一种2’-岩藻糖基乳糖的分批发酵方法
阅读说明：本技术 一种2’-岩藻糖基乳糖的分批发酵方法 (Batch fermentation method of 2' -fucosyllactose ) 是由 王硕 王远一飞 于 2021-01-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种2’-岩藻糖基乳糖的分批发酵方法,该方法在原有基础上更适用于大规模发酵,生产效率和最终产量更高,更易于工业扩大培养,具有较高的应用前景和经济价值。本发明使用的发酵培养基组分简单,无有毒有害成分,经济廉价且易于获得,并且能得到较优的发酵效果和较高的2’-岩藻糖基乳糖产量。(The invention discloses a batch fermentation method of 2' -fucosyllactose, which is more suitable for large-scale fermentation on the original basis, has higher production efficiency and final yield, is easier for industrial expanded culture, and has higher application prospect and economic value. The fermentation medium used in the invention has simple components, no toxic and harmful components, economy, low price and easy acquisition, and can obtain better fermentation effect and higher 2' -fucosyllactose yield.)
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种2’-岩藻糖基乳糖的发酵罐分批发酵方法。
背景技术
2’-岩藻糖基乳糖(2’-Fucosyllactose，2’-FL)是母乳低聚糖中含量最高的一种，其分子量为488.44Da。它通过α1-2糖苷键连接岩藻糖残基和乳糖的半乳糖端，是一种十分特殊的天然三糖。2’-FL作为一种中性寡糖，可以抵御人体胃肠道酶类的消化作用，因此它可以直接到达人体的结肠部位，被人体肠道的微生物消化分解，促进相关有益菌的增殖，起到益生元的作用。
近年来，大量研究表明，口服2’-FL可调节乳鼠的免疫功能，减轻炎症，增强肠屏障功能，降低过敏反应，甚至提高小鼠的认知能力。此外，研究还表明2’-FL对病原体感染具有保护作用。此外，2015年和2016年，FDA和欧盟也相继批准将2’-FL添加到婴幼儿配方奶粉中，甚至作为膳食补充剂和新型食品。商业上，也有许多公司在婴儿配方奶粉中添加了2’-FL，试图缩小配方奶粉和母乳之间的差距。但由于2’-FL只在母乳中发现大量存在，而其他哺乳动物中存在痕量或完全没有，只能通过人工合成的方式来获取，所以造价昂贵且安全性堪忧。因此，安全大量的获取2’-FL是业内一直以来探索的热点。目前2’-FL主要的合成途径有三种，化学合成，酶法合成以及微生物合成。Craft等人在2017年用化学法合成了多种母乳寡糖，其中包括2’-FL，但其步骤繁琐，副产物复杂，且产量不高；Alberman等率先于2001年用酶法合成了2’-FL，Choi等用双酶法从甘露糖合成2’-FL，但生产条件苛刻，且工具酶生产本身就需要复杂的生产过程，且价格不菲；微生物合成生产的2’-岩藻糖基乳糖，相对于其他生产方法其产能高，易扩大，更安全，Lee等就于2012年利用大肠杆菌生产出了2’-FL，其产量高达1.2g/L，近年来也有国内外其他团队被报道超过此产量，但相对于其他功能性聚糖动辄数百克每升的产量，2’-FL的产量还需要很大的上升空间。
