用于防治黄单胞菌的杀菌剂及其应用
阅读说明：本技术 用于防治黄单胞菌的杀菌剂及其应用 (Bactericide for preventing and treating xanthomonas and application thereof ) 是由 王莉 武瑶 汪艳丽 孟繁凡 钱韦 黄贵修 时涛 于 2021-01-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及农业保护技术领域,公开了用于防治黄单胞菌的杀菌剂及其应用。所述杀菌剂含有麝香草酚和/或原儿茶酸。所述用于防治黄单胞菌的杀菌剂属于从植物中提取的植物源杀菌剂,具有高效、低毒、环境友好、持久性好以及可降解的特点。(The invention relates to the technical field of agricultural protection, and discloses a bactericide for preventing and treating xanthomonas and application thereof. The bactericide contains thymol and/or protocatechuic acid. The bactericide for preventing and treating xanthomonas belongs to a botanical bactericide extracted from plants, and has the characteristics of high efficiency, low toxicity, environmental friendliness, good durability and degradability.)
技术领域
本发明涉及农业保护技术领域，具体涉及用于防治黄单胞菌的杀菌剂及其应用。
背景技术
由病原微生物导致的农作物病害是造成我国农业生产巨大损失，危害国家粮食生产安全的重大祸患。传统的病害防治技术存在低效、抗生素滥用和过度使用、化学农药环境污染、对人畜存在安全隐患等缺点，总体上不能满足植物病害防治的需求。因此有必要针对重要作物病害实现病原菌的绿色防控，发展环境污染小，杀菌效果明显以及可降解的植物源杀菌剂新技术。
黄单胞菌属细菌(Xanthomonas)属于γ变形杆菌纲，黄单胞菌目，黄单胞菌科，是革兰氏阴性细菌中的一个大属。黄单胞菌属细菌包括27种植物相关的病原菌，会导致400种以上的植物产生严重病害，包括重要农作物水稻，柑橘，白菜和辣椒等。此属中的模式物种野油菜黄单胞菌(X.campestris pv.campestris,Xcc)能侵染所有十字花科植物，引起黑腐病，病原菌沿植物维管束从叶缘开始扩散形成V型病害。由水稻黄单胞菌X.oryzaepv.oryzicola(Xoc)和X.oryzae pv.oryzae(Xoo)引起的水稻白叶枯病，是常见的两类水稻细菌性病害，在世界各大稻区均有发生，是水稻的主要病害之一。柑橘溃疡病菌(X.citripv.citri)引起的柑橘溃疡病，发病率高、传播快、寄主范围广，被认为是世界柑橘生产的重要检疫性病害。地毯草黄单胞菌木薯萎蔫致病变种(X.axonopodis pv.manihotis，Xam)引起的细菌性萎蔫病严重影响了热带重要粮食作物木薯的产量，是我国广东、广西、海南和云南等木薯产区的主要病害。
