一种从海带中提取岩藻黄素的方法
阅读说明：本技术 一种从海带中提取岩藻黄素的方法 (Method for extracting fucoxanthin from kelp ) 是由 李达谅 曾鹭 黄鹭强 邓威力 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从海带中提取岩藻黄素的方法,属于岩藻黄素提取工艺领域,包括如下步骤：A1预处理；A2酶解；A3、萃取；A4固液分离；A5浓缩；A6分离提纯；A7再浓缩；A8、干燥和保存。本发明从海带中提取岩藻黄素的方法,操作工艺简单,反应条件温和,提取效果好。(The invention discloses a method for extracting fucoxanthin from kelp, which belongs to the field of fucoxanthin extraction processes and comprises the following steps: a1 pretreatment; a2 enzymolysis; a3, extracting; a4 solid-liquid separation; a5 concentration; a6 separating and purifying; a7 is re-concentrated; a8, drying and storing. The method for extracting fucoxanthin from kelp has the advantages of simple operation process, mild reaction condition and good extraction effect.)
技术领域
本发明属于岩藻黄素提取工艺领域，具体涉及一种从海带中提取岩藻黄素的方法。
背景技术
岩藻黄素(Fucoxanthin)，又称为褐藻黄素，是一种脂溶性胡萝卜素，该色素呈金褐色，因其结构中含有特殊的丙二烯碳骨架，所以具有极强的抗氧化作用,研究表明，岩藻黄素具备抗痘、抗肿瘤、抗疟、抑制炎症、抑制血管新生、抑制肥胖等药理作用，对人体脑血管、眼部、皮肤、骨骼、肝脏也起到保护作用，在医药及食品、化妆品、营养保健等领域的发展前景广阔。当前市场上，含有1％岩藻黄素产品的销售价格即可达到每千克175美元。
自然界中，岩藻黄素主要存在于参与光合作用的各种藻类、海洋浮游植物等动植物中，在褐藻纲和硅藻纲中的含量尤为丰富，尚未有研究发现水生来源以外存在的岩藻黄素。现有的研究中也大都从海带、裙带菜等褐藻类植物中提取岩藻黄素。但当前岩藻黄素研究面临对岩藻黄素的研究成果少、应用技术不成熟、岩藻黄素环境敏感性大，提取工艺要求高等难题。且岩藻黄素产品纯度不高，集中在10％左右，应用范围限制大，商业化开发困难。
海带是一种常见的实用性藻类，在热带和温带的海岸附近的浅海中居多，我国的海带产量位居世界第一，每一年可生产上万吨。海带中富含岩藻黄素，而且在海带的类胡萝卜中其岩藻黄素的含量达到60％以上。但近些年来，国内对岩藻黄素的研究并不多，一部分是研究海带、羊栖菜等藻类中岩藻黄素的分离提纯，一部分是研究岩藻黄素的性质结构、生物效应、作用机理、提取工艺等，但是还没能达到将岩藻黄素工业化的生产的要求。若能对海带进行加工，提取岩藻黄素，不但可提高海带的附加经济价值，还可增加岩藻黄素供应量。
发明人研究发现，岩藻黄素具有光敏性和热敏性的特点，容易在提取过程中受到损失。采用常见的有溶剂浸提法、超临界CO2萃取法、超声波辅助提取法等提取褐藻中的岩藻黄素，提取效率低，提取效果差。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种从海带中提取岩藻黄素的方法，操作工艺简单，反应条件温和，提取效果好。
为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：
一种从海带中提取岩藻黄素的方法，包括如下步骤：
A1、预处理：将新鲜的海带用清水冲净，洗去表面盐分和粘液，用滤纸吸干表面水分，剪切成0.1～0.5cm大小的碎状海带；