对于生物法合成2’-FL，除了大肠杆菌系统外，还有大量其他工程菌系统。Yu等于2018年也利用酿酒酵母生产2’-FL，其产量达0.5g/L。另外也有通过构建枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌来生产2’-FL的，但因为其体系复杂且不稳定，产量远不如大肠杆菌体系。因此，就目前技术而言，探究一种高效生产2’-FL的大肠杆菌发酵工艺，对2’-FL的生产应用以及科学研究是极其必要的。
发明内容
简言之，本发明总体上披露了一种利用大肠杆菌E.coli-XYY1生产2’-岩藻糖基乳糖的发酵罐分批发酵方法，该方法简单易操作，产量稳定且较现有方法产量更高，更稳定。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种2’-岩藻糖基乳糖的分批发酵方法，由如下步骤组成：
1)制备一级种子发酵液：取-80冰箱冻藏甘油株大肠杆菌，按体积百分比1-5％接种量接种于LB培养基中，37℃220rpm摇床培养4-8h；
2)制备二级种子发酵液：取一级种子发酵液按体积百分比5-10％接种量接种于LB培养基中，37℃220rpm摇床培养3-6h；
3)分批发酵：配制培养基灭菌后，按体积百分比10-20％接种量取二级种子发酵液接种，37℃400-600rpm搅拌，通气0.8-1.5vvm，恒定pH 7.0，(通过发酵罐的恒定pH模式，自动添加酸碱液，碱液为25％氨水，酸液为10％磷酸)，发酵4-6h后加入诱导剂0.2mM，随后温度设置为30℃，搅拌速度降为300-400rpm，通气量降至0.5-1vvm，添加诱导剂2-4h后添加底物乳糖至10-15g/L，添加消泡剂0.05mL/L，持续发酵96h后结束。
优选的，所述分批发酵在摇瓶或发酵罐中完成。
优选的，所述诱导剂是IPTG。
优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coli-XYY1。
优选的，所述消泡剂为聚二甲基硅氧烷。
一种2’-岩藻糖基乳糖的分批发酵方法，分批发酵中配制的培养基具体配方如下：
其中，酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、MgSO4、CaCl2、甲硫氨酸需要单独分消后补入发酵罐。
优选的，微量元素溶液如下：
优选的，金属溶液如下：
本发明的一个目的在于提供一种利用大肠杆菌E.coli-XYY1从头生产2’-岩藻糖基乳糖的培养基组分。该培养基主要用于大肠杆菌E.coli-XYY1在发酵罐中通过从头途径发酵生产2’-岩藻糖基乳糖，但不限于特定菌种或特定发酵罐。扩大的，一切大肠杆菌在发酵罐中通过从头途径发酵生产2’-岩藻糖基乳糖均可采用此方法。扩大的，一切利用大肠杆菌通过从头途径发酵生产2’-岩藻糖基乳糖均可采用此方法。培养基中葡萄糖是该菌株的唯一碳源和底物之一，NH4Cl是唯一的氮源，其含量的变化对菌体生长和产物产出有极大影响。含量过多和过少得到的产物的量都会减少。
本发明的另二个目的在于提供一种利用大肠杆菌E.coli-XYY1从头生产2’-岩藻糖基乳糖的发酵罐分批发酵方法。该发酵方法使用的培养基为本发明上述培养基组分，但不限于特定培养基组分或特定发酵罐的规格。扩大的，一切利用大肠杆菌E.coli-XYY1从头生产2’-岩藻糖基乳糖的分批发酵均适用此方法。扩大的，一切利用大肠杆菌从头生产2’-岩藻糖基乳糖的分批发酵均适用此方法。扩大的，一切利用大肠杆菌从头生产2’-岩藻糖基乳糖的发酵均适用此方法。
本发明相对于现有技术其积极效果在于：
1)本发明使用的发酵培养基组分简单，无有毒有害成分，经济廉价且易于获得，并且能得到较优的发酵效果和较高的2’-岩藻糖基乳糖产量。