目前黄单胞菌病害防治主要采取化学杀菌和生物防治的措施。最常用的化学杀菌剂是铜和铜制剂，然而，过去几十年来铜制剂的大面积使用产生了严重抗药性和环境污染问题，其它杀菌剂如比斯替噻唑、链霉素、土霉素、春日霉素以及苯甲酰-S-甲基等也或多或少的出现了单药耐药和多药耐药性。另外，特异性细菌病毒—噬菌体，细菌天然拮抗剂淀粉芽孢杆菌MBI 600、短小芽孢杆菌QST 2808等生防菌等也取得了较好的黄单胞菌杀菌效果。尽管如此，细菌随机突变的快速发生限制了噬菌体和生防菌的长期使用。因此植物提取物中具有高效、低毒、环境友好以及可降解活性的杀菌剂成为植物病害绿色防控的一种替代方法。
麝香草酚(Thymol)，又名百里香酚，化学名称5-甲基-2-异丙基酚，是从百里香油、牛至油、丁香罗勒等植物中提取的单萜酚类化合物。麝香草酚不仅具有抗真菌、细菌、霉菌、寄生虫等活性，还是尸体防腐剂。以麝香草酚为主要成分，进行单体、二元或多元混配的相关技术专利包括：用于防治蜂螨、蠕虫的组合物(KR20200122613A，槲皮素和百里香酚二元混配，防治蜂螨；GR1009197B，除虫菊、香叶醇和/或百里香酚混合物，作为杀虫剂使用)。抗细菌、真菌组合物(CN110559423A，同时使用万古霉素和百里香酚，可清除生物膜粘附细菌；ZA201806217B，百里香酚、松油醇、阳离子磷脂络合物三元混合物，是广谱杀菌剂；PL2687095(T3)，香芹酚或百里香酚与铜制剂等混合物，可防止真菌感染；CN108719457A，百里香酚纳米乳液可作为广谱杀菌剂；CN109463384A，百里香酚与类胡萝卜素的混合物，适用于玉米和蔬菜灰霉病的防治；CN109819992A，吡咯菌酯和百里香酚二元组合，用于控制白粉病，霜霉病，结痂病，叶斑病和观赏植物和农作物如果树，蔬菜的瘟疫等；CN106511325A，百里香酚单体用于沙门氏菌感染；CN111183991A，百里香酚，香芹酚和薄荷醇三元组合，对多种农作物的灰霉病和白粉病具有很强的杀灭作用；CN107306972A，百里酚与苯并噻唑啉酮和其他农药进行单体混合或二元混合，控制包括水稻白叶枯病在内的植物病害；CN105123803A，百里香酚和春日霉素二元混合，用于防治由真菌类真菌引起的葡萄，黄瓜，西红柿，土豆等多种作物上的霜霉病和瘟疫等疾病；CN104478607A，百里香酚、异戊烯基腺嘌呤和氨基酸三元混合物，可防治西瓜白粉病，番茄灰霉病，橙色急性炭疽病，辣椒疫霉病和茄子黄萎病等；CN102106347A，肉桂醛、丁香酚、百里香酚和单宁复合杀菌剂，针对大肠杆菌，绿脓杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，李斯特氏菌；ZA200207674B，RU2002128741A，US2003175283A1，百里香酚、适当比例的薄荷脑和薄荷脑精油或其单萜成分的混合物，可作为第四代草药抗生素制剂；CN110742876A，百里香酚单体，治疗牛皮癣)。饲料添加剂(CN110731422A，百里香酚和粪肠球菌活菌的发酵物质)。虽然专利申请CN107306972A中公开了百里香酚与苯并噻唑啉酮或其它农药的组合可防治水稻白叶枯病，但该组合依然含有能够产生耐药性的抗生素。唯一作为单体的技术是治疗牛皮癣。