A2、酶解：取碎状海带，加入去离子水和复合酶制剂混合均匀，于35～45℃酶解，抽滤后，将酶解的海带置于阴凉通风处阴干；
A3、萃取：将阴干后的海带按照1：5～30的重量g/体积mL比例添加无水乙醇，混合后加入抗氧化剂，常温下避光浸提30～60min，然后放入超声-微波协同萃取仪中进行超声-微波协同萃取；
A4、固液分离：将萃取后的溶液离心，留取上清液；
A5、浓缩：将得到的上清液放入旋转蒸发仪，在温度30～50℃的条件下，对上清液进行蒸发浓缩，即得到岩藻黄素粗提物；
A6、分离提纯：将得到的岩藻黄素粗提物通过硅胶柱层析分离纯化，层析淋洗液为石油醚，层析洗脱液为体积比例为1～10：1的石油醚和乙酸乙酯，收集橘黄色至橘红色的洗脱液；
A7、再浓缩：将上述收集得到的洗脱液放入旋转蒸发仪中，在温度30～50℃的条件下蒸发浓缩。
A8、干燥和保存：将浓缩后的洗脱液放入氮吹仪中蒸发溶剂至干，即得到岩藻黄素纯品，-20℃避光保存。
其中，所述步骤A2中，去离子水和海带按照1：20～50的重量g/体积mL比例添加；复合酶制剂按照海带的重量计，以0.15～0.3％的质量比例添加，混合均匀后于37℃下酶解处理5h；复合酶制剂为质量比为1：0.7～1.5的纤维素酶和果胶酶。
其中，所述步骤A3中，阴干后的海带按照1：6的重量g/体积mL比例添加无水乙醇，混合后再按照海带和无水乙醇混合液的体积计，加入0.05～0.5％体积比例的抗氧化剂，常温下避光浸提45min。
其中，所述抗氧化剂为2，6-二叔丁基对甲酚。
其中，所述步骤A3中，超声波功率设置为50W，微波功率200～500W，萃取温度30～50℃，萃取时间3～10min。
其中，所述步骤A3中，微波-超声协同萃取采用间歇萃取的方式，重复萃取1～3次。
其中，所述步骤A5与A7中，蒸发温度均设置为40℃。
其中，所述步骤酶解、萃取、固液分离、浓缩、分离纯化和再浓缩均在弱光或黑暗条件下进行。
本发明中，所用海带均为同一批购买自福建省连江县。
2，6-二叔丁基对甲酚，又名2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，简称BHT，其抗氧化能力强，耐热及稳定性好，是国内外广泛使用的油溶性抗氧化剂，常常在食用油脂、油炸食品、饼干、方便面等食品加工过程中用作抗氧化剂。研究表明，抗氧化剂BHT对海带提取岩藻黄素具有良好的保护作用，随BHT浓度的增大保护作用增强，岩藻黄素的稳定性增强，因此本发明在步骤A3萃取过程中添加抗氧化剂BHT，色素的提取过程均在BHT的保护下进行，有助于增强岩藻黄素的提取率，保证提取效果。
本发明的有益效果如下：
1.本发明中，通过预处理中的水洗，可以去除海带上附着的盐分和粘液，粘液中含有大量的甘露醇和多糖，水洗可以避免对后续的提取过程造成影响，有助于增强岩藻黄素的提取效果，提高岩藻黄素的纯度。
2.本发明中，海带在无水乙醇中，通过复合酶制剂酶解、超声萃取、微波萃取三者协同作用对海带中的岩藻黄素进行萃取，首先通过酶解，对海带细胞中细胞壁成分进行降解，接着利用超声和微波协同萃取对海带细胞进行作用，加速海带细胞快速破壁，使细胞中的岩藻黄素在短时间内充分溶出，其中，本发明选取无水乙醇对色素进行提取，相较于甲醇、乙醚、丙酮等试剂，其毒性小，方便回收利用，更适合大规模工业化生产。
3.本发明中，岩藻黄素在硅胶柱层析分离后，首先采用旋转蒸发仪进行初次浓缩，减少提取液的体积，再使用氮吹仪，利用其中的氮气将样品快速浓缩，加速有机溶剂挥发，减少了样品中岩藻黄素在空气下的暴露时间，避免岩藻黄素发生降解，保证样品的稳定性，进一步确保了实验数据的准确性；并且可以同时处理多组样品，操作效率高，缩短了实验人员的提取时间。
4.本发明中，在萃取过程中添加抗氧化剂BHT，能够有效的在岩藻黄素溶出后对其进行保护，有助于增强岩藻黄素的提取率，保证提取效果。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为岩藻黄素标准品的HPLC峰形图；
图3为实施例3中制得的岩藻黄素纯品的HPLC峰形图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明作一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。