2)本发明使用的发酵条件简单易行，易于扩大，并且能得到较优的发酵效果和较高的2’-岩藻糖基乳糖产量，配合本发明的培养基配方，可以得到4-10g/L的2’-岩藻糖基乳糖。之前不同菌株和不同发酵方法得到的浓度差异巨大，本专利可以确保产物浓度在4-10g/L，浓度稳定，具有较高的经济价值。
3)本发明中添加的甲硫氨酸、曲拉通和吐温-80均在原有发酵方法中不曾见到，添加甲硫氨酸可减少发酵过程中菌株产生的乙酸对自己生长的抑制作用，添加曲拉通和吐温-80可以加快产物从胞内向胞外的转运。以及在诱导发酵阶段减缓发酵搅拌速率，这些都提高了发酵的产物的产量。
附图说明：
图1是原有发酵方法和本发明发酵方法得到的发酵液在示差检测器下的液相色谱图
图2是不同NH4Cl浓度对2’-岩藻糖基乳糖产量的影响
图3是不同葡萄糖浓度对2’-岩藻糖基乳糖产量的影响
图4是不同接种量对2’-岩藻糖基乳糖产量的影响
图5是不同搅拌速率对2’-岩藻糖基乳糖产量的影响
图6是不同通气量对2’-岩藻糖基乳糖产量的影响
图7是不同IPTG添加时间对2’-岩藻糖基乳糖产量的影响
图8是不同诱导温度对2’-岩藻糖基乳糖产量的影响
图9是不同甲硫氨酸浓度对2’-岩藻糖基乳糖产量的影响
图10是诱导发酵阶段不同通气量对2’-岩藻糖基乳糖产量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。一切熟悉本领域的技术人员均可在此发明的基础上加以改编和应用，以适应自身工艺的需求。
在实施例中2’-岩藻糖基乳糖的定量方式采用液相色谱外标定量法，仪器型号为Waters Binary HPLC Pump 1525-Detector 2414/2489，色谱柱采用Phenomenex RezexROA-Organic Acid H+(8％)，2’-岩藻糖基乳糖标准品采用日本Glycarbo的98％标准品。
实施例1：
使用5L容积的移位发酵罐进行发酵操作，装液量为3L。
1)制备一级种子发酵液：取-80冰箱冻藏甘油株大肠杆菌E.coli-XYY1，按2％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃220rpm摇床培养8h。
2)制备二级种子发酵液：取一级种子发酵液30mL接种于300mL LB培养基中，37℃220rpm摇床培养4h。
3)发酵罐培养基配置：在5L罐内加入Na2HPO4·12H2O 51.3g，NaCl 1.5g，KH2PO49g，NH4Cl 12g，曲拉通0.3mL，吐温-800.3mL，用去离子水定容至2L，置于121℃高温灭菌锅中灭菌15min，随后冷却至37摄氏度。另外配置MgSO4 72mg于10mL去离子水，CaCl2 13.5mg于10mL去离子水，葡萄糖48g于500mL去离子水，酵母浸粉0.75g于100mL去离子水，蛋白胨1.5g于100mL去离子水，分别于121℃高温灭菌锅中灭菌15min，冷却至37摄氏度后无菌操作加入发酵罐内。另外取甲硫氨酸150mg于10mL去离子水，取维生素溶液3mL和金属溶液3mL，分别过0.22μm水系滤膜除菌后加入发酵罐。
维生素溶液需提前配置，配方为：称取VB-x 120mg，VB3 8mg，VB6 1.5mg，VB12 5mg，VB7 1mg，VB5 5mg，VB1 10mg，VB2 2.5mg，VB9 1mg，硫辛酸2.5mg，溶于100mL去离子水中，避光4℃保存。金属溶液需提前配置，配方为：称取FeCl3·6H2O 250mg，ZnCl2 20mg，H3BO3 5mg，Na2MoO4·2H2O 20mg，CuSO4·5H2O 20mg，CoSO4·7H2O 10mg溶于100mL去离子水，避光4℃保存。