原儿茶酸(Protocatechuic acid,PCA)，又名3,4-二羟基苯甲酸，是许多水果蔬菜中具有抗氧化作用的天然酚酸类化合物，具有抗衰老、抗炎、抗菌、抗病毒以及保护心脏、神经和肾脏等多种生理活性。体外实验表明，原儿茶酸对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、幽门螺旋杆菌等均有抑制作用。原儿茶酸可以有效降低耐药幽门螺旋杆菌的脲酶活性，90％被测幽门螺旋杆菌的最小抑菌浓度(MIC)值为256μg/mL。微量稀释法测定原儿茶酸抑制鼠伤沙门氏菌的最小抑菌浓度为2.0mg/mL，扫描电镜结果显示PCA处理的细菌极性末端完全裂解，细菌内容物释放导致细胞死亡，这可能是因为PCA破坏了细菌外膜的净电平衡，导致外膜通透性变化，也可能是细菌膜周围相对酸度降低、氧化程度提高使膜功能和代谢过程破坏。从类芽孢杆菌属细菌Paenibacillus elgii HOA73分离纯化的原儿茶酸对草莓果实真菌病害灰葡萄孢菌具有杀菌作用，其抑菌浓度为64μg/mL。专利申请CN104523670A、CN102151256A介绍了原儿茶酸在防治畜禽病毒感染性疾病中的应用。
综上，在现有技术中，并没有其它发明提及或描述了百里香酚和原儿茶酸单体在防治植物病原菌黄单胞菌中的用途。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的杀菌效果差、毒性高、污染环境、不可降解以及易产生耐药性的问题，提供用于防治黄单胞菌的杀菌剂及其应用。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种用于防治黄单胞菌的杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂含有麝香草酚和/或原儿茶酸。
优选地，所述杀菌剂还含有生产上允许的助剂和载体。
优选地，所述生产上允许的助剂和载体包括分散剂、润湿剂、乳化剂、粘着剂、增稠剂、防冻剂、消泡剂、稀释剂、溶剂和其他惰性载体。
优选地，所述杀菌剂的剂型是生产上允许的任意固体或液体剂型。
优选地，所述杀菌剂的剂型包括粉剂、可溶性粉剂、可湿性粉剂、粒剂、水剂、乳油、微乳剂、水乳剂、水分散粒剂、悬浮剂、烟剂、缓释剂或油剂。
优选地，所述黄单胞菌包括十字花科植物病原菌野油菜黄单胞菌和/或大戟科植物木薯病原菌地毯草黄单胞菌。
优选地，所述杀菌剂中麝香草酚的浓度≥0.48mg/mL。
优选地，所述杀菌剂中原儿茶酸的浓度≥0.96mg/mL。
本发明第二方面提供上述用于防治黄单胞菌的杀菌剂在黄单胞菌引起的植物病害防治中的应用。
优选地，所述杀菌剂的施用方法包括植株喷雾、灌根和种子处理。
本发明所述的用于防治黄单胞菌的杀菌剂，属于从植物中提取的植物源杀菌剂，具有高效、低毒、环境友好、持久性好以及可降解的特点。
附图说明
图1是实施例1中麝香草酚和原儿茶酸对Xam的MIC示意图；
图2是实施例1中麝香草酚和原儿茶酸对Xcc的MIC测定曲线图；
图3是实施例2中麝香草酚和原儿茶酸对Xam和Xcc的生长抑制曲线；
图4是实施例3中麝香草酚和原儿茶酸抑制Xam和Xcc生物膜活性检测的结果；
图5是实施例4中麝香草酚和原儿茶酸抑制Xam的游动性检测结果；
图6是实施例5中原儿茶酸和麝香草酚对Xam和Xcc杀菌效果观察图；
图7是实施例6中麝香草酚和原儿茶酸抑制Xam和Xcc在寄主植物甘蓝和木薯生长的效果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明公开了麝香草酚和原儿茶酸新的用途，麝香草酚和原儿茶酸可以作为防治黄单胞菌的植物源有效杀菌成分，应用于黄单胞菌引起的植物病害防治。
本发明提供了提供一种用于防治黄单胞菌的杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂含有麝香草酚和/或原儿茶酸。
在本发明中，所述杀菌剂还含有生产上允许的助剂和载体。所添加的助剂或载体本申请不是必要的活性成分，且施药后对作物安全。