实施例1
一种从海带中提取岩藻黄素的方法，包括如下步骤：
A1、预处理：将新鲜的海带用清水冲净，洗去表面盐分和粘液，用滤纸吸干表面水分，剪切成0.1cm大小的碎状海带；
A2、酶解：取碎状海带，加入去离子水和复合酶制剂混合均匀，去离子水和海带按照1：20的重量g/体积mL比例添加；复合酶制剂按照海带的重量计，以0.15％的质量比例添加，混合均匀后于35％℃下酶解处理5h；复合酶制剂为质量比为1：0.7的纤维素酶和果胶酶；
A3、萃取：将阴干后的海带按照1：5的重量g/体积mL比例添加无水乙醇，混合后再按照海带和无水乙醇混合液的体积计，加入0.05％体积比例的抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚，常温下避光浸提30min，然后放入超声-微波协同萃取仪中进行超声-微波协同萃取；超声波功率设置为50W，微波功率200W，萃取温度30℃，萃取时间3min；
A4、固液分离：将萃取后的溶液离心，留取上清液；
A5、浓缩：将得到的上清液放入旋转蒸发仪，在温度30℃的条件下，对上清液进行蒸发浓缩，即得到岩藻黄素粗提物；
A6、分离提纯：将得到的岩藻黄素粗提物通过硅胶柱层析分离纯化，层析淋洗液为石油醚，层析洗脱液为体积比例为1：1的石油醚和乙酸乙酯，收集橘黄色至橘红色的洗脱液；
A7、再浓缩：将上述收集得到的洗脱液放入旋转蒸发仪中，在温度30℃的条件下蒸发浓缩；
A8、干燥和保存：将浓缩后的洗脱液放入氮吹仪中蒸发溶剂至干，即得到岩藻黄素纯品，-20℃避光保存。
其中，微波-超声协同萃取采用间歇萃取的方式，重复萃取1次。
其中，所述步骤酶解、萃取、固液分离、浓缩、分离纯化和再浓缩均在弱光或黑暗条件下进行。
实施例2
一种从海带中提取岩藻黄素的方法，包括如下步骤：
A1、预处理：将新鲜的海带用清水冲净，洗去表面盐分和粘液，用滤纸吸干表面水分，剪切成0.5cm大小的碎状海带；
A2、酶解：取碎状海带，加入去离子水和复合酶制剂混合均匀，去离子水和海带按照1：50的重量g/体积mL比例添加；复合酶制剂按照海带的重量计，以0.3％的质量比例添加，混合均匀后于45℃下酶解处理5h；复合酶制剂为质量比为1：1.5的纤维素酶和果胶酶；
A3、萃取：将阴干后的海带按照1：30的重量g/体积mL比例添加无水乙醇，混合后再按照海带和无水乙醇混合液的体积计，加入0.5％体积比例的抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚，常温下避光浸提60min，然后放入超声-微波协同萃取仪中进行超声-微波协同萃取；超声波功率设置为50W，微波功率500W，萃取温度50℃，萃取时间10min；
A4、固液分离：将萃取后的溶液离心，留取上清液；
A5、浓缩：将得到的上清液放入旋转蒸发仪，在温度50℃的条件下，对上清液进行蒸发浓缩，即得到岩藻黄素粗提物；
A6、分离提纯：将得到的岩藻黄素粗提物通过硅胶柱层析分离纯化，层析淋洗液为石油醚，层析洗脱液为体积比例为10：1的石油醚和乙酸乙酯，收集橘黄色至橘红色的洗脱液；
A7、再浓缩：将上述收集得到的洗脱液放入旋转蒸发仪中，在温度50℃的条件下蒸发浓缩；
A8、干燥和保存：将浓缩后的洗脱液放入氮吹仪中蒸发溶剂至干，即得到岩藻黄素纯品，-20℃避光保存。
其中，微波-超声协同萃取采用间歇萃取的方式，重复萃取3次。
其中，所述步骤酶解、萃取、固液分离、浓缩、分离纯化和再浓缩均在弱光或黑暗条件下进行。
实施例3
一种从海带中提取岩藻黄素的方法，包括如下步骤：
A1、预处理：将新鲜的海带用清水冲净，洗去表面盐分和粘液，用滤纸吸干表面水分，剪切成0.2cm大小的碎状海带；
A2、酶解：取碎状海带，加入去离子水和复合酶制剂混合均匀，去离子水和海带按照1：25的重量g/体积mL比例添加；复合酶制剂按照海带的重量计，以0.2％的质量比例添加，混合均匀后于37℃下酶解处理5h；复合酶制剂为质量比为1：1的纤维素酶和果胶酶；
