，12000r/m，4℃离心20min，收集上清，抽提病毒基因组DNA，进行荧光定量PCR，每个样品做3个重复，记录CT值，根据标准曲线计算PBMCs中PCV2病毒载量。结果如图4所示。

(5)可溶性猪PD-1重组蛋白对PBMCs细胞因子转录水平的调节作用

猪PBMCs计数后，用RPMI1640不完全培养基调整至1×10⁶个/mL，在96孔板中每孔加细胞悬浮液100μL，加入PCV2细胞毒，设为PCV2组；再加可溶性猪PD-1重组蛋白，使其终质量浓度为10μg/mL，设为PCV2+可溶性猪PD-1重组蛋白组，每个梯度3个重复，同时设正常细胞对照组和可溶性猪PD-1重组蛋白单独刺激的PBMCs组，37℃、5％CO₂培养箱培养至36h，收取细胞提取RNA并反转录成cDNA，然后进行荧光定量PCR，以β-肌动蛋白(β-actin)作为内源性对照，采用2^-ΔΔCt分析方法计算荧光定量PCR检测的相对表达值与β-action进行比较分析，并将正常对照组时mRNA含量定义为1倍，可得出不同时间点IL-2、IL-12和IFN-γ转录的水平。结果如图5所示。

1)PBMCs中cDNA的提取

①细胞的裂解：用移液枪吹打重悬培养板中的细胞，将细胞悬液转入离心管中，12000r/m、4℃离心2min，弃上清。使用PBS清洗一次，4℃、12000r/m离心2min，弃上清。向收集的细胞中加入适当量的裂解Buffer RL(已加入50×DTT溶液)，充分吹打混匀直至裂解液中无明显固体沉淀。按照RNA提取试剂盒的说明书进行提取。

②细胞RNA的反转录：取适量提取的RNA按表4配制反转录反应液。

表4 反转录体系

轻柔混匀后立即进行反转录反应，37℃孵育15min，85℃水浴5s，4℃冷却即为cDNA，-80℃保存备用。

2)细胞因子的荧光定量PCR检测

cDNA稀释到100ng以下，按表5配制实时荧光定量PCR反应液(冰上配制)。其中，细胞因子的引物序列如表6所示。

表5实时荧光定量PCR反转录反应体系

表6β-actin和细胞因子实时荧光定量PCR引物序列表

以上体系轻柔混匀后，进行荧光定量PCR扩增，扩增反应程序：95℃预变性30s，进行40个循环：95℃变性5s，60℃反应34s；溶解曲线：95℃30s，60℃1min，95℃15s。

从图5可以看出，IL-12mRNA在24～72h时PCV2感染组均低于正常组，尤其是72h转录水平明显低于正常组(p<0.01)；IFN-γmRNA在36h和72h时，PCV2感染组相对于正常组显著降低(p<0.01)，在24h降低显著(p<0.05)，12、48和60h变化不显著。IL-2在PCV2感染后12～72h均明显降低，到36和72h时下调极显著(p<0.01)。结果说明PCV2在体外能够在提高PD-1、PD-L1，激活PD-1/PD-L1通路，抑制细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ的转录水平。

(6)可溶性猪PD-1重组蛋白对PBMCs细胞因子分泌水平的调节作用

细胞培养上清收集：用无菌管收集，3000r/m离心20min。根据ELISA检测细胞因子试剂盒检测计算细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ的浓度。结果如图6所示。

从图6可以看出，PCV2感染后用猪可溶性猪PD-1重组蛋白阻断PD-1/PD-L1通路，收集培养上清，利用ELISA试剂盒检测记录结果。结果显示：阻断后，sPD-1蛋白组的IL-2和IL-12相对于正常PCV2组明显升高(P<0.01)；IFN-γ明显上调(P<0.05)。经ELISA检测得到了与荧光定量PCR相一致的结果。

实施例3可溶性猪PD-1重组蛋白作为疫苗增强剂的体内活性鉴定方法

(1)动物分组

通过查阅文献及动物间等效剂量换算，确定可溶性猪PD-1重组蛋白免疫量为0.2mg/kg。选取45日龄未免疫PCV2疫苗的断奶仔猪40头，随机分为4组，每组10头，其中A组为PCV2疫苗免疫组，B组、C组为试验组，D组为无关蛋白对照组，具体分组情况如表7所示。

表7 试验动物分组及接种制剂

(2)PCV2抗体水平检测

接种后第14d后采血分离血浆，检测不同免疫组仔猪的PCV2抗体水平。ELISA抗体检测具体步骤如下：PCV2cap蛋白包被酶标板(1μg/mL)，100μL/孔，4℃过夜，PBST洗板3次，5min/次；用200μL 5％脱脂牛奶-PBST加入到每孔进行封闭，37℃孵育2h，PBST洗板3次，5min/次；加入100μL不同倍比稀释的血清到每孔中，37℃孵育30min，PBST洗板3次，5min/次(洗板时避免串孔)；加入体积比为1:5000的HRP标记的抗小鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育30min，弃掉，PBST洗板3次，5min/次；加TMB显色液，37℃避光孵育8min，加2mol/L H₂SO₄ 50μL/孔终止反应，在450nm波长下读取OD值。结果判定：同稀释度待检血清OD₄₅₀nm值/阴性血清OD₄₅₀nm值(P/N)≥2.1为阳性。以P/N值≥2.1的血清最大稀释度作为该血清的ELISA抗体效价。