在优选的实施方式中，所述生产上允许的助剂和载体包括分散剂、润湿剂、乳化剂、粘着剂、增稠剂、防冻剂、消泡剂、稀释剂、溶剂和其他惰性载体。
在本发明中，所述杀菌剂的剂型是生产上允许的任意固体或液体剂型。
在优选的实施方式中，所述杀菌剂的剂型包括粉剂、可溶性粉剂、可湿性粉剂、粒剂、水剂、乳油、微乳剂、水乳剂、水分散粒剂、悬浮剂、烟剂、缓释剂或油剂。
在优选的实施方式中，所述黄单胞菌包括十字花科植物病原菌野油菜黄单胞菌和/或大戟科植物木薯病原菌地毯草黄单胞菌。
在优选的实施方式中，所述杀菌剂中麝香草酚的浓度≥0.48mg/mL。
在优选的实施方式中，所述杀菌剂中原儿茶酸的浓度≥0.96mg/mL。
本发明第二方面提供上述用于防治黄单胞菌的杀菌剂在黄单胞菌引起的植物病害防治中的应用。
在优选的实施方式中，所述杀菌剂的施用方法包括植株喷雾、灌根和种子处理。
在本发明中，麝香草酚和原儿茶酸这两种杀菌单体效果良好，毒副作用小，能更持久的防治黄单胞菌引起的植物病害。杀菌剂通过破坏菌体结构，导致胞质内容物泄露，从而达到杀菌的目的，可用于防治细菌萎蔫病，是化学农药和抗生素的绿色替代药物。在麝香草酚的浓度为0.48mg/mL，原儿茶酸的浓度为0.96mg/mL时能就够完全抑制细菌生长，防治细菌病害。尤其对十字花科植物病原菌野油菜黄单胞菌(Xcc)和大戟科植物木薯病原菌地毯草黄单胞菌(Xam)具有优异的抗菌效果。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
以下实施例以十字花科植物病原菌野油菜黄单胞菌(Xcc)和大戟科植物木薯病原菌地毯草黄单胞菌(Xam)为研究对象，验证了麝香草酚和原儿茶酸对于黄单胞菌引起的植物病害的防治效果。
实施例1
麝香草酚对最小抑菌浓度(MIC)的测定方法包括如下步骤：
麝香草酚溶于50％乙醇，配成77.10mg/mL的母液，使用时用细菌NYG培养基(蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，甘油20g/L，pH＝7.0)稀释到适当浓度。采用液体二倍稀释法检测最小抑菌浓度。将200μL浓度为15.42mg/mL的麝香草酚溶液添加到96孔板中，取100μL与等体积的NYG培养基二倍系列稀释，化合物终浓度为7.71、3.85、1.93、0.96、0.48、0.24、0.12、0.06mg/mL。28℃生长过夜的细菌用NYG培养基调OD600＝0.4，稀释1000倍，取100μL加入到培养板中。28℃静置培养24小时。酶标仪测定OD600值，MIC值为没有可见细菌生长的最低浓度。
原儿茶酸对最小抑菌浓度的测定方法包括以下步骤：
原儿茶酸溶于水，配成77.10mg/mL母液，使用时用细菌NYG培养基(蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，甘油20g/L，pH＝7.0)稀释到适当浓度。采用液体二倍稀释法检测最小抑菌浓度。将200μL浓度为30.84mg/mL的原儿茶酸溶液添加到96孔板中，取100μL与等体积的NYG培养基二倍系列稀释，使化合物的终浓度为15.42、7.71、3.85、1.93、0.96、0.48、0.24、0.12mg/mL。28℃生长过夜的细菌用NYG培养基调OD600＝0.4，稀释1000倍，取100μL加入到培养板中。28℃静置培养24小时。酶标仪测定OD600值，MIC值为没有可见细菌生长的最低浓度。