A3、萃取：将阴干后的海带按照1：6的重量g/体积mL比例添加无水乙醇，混合后再按照海带和无水乙醇混合液的体积计，加入0.25％体积比例的抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚，常温下避光浸提45min，然后放入超声-微波协同萃取仪中进行超声-微波协同萃取；超声波功率设置为50W，微波功率300W，萃取温度40℃，萃取时间5min；
A4、固液分离：将萃取后的溶液离心，留取上清液；
A5、浓缩：将得到的上清液放入旋转蒸发仪，在温度40℃的条件下，对上清液进行蒸发浓缩，即得到岩藻黄素粗提物；
A6、分离提纯：将得到的岩藻黄素粗提物通过硅胶柱层析分离纯化，层析淋洗液为石油醚，层析洗脱液为体积比例为510：1的石油醚和乙酸乙酯，收集橘黄色至橘红色的洗脱液；
A7、再浓缩：将上述收集得到的洗脱液放入旋转蒸发仪中，在温度40℃的条件下蒸发浓缩；
A8、干燥和保存：将浓缩后的洗脱液放入氮吹仪中蒸发溶剂至干，即得到岩藻黄素纯品，-20℃避光保存。
其中，微波-超声协同萃取采用间歇萃取的方式，重复萃取2次。
其中，所述步骤酶解、萃取、固液分离、浓缩、分离纯化和再浓缩均在弱光或黑暗条件下进行。
对比实施例1
本实施例与实施例3的不同之处在于未添加复合酶制剂，具体包括如下步骤：
一种从海带中提取岩藻黄素的方法，包括如下步骤：
A1、预处理：将新鲜的海带用清水冲净，洗去表面盐分和粘液，用滤纸吸干表面水分，剪切成0.15cm大小的碎状海带；
A2、萃取：将碎状海带按照1：6的重量g/体积mL比例添加无水乙醇，混合后再按照海带和无水乙醇混合液的体积计，加入0.25％体积比例的抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚，常温下避光浸提45min，然后放入超声-微波协同萃取仪中进行超声-微波协同萃取；超声波功率设置为50W，微波功率300W，萃取温度40℃，萃取时间5min；
A3、固液分离：将萃取后的溶液离心，留取上清液；
A4、浓缩：将得到的上清液放入旋转蒸发仪，在温度40℃的条件下，对上清液进行蒸发浓缩，即得到岩藻黄素粗提物；
A5、分离提纯：将得到的岩藻黄素粗提物通过硅胶柱层析分离纯化，层析淋洗液为石油醚，层析洗脱液为体积比例为5：1的石油醚和乙酸乙酯，收集橘黄色至橘红色的洗脱液；
A6、再浓缩：将上述收集得到的洗脱液放入旋转蒸发仪中，在温度40℃的条件下蒸发浓缩；
A7、干燥和保存：将浓缩后的洗脱液放入氮吹仪中蒸发溶剂至干，即得到岩藻黄素纯品，-20℃避光保存。
其中，微波-超声协同萃取采用间歇萃取的方式，重复萃取2次。
其中，所述步骤萃取、固液分离、浓缩、分离纯化和再浓缩均在弱光或黑暗条件下进行。
对比实施例2
本实施例与实施例3的不同之处在于未放入微波-超声萃取仪中进行萃取，具体包括如下步骤：
一种从海带中提取岩藻黄素的方法，包括如下步骤：
A1、预处理：将新鲜的海带用清水冲净，洗去表面盐分和粘液，用滤纸吸干表面水分，剪切成0.15cm大小的碎状海带；
A2、酶解：取碎状海带，加入去离子水和复合酶制剂混合均匀，去离子水和海带按照1：25的重量g/体积mL比例添加；复合酶制剂按照海带的重量计，以0.2％的质量比例添加，混合均匀后于37℃下酶解处理5h；复合酶制剂为质量比为1：1的纤维素酶和果胶酶。
A3、萃取：将阴干后的海带按照1：6的重量g/体积mL比例添加无水乙醇，混合后再按照海带和无水乙醇混合液的体积计，加入0.25％体积比例的抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚，常温下避光浸提45min；
A4、固液分离：将萃取后的溶液离心，留取上清液；
A5、浓缩：将得到的上清液放入旋转蒸发仪，在温度40℃的条件下，对上清液进行蒸发浓缩，即得到岩藻黄素粗提物；
A6、分离提纯：将得到的岩藻黄素粗提物通过硅胶柱层析分离纯化，层析淋洗液为石油醚，层析洗脱液为体积比例为5：1的石油醚和乙酸乙酯，收集橘黄色至橘红色的洗脱液；
A7、再浓缩：将上述收集得到的洗脱液放入旋转蒸发仪中，在温度40℃的条件下蒸发浓缩。
A8、干燥和保存：将浓缩后的洗脱液放入氮吹仪中蒸发溶剂至干，即得到岩藻黄素纯品，-20℃避光保存。