4)分批发酵：取300mL二级种子发酵液接种于发酵罐中，37℃500rpm搅拌，通气1vvm，恒定pH 7.0(碱液为25％氨水，酸液为10％磷酸)，发酵4h后加入无菌0.1M IPTG 6mL，温度设置为30℃，搅拌速度降为300rpm，通气量降为0.6vvm。2h后加入10％无菌乳糖溶液300mL，添加消泡剂聚二甲基硅氧烷0.2mL，持续发酵96h后卸罐并用液相色谱检测其组分，其中2’-岩藻糖基乳糖浓度为4.17g/L。
实施例2：
使用30L容积的原位发酵罐进行发酵操作，装液量为20L。
1)制备一级种子发酵液：取-80冰箱冻藏甘油株大肠杆菌E.coli-XYY1，按5％接种量接种于100mL LB培养基中，37℃220rpm摇床培养6.5h。
2)制备二级种子发酵液：取一级种子发酵液100mL接种于2L LB培养基中，37℃220rpm摇床培养6h。
3)发酵罐培养基配置：在30L罐内加入Na2HPO4·12H2O 342g，NaCl 10g，KH2PO460g，NH4Cl 80g，曲拉通2mL，吐温-802mL，用去离子水定容至13L，设置121℃高温蒸汽灭菌15min，随后冷却至37摄氏度。另外配置MgSO4 480mg于10mL去离子水，CaCl2 90mg于10mL去离子水，葡萄糖320g于1.6L去离子水，酵母浸粉5g于500mL去离子水，蛋白胨10g于500mL去离子水，分别于121℃高温灭菌锅中灭菌15min，冷却至37摄氏度后无菌操作加入发酵罐内。另外取甲硫氨酸1g于100mL去离子水，取维生素溶液20mL和金属溶液20mL，分别过0.22μm水系滤膜除菌后加入发酵罐。维生素溶液和金属溶液需提前配置，配方与实例1相同。
4)分批发酵：取2L二级种子发酵液接种于发酵罐中，37℃600rpm搅拌，通气1.5vvm，恒定pH 7.0(碱液为25％氨水，酸液为10％磷酸)，发酵6h后加入无菌0.1M IPTG20mL，温度设置为30℃，搅拌速度降为400rpm，通气量降为0.6vvm。再2h后加入10％无菌乳糖溶液2L，添加消泡剂聚二甲基硅氧烷1mL，持续发酵96h后卸罐并用液相色谱检测其组分，其中2’-岩藻糖基乳糖浓度为6.22g/L。
实施例3
使用30L容积的原位发酵罐进行发酵操作，装液量为20L。
(1)制备一级种子发酵液：取-80冰箱冻藏甘油株大肠杆菌E.coli-XYY1，按3％接种量接种于100mL LB培养基中，37℃220rpm摇床培养6h。
(2)制备二级种子发酵液：取一级种子发酵液100mL接种于2L LB培养基中，37℃220rpm摇床培养4h；
(3)发酵罐培养基配置：在30L罐内加入Na2HPO4·12H2O 342g，NaCl 10g，KH2PO460g，NH4Cl 80g，曲拉通2mL，吐温-802mL，用去离子水定容至13L，设置121℃高温蒸汽灭菌15min，随后冷却至37摄氏度。另外配置MgSO4 480mg于10mL去离子水，CaCl2 90mg于10mL去离子水，葡萄糖320g于1.6L去离子水，酵母浸粉5g于500mL去离子水，蛋白胨10g于500mL去离子水，分别于121℃高温灭菌锅中灭菌15min，冷却至37摄氏度后无菌操作加入发酵罐内。另外取甲硫氨酸1g于100mL去离子水，取维生素溶液20mL和金属溶液20mL，分别过0.22μm水系滤膜除菌后加入发酵罐。维生素溶液和金属溶液需提前配置，配方与实例1相同。
(4)分批发酵：取2L二级种子发酵液接种于发酵罐中，37℃500rpm搅拌，通气1.2vvm，恒定pH 7.0(碱液为25％氨水，酸液为10％磷酸)，发酵5h后加入无菌0.1M IPTG20mL，温度设置为30℃，搅拌速度降为350rpm，通气量降为0.6vvm。3h后加入10％无菌乳糖溶液2L，添加消泡剂聚二甲基硅氧烷1mL，持续发酵96h后卸罐并用液相色谱检测其组分，其中2’-岩藻糖基乳糖浓度为6.22g/L。
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