最小抑菌浓度是药物体外杀菌能力的活性指标，MIC值越小，该化合物的抑菌作用就越强。采用梯度稀释法测定麝香草酚和原儿茶酸的最小抑菌浓度，在96孔板上，用NYG培养基进行二倍稀释，麝香草酚的稀释倍数在5～1285倍，原儿茶酸的稀释倍数是2.5～642.5倍，细菌菌液浓度在10-6～10-7cfu/mL之间，28℃培养24h。麝香草酚和原儿茶酸对Xam的MIC示意图如图1所示，麝香草酚和原儿茶酸对Xcc的MIC测定曲线如图2所示。由图可知，麝香草酚对Xam和Xcc的最小抑菌浓度为0.48mg/mL；原儿茶酸对Xam和Xcc的最小抑菌浓度为0.96mg/mL。原儿茶酸的最小抑菌浓度要高于麝香草酚。
实施例2
生长曲线反映了病原菌随时间增长的抑制作用，麝香草酚抑制细菌生长曲线的检测包括以下步骤：
NYG培养基，28℃生长过夜的细菌用NYG培养基调OD600＝0.4，NYG稀释100倍至OD600＝0.004。麝香草酚溶于50％乙醇，配成50.00mg/mL的母液。取1mL稀释好的细菌溶液至1.5mL Eppendorf离心管，分别加20、10、5、2、1μL麝香草酚母液，配成终浓度为1.00、0.50、0.25、0.10、0.05mg/mL的杀菌剂混合液。取200μL混合液接种生长曲线测定板，28℃，110rpm/min连续培养，每隔2h用酶标仪测定OD600值，直到细菌生长达到稳定期。
生长曲线反映了病原菌随时间增长的抑制作用，原儿茶酸抑制细菌生长曲线的检测包括以下步骤：
NYG培养基，28℃生长过夜的细菌用NYG培养基调OD600＝0.4，NYG稀释100倍至OD600＝0.004。原儿茶酸溶于水，配成50.00mg/mL的母液。取1mL稀释好的细菌溶液至1.5mLEppendorf离心管，分别加20、10、5、2、1μL原儿茶酸母液，配成终浓度为1.00、0.50、0.25、0.10、0.05mg/mL的杀菌剂混合液。取200μL混合液接种生长曲线测定板，28℃，110rpm/min连续培养，每隔2h用酶标仪测定OD600值，直到细菌生长达到稳定期。
将麝香草酚和原儿茶酸按不同浓度加入到病原菌培养液中，观察不同时间点对病原菌Xam和Xcc的生长抑制作用，麝香草酚和原儿茶酸对Xam和Xcc的生长抑制曲线如图3所示。由图3可知，麝香草酚在0.10mg/mL浓度时就表现出了对两种菌的抑制作用，20h后完全抑制它们的生长。原儿茶酸浓度为1.00mg/mL，30h才能够完全抑制两种菌的生长。
实施例3
麝香草酚抑制细菌生物膜活性检测过程如下：
NYG培养基，28℃生长过夜的细菌，10,000rpm室温离心得沉淀，用MMX基本培养基(4.0g/L K2HPO4，6.0g/L KH2PO4，2.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/L柠檬酸三钠，0.2g/L MgSO4·7H2O，5.0g/L葡萄糖，pH＝7.0)重悬清洗两次，重悬至MMX调OD600＝0.4，稀释10倍。麝香草酚溶于50％乙醇，配成50.00mg/mL的母液。取1mL稀释好的细菌溶液至1.5mL Eppendorf离心管，分别加10、5、2μL麝香草酚母液，配成终浓度为0.50、0.25、0.10mg/mL的杀菌剂混合液。取200μL到96孔PVC(Polyvinyl carbonate)细胞培养板中，28℃静置培养48小时后测OD600，轻轻倒掉上清，蒸馏水清洗平板2～3次，自然风干。加入200μL 0.1％的结晶紫溶液，100rpm轻摇30min，倒掉结晶紫溶液，蒸馏水清洗2次，自然风干，加入200μL 95％的乙醇，100rpm轻摇10min，测OD590的吸光度值。生物膜形成的能力表示为：OD590/OD600。