其中，所述步骤酶解、萃取、固液分离、浓缩、分离纯化和再浓缩均在弱光或黑暗条件下进行。
对比实施例3
本实施例与实施例3的不同之处在于未经酶解和超声-微波萃取过程，具体包括如下步骤：
一种从海带中提取岩藻黄素的方法，包括如下步骤：
A1、预处理：将新鲜的海带用清水冲净，洗去表面盐分和粘液，用滤纸吸干表面水分，剪切成0.15cm大小的碎状海带；
A2、萃取：将阴干后的海带按照1：6的重量g/体积mL比例添加无水乙醇，混合后再按照海带和无水乙醇混合液的体积计，加入0.25％体积比例的抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚，常温下避光浸提45min；
A3、固液分离：将萃取后的溶液离心，留取上清液；
A4、浓缩：将得到的上清液放入旋转蒸发仪，在温度40℃的条件下，对上清液进行蒸发浓缩，即得到岩藻黄素粗提物；
A5、分离提纯：将得到的岩藻黄素粗提物通过硅胶柱层析分离纯化，层析淋洗液为石油醚，层析洗脱液为体积比例为5：1的石油醚和乙酸乙酯，收集橘黄色至橘红色的洗脱液；
A6、再浓缩：将上述收集得到的洗脱液放入旋转蒸发仪中，在温度40℃的条件下蒸发浓缩。
A7、干燥和保存：将浓缩后的洗脱液放入氮吹仪中蒸发溶剂至干，即得到岩藻黄素纯品，-20℃避光保存。
其中，所述步骤萃取、固液分离、浓缩、分离纯化和再浓缩均在弱光或黑暗条件下进行。
对比实施例4
本实施例为常规方法中采用酶解法提取岩藻黄素的方法，具体包括如下步骤：
A1、称取10g海带碎片，添加乙醇溶液使料液比为1:10(g:mL))，用0.1mol/L的HCl和NaOH溶液调整pH值，加入0.1％的纤维素酶和0.1％果胶酶(以原料质量计)。40℃条件下避光提取1.0h，抽滤，提取2次，合并滤液，沸水浴灭酶5min，4000r/min离心10min，取上清液，
A2、将得到的上清液放入旋转蒸发仪，对上清液进行蒸发浓缩，即得到岩藻黄素粗提物；
A3、分离提纯：将得到的岩藻黄素粗提物通过硅胶柱层析分离纯化，收集橘黄色至橘红色的洗脱液；再得到的洗脱液放入旋转蒸发仪中，蒸发浓缩至干，即得到岩藻黄素纯品，-20℃避光保存。
具体测试方法
分别取经实施例1、2、3和对比实施例1、2、3、4处理后的样品，用无水乙醇溶解后对其进行高效液相色谱检测，以确定岩藻黄素含量。高效液相色谱检测条件如下：柱类型和条件:C18柱(2.1x 50mm)，粒径1.7um，带保护柱；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：447nm；流速：0.25ml·min-1；柱温：室温；流动相：A:乙腈(含0.05％甲酸)；B：超纯水(含0.05％甲酸)；洗脱程序：0～4min，65％A～100％A，4～7min 100％A维持，7～8min，100％A洗脱到65％A，8～12min，65％。
图2为岩藻黄素标准品的HPLC峰形图，图3为实施例3中从海带提取的岩藻黄素纯品的HPLC峰形图，7组实施例中岩藻黄素含量具体结果如表1所示：
表1 7组实施例的岩藻黄素含量
由图2和图3可知，经实施例3处理得到的岩藻黄素纯品和岩藻黄素标准品的HPLC峰形图相比，出峰时间一致，且仅有少数几个杂峰，说明经本发明方法从海带中提取的岩藻黄素纯度高。实施例1和实施例2的峰形图与实施例3基本一致，不再详述。
由表1可知，上述7组实施例中，实施例3中岩藻黄素含量最高，为25.33mg/100g，即从100g的海带中即可提取出25.33mg岩藻黄素。对比实施例1、2、3的岩藻黄素含量均低于实施例1、2、3，进一步说明了酶解和微波-超声协同萃取在提取色素过程中所起的作用的正向的、有助于色素提取效率，二者的结合使得本发明提取效率更高，提取效果更好；对比实施例4为常规酶解法提取岩藻黄素的方法，其色素含量与实施例1-4相比含量含量相差较大，说明本发明中的岩藻黄素提取方法与之相比，提取质量高，提取效果好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
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