从图7以看出可溶性猪PD-1重组蛋白能提高PCV2疫苗免疫后的抗体水平，且提高了1.2倍左右(P<0.01)，且相对于无关蛋白对照组，可溶性猪PD-1重组蛋白组的抗体水平升高显著(P<0.05)。

(3)猪PBMCs的分离

在接种后，第14d抽取前腔静脉全血5mL，具体步骤参考如下：

1)在猪前腔静脉抽取抗凝全血(10％柠檬酸钠抗凝剂为10％)，并将全血用等体积含2％血清的PBS稀释。

2)稀释血缓慢加到等体积淋巴细胞分离液上方，使其平铺在分离液上方，保持稀释血液与分离液的界面清晰。水平离心，室温，2000r/m，25min。

3)离心后将出现明显的分层：由上往下依次是稀释的血浆层、淋巴细胞层、透明的分离液层，最下面是红细胞与粒细胞。

4)轻轻的吸取血浆层与分离液中间白膜层即淋巴细胞到15mL无菌的离心管中，10mL含2％血清的PBS洗涤白膜层。1500r/m，离心10min。

5)弃上清，根据白细胞中的红细胞量加入3倍体积的红细胞裂解液，冰上进行裂解，期间每隔几分钟便轻轻晃动几次，裂解15min左右，直至白色，4℃，2000r/m离心10min，小心彻底洗去上清。

6)5mL含2％血清的PBS重悬细胞，1500r/m，离心10min。

7)重复步骤6)。

8)弃上清，细胞重悬备用。

(4)利用流式细胞术分析可溶性猪PD-1重组蛋白对PBMCs的增殖作用

为了确定可溶性猪PD-1重组蛋白是否能促进PCV2疫苗免疫后的细胞增殖反应，在接种14d抽取前腔静脉全血5mL分离PBMCs，用RPMI1640不完全培养基调整至1×10⁶个/mL，每1mL细胞中加入2μL CFSE的储存液(终浓度为10μM)，用CFSE法和CCK-8检测其增殖活性。将CFSE处理过的PBMCs培养4d后，利用流式细胞术检测T细胞增殖情况。检测结果如图8所示：A：31.26±4.10％，B：73.12±13.80％，C：51.94±27.92％，D：39.87±10.86％(多次重复试验的平均增殖百分比)，结果表明，T细胞的增殖结果表明：0.2mg/mL可溶性猪PD-1重组蛋白组显著高于疫苗对照组(p<0.01)，且与无关对照组相比，增殖明显(p<0.05)，而其他免疫组与疫苗对照组相比，差异不显著(p>0.05)。

(5)CCK-8检测可溶性猪PD-1重组蛋白对细胞增殖的影响

将分离的PBMCs，用10％胎牛血清和10％阴性猪血清的RPMI1640培养基调整至1×10⁶个/mL，然后将细胞加入到96孔板中，每组做3个重复，同时设置培养基对照，37℃、5％CO₂培养箱培养4d后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，继续培养2h后，利用酶标仪测定各孔OD₄₅₀nm，增殖指数(SI)＝试验组OD₄₅₀nm值/疫苗对照组OD₄₅₀nm值。通过以上数据分析，获得内毒素的毒性对细胞增殖的影响。结果如图9所示，得到了与图8相同的结果，说明接种可溶性猪PD-1重组蛋白能促进PBMCs增殖，增强免疫效果。

(6)荧光定量PCR检测细胞因子的转录变化

为研究猪可溶性猪PD-1重组蛋白在体内对单核细胞免疫效果影响，在14d分离提取PBMCs，利用荧光定量PCR方法检测IL-2、IL-12和IFN-γmRNA转录变化情况，判断机体的免疫状态。

结果如图10所示，与疫苗对照组相比，在接种14d后，加入可溶性猪PD-1重组蛋白组的PD-1转录变化不明显，但PD-L1的转录相对于疫苗和无关蛋白对照组相比，明显降低(p<0.01)。加入低剂量可溶性猪PD-1重组蛋白组的IL-2的表达量相对于疫苗对照组和无关对照组显著上调(p<0.01)，而加入0.2mg/kg可溶性猪PD-1重组蛋白组相对于疫苗对照组能显著上调IL-12和IFN-γ的表达(p<0.01)，但与无关对照组相比，IFN-γ的升高比较明显(p<0.05)，而IL-12虽然有升高但上调不明显(p>0.05)。但高剂量可溶性猪PD-1重组蛋白组上调变化不明显(p>0.05)，说明可溶性猪PD-1重组蛋白能够提高细胞因子的转录水平。