原儿茶酸抑制细菌生物膜活性检测过程如下：
NYG培养基，28℃生长过夜的细菌，10,000rpm室温离心得沉淀，用MMX基本培养基(4.0g/L K2HPO4，6.0g/L KH2PO4，2.0g/L(NH4)2SO4，1.0g/L柠檬酸三钠，0.2g/L MgSO4·7H2O，5.0g/L葡萄糖，pH＝7.0)重悬清洗两次，重悬至MMX调OD600＝0.4，稀释至OD600＝0.04。原儿茶酸溶于水，配成80.00mg/mL的母液。取1mL稀释好的细菌溶液至1.5mLEppendorf离心管，分别加10、5、1.25μL原儿茶酸母液，配成终浓度为0.80、0.40、0.10mg/mL的杀菌剂混合液。取200μL到96孔PVC(Polyvinyl carbonate)细胞培养板中，28℃静置培养48小时测OD600，轻轻倒掉上清，蒸馏水清洗平板2～3次，自然风干。加入200μL 0.1％的结晶紫溶液，100rpm轻摇30min，倒掉结晶紫溶液，蒸馏水清洗2次，自然风干，加入200μL 95％的乙醇，100rpm轻摇10min，测OD590的吸光度值。生物膜形成的能力表示为：OD590/OD600。
生物膜活性高低能够反应杀菌剂的杀菌效果。生物膜的形成能力采用结晶紫染色吸光光度法进行检测。麝香草酚和原儿茶酸抑制Xam和Xcc生物膜活性检测的结果如图4所示，麝香草酚在浓度为0.10mg/mL时就能够显著抑制Xam生物膜的形成，对Xcc来说，浓度为0.25mg/mL时生物膜形成才具有显著差异。随着原儿茶酸浓度的增加，Xam和Xcc的生物膜产量逐渐降低，在0.80mg/mL时生物膜形成降低最显著。
实施例4
麝香草酚抑制细菌游动性检测过程如下：
麝香草酚溶于50％乙醇，配成50.00mg/mL的母液。配制NYG半固体培养基(蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，甘油20g/L，0.3％琼脂，pH＝7.0)，高压灭菌，冷却至50～60℃，取25mL培养基加125μL麝香草酚母液，终浓度为0.25mg/mL，混匀后倒入无菌培养皿，培养基凝固后使用。NYG培养基，28℃生长过夜的细菌，10,000rpm室温离心收集菌体，10mM MgCl2清洗两次，调OD600＝0.4。取1.5μL菌液点到含麝香草酚(0.25mg/mL)的NYG半固体培养基，28℃培养72h，观察菌落形态和大小。
原儿茶酸抑制细菌游动性检测过程如下：
原儿茶酸溶于水，配成80.00mg/mL的母液。配制NYG半固体培养基(蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，甘油20g/L，0.3％琼脂，pH＝7.0)，高压灭菌，冷却至50～60℃，取25mL培养基加125μL原儿茶酸母液，终浓度为0.40mg/mL，混匀后倒入无菌培养皿，培养基凝固后使用。NYG培养基，28℃生长过夜的细菌，10,000rpm室温离心收集菌体，10mM MgCl2清洗菌体两次，调OD600＝0.4。取1.5μL菌液点到含杀菌剂的半固体培养基，28℃培养72h，观察菌落形态和大小。
Xam在亚致死杀菌剂浓度的0.3％NYG固体平板培养3～4天，观察细菌的生长能力、菌体形态的变化。麝香草酚和原儿茶酸抑制病原菌Xam的游动性检测结果如图5所示(使用浓度：0.25mg/mL麝香草酚，0.40mg/mL原儿茶酸)。由图可知，没有添加杀菌剂的Xam生长速度较快，菌落较大，饱满，乳白色，表面光滑。加入0.25mg/mL的麝香草酚后，细菌的生长严重受阻，菌落形态较小，干煸，颜色略深。加入0.40mg/mL原儿茶酸的细菌生长没有受到较大影响，菌落形态依然是乳白色，表面光滑。原儿茶酸抑制细菌游动性的能力不如麝香草酚。