(7)可溶性猪PD-1重组蛋白对仔猪血浆细胞因子含量变化的影响

PCV2感染后用可溶性猪PD-1重组蛋白阻断PD-1/PD-L1通路，第14d时分离血浆，ELISA检测IL-2、IL-12和IFN-γ的分泌情况，研究可溶性猪PD-1重组蛋白在体内对免疫反应的影响，同时设置PSA无关蛋白和免疫疫苗对照组。将分离得到的血浆利用ELISA方法检测IL-2、IL-12和IFN-γ的变化，具体操作步骤按照武汉云克隆科技股份有限公司的试剂盒说明书进行。

结果如图11所示，与疫苗对照组相比，低剂量可溶性猪PD-1重组蛋白组IL-2的表达量显著升高(p<0.01)，其余免疫组IL-2表达量虽然升高，无显著性差异(p>0.05)。0.2mg/kg可溶性猪PD-1重组蛋白组IL-12的分泌明显升高(p<0.05)，但0.4mg/kg可溶性猪PD-1重组蛋白组接近正常水平，差异不显著(p>0.05)。说明可溶性猪PD-1重组蛋白能够提高细胞因子IL-2和IL-12的蛋白水平。

(8)利用流式细胞术检测外周血中CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞亚群的变化

在第14d提取PBMCs，将分离得到的猪PBMCs，用无菌PBS洗涤3次，将细胞浓度调整为1×10⁶个/mL，根据抗体说明书加入0.2μg anti-CD4-PE和0.2μg anti-CD8-APC，4℃孵育30min，并且同时设置空白对照和单染对照。

如图12所示，结果显示，猪CD4⁺、CD8⁺ T细胞亚群比例情况，疫苗对照组(A)：0.8±0.30，0.2mg/kg可溶性猪PD-1重组蛋白组(B)：1.63±0.11，0.2mg/kg可溶性猪PD-1重组蛋白组(C)：1.55±0.20，无关蛋白对照组(D)：1.2±0.63。结果表明，与疫苗对照组(A)相比，其他免疫组CD4⁺/CD8⁺ T细胞的比例升高，尤其是低剂量蛋白组升高更明显(P<0.01)，但与无关蛋白组相比变化不明显(P>0.05)，说明可溶性猪PD-1重组蛋白可显著提高CD4⁺/CD8⁺ T细胞的比例。

综合上述分析可知，可溶性猪PD-1重组蛋白在体内能够促进PBMCs的增殖、提高正向免疫调节细胞因子IL-2、IL-12以及IFN-γ的基因转录水平和蛋白表达水平、促进外周血中CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞亚群的比例升高。

序列表

<110> 新乡学院

<120> 大肠杆菌偏嗜性可溶性猪PD-1重组蛋白的制备及应用

<130> 重组蛋白的制备

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Pro Ser Glu Pro Lys

1 5 10 15

His Phe Ile Leu Asn Trp Tyr Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp

20 25 30

Lys Leu Ala Ala Phe Ser Glu Asp Gly Ser Gln Pro Gly Arg Asp Pro

35 40 45

Arg Phe His Val Thr Pro Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser

50 55 60

Val Val Ala Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Gly Ala

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Pro Pro Lys Thr Gln Ile Asn Glu Ser His Gln Ala Lys

85 90 95

Leu Thr Val Thr Glu Arg Val Leu Glu Leu Pro Thr Glu His Pro Ser

100 105 110

Cys Pro Pro Arg Pro Glu Gly His Leu Glu Gly Gln Val Leu Val Ile

115 120 125

Thr Ser

130

<210> 2

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gaaggcgcca acgccacctt cacctgcagc ttcccgagcg aaccgaagca cttcatcctg 60

aactggtacc gcctgagccc cagcaaccag accgacaagc tggccgcctt cagcgaggac 120

ggcagccagc cgggccgtga cccgcgtttc cacgtcaccc cgctgccgaa cggacgagac 180

ttccacatga gcgtggtggc cacccgtcgt aacgacagcg gcacctactt ctgtggggcc 240

atctacctgc cgccgaagac ccagatcaac gaaagccatc aggcaaagct gaccgtgacc 300

gaacgtgtcc tggaactgcc gaccgaacac ccgagctgcc cgccgcgtcc cgaaggccac 360

ctggaaggcc aggtcctggt catcaccagc 390

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cggaattcga aggcgccaac gccacc 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ccctcgaggc tggtgatgac caggac 26

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ggacttcgag caggagatgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

aggaaggagg gctggaagag 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cattgcacta acccttgcac tc 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ggctccagtt gtttctttgt gtt 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tcaggggaca tcatcaaacc aga 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gaacaccaaa catcagggaa aag 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

gaggttccta aatggtagct ctgg 24

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

tctgacttct cttccgcttt ctt 23