实施例5
透射电子显微镜观察麝香草酚对细菌的损伤的过程如下：
麝香草酚溶于50％乙醇，配成50.00mg/mL的母液。NYG固体培养基高压灭菌，冷却至50～60℃，取25mL培养基加125μL麝香草酚母液，终浓度为0.25mg/mL，混匀后倒入无菌培养皿，培养基凝固后划线接菌。28℃静置培养2天，蘸取少量细菌重悬在水中，悬浮液滴到有膜的铜网格上，静置2min，滤纸吸去多余的溶液。1％磷钨酸(PTA)负染色液染色2～3分钟，滤纸小心去除多余的PTA。网格干燥后透射电子显微镜(JOEL JEM-1400，日本)检查细菌结构变化，验证杀菌效果。
透射电子显微镜观察原儿茶酸对细菌的损伤的过程如下：
原儿茶酸溶于水，配成80.00mg/mL的母液。NYG固体培养基高压灭菌，冷却至50～60℃，取25mL培养基加125μL原儿茶酸母液，终浓度为0.40mg/mL，混匀后倒入无菌培养皿，培养基凝固后划线接菌。28℃静置培养2天，蘸取少量细菌重悬在水中，悬浮液滴到有膜的铜网格上，静置2分钟，滤纸吸去多余的溶液。1％磷钨酸(PTA)负染色液染色2～3分钟，滤纸小心去除多余的PTA。网格干燥后透射电子显微镜(JOEL JEM-1400，日本)检查细菌结构变化，观察杀菌剂的杀菌效果。
原儿茶酸和麝香草酚对病原菌Xam和Xcc杀菌效果观察图如图6所示。由图可知，没有加杀菌剂的Xam呈短杆状，两端较细，菌体形态完整，表面光滑，饱满，无皱褶，总体没有被破坏的菌体；经0.25mg/mL麝香草酚处理后，菌体结构遭到大范围破损，细胞表面龟裂，具有明显细菌胞质泄露现象；虽然0.40mg/mL的原儿茶酸不影响Xam游动性，但菌落形态依然有明显的变形和破损，细胞内容物也大量泄露。图6显示，没有加杀菌剂的Xcc呈长杆状，表面光滑，饱满，无皱褶；经0.25mg/mL麝香草酚处理后，个别细菌菌体结构破损，细胞表面龟裂，不光滑，细胞内容物渗漏导致细菌死亡；0.40mg/mL的原儿茶酸处理后，Xcc菌体表面有分散的气泡状突起形成，可能是内容物的渗漏点。
实施例6
实验组：用0.48mg/mL的麝香草酚和0.96mg/mL的原儿茶酸分别处理Xam两小时，然后剪叶浸染木薯叶片，25℃，16小时光照条件培养10天后观察植物病害程度。用0.48mg/mL的麝香草酚和0.96mg/mL的原儿茶酸分别处理Xcc两小时然后剪叶浸染甘蓝叶片，25℃，16小时光照条件培养10天后观察植物病害程度。
对照组：不对Xam和Xcc进行处理，直接浸染木薯叶片和甘蓝叶片。
麝香草酚和原儿茶酸抑制病原菌Xam和Xcc在寄主植物甘蓝和木薯生长的效果图如图7所示，从图中可以观察到，与没有处理的致病菌相比，使用麝香草酚和原儿茶酸处理后的致病菌的致病能力严重减弱，没有造成植物的萎蔫病害。
由上述实施例可知，本发明所述的杀菌剂通过破坏菌体结构，导致胞质内容物泄露，抑制细菌生物膜形成达到杀菌的目的，麝香草酚还影响了细菌Xam的游动性。本发明所述的杀菌剂对黄单胞菌属细菌具有广谱杀菌能力，具有较强杀灭地毯草黄单胞菌和野油菜黄单胞菌的能力。本发明所述的杀菌剂麝香草酚和原儿茶酸毒性小，对人畜安全、对环境污染小、理化性质比较稳定、可长期保存，是有效的植物源杀菌剂。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
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