具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK的人工合成

一、生物活性肽的合成

1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。

2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。

3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。

4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

5.称取氨基酸Ser适量和1-羟基-苯并三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。

7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。

8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。

11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。

12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Ser、Gly、Val、Ser、Leu、Ala、Ala、Leu、Lys、Lys、Ala、Leu、Ala、Ala、Ala、Gly、Tyr、Asp、Val、Glu和Lys。

13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将生物活性肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。

至此，人工合成了生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK。

二、生物活性肽的确认

1)UPLC分析

UPLC条件如下：

仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪

色谱柱规格：BEH C18色谱柱

流速：0.4mL/min

温度：50℃

紫外检测波长：210nm

进样量：2μL

梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈

2)质谱分析

质谱条件如下：

离子方式：ES+

质量范围(m/z)：100、1000

毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0

采样锥(V)：35.0

离子源温度(℃)：115

去溶剂温度(℃)：350

去溶剂气流(L/hr)：700.0

碰撞能量(eV)：4.0

扫描时间(sec)：0.25

内扫描时间(sec)：0.02

根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK进行色谱分析和质谱分析。生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为688.0604，保留时间是51.1min。

3)结果

由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比688.0604的片段序列为Ser、Gly、Val、Ser、Leu、Ala、Ala、Leu、Lys、Lys、Ala、Leu、Ala、Ala、Ala、Gly、Tyr、Asp、Val、Glu、Lys(SGVSLAALKKALAAAGYDVEK)，记为SEQ ID NO：1。该片段与Histone H1.3蛋白第55～75位的残基序列相对应，Histone H1.3蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAC35711.1，序列见SEQ ID NO：2。

实施例2生物活性肽的免疫活性实验

一、生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α、IL-1β和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。

仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。

2.实验方法：

加入细胞个数为2×10⁶/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。

3.实验结果及分析：

表1生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)

从表1中可知，在TNF-α、IL-1β和IL-6这三种细胞因子的实验结果中，TNF-α、IL-1β在0.2mg/ml及以上出现了极显著性差异(P＜0.01)，IL-6在0.5mg/ml出现了极显著性差异(P＜0.01)，证明了一定浓度下的SGVSLAALKKALAAAGYDVEK可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放TNF-α、IL-1β、IL-6，TNF-α、IL-1β、IL-6能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化，参与机体的免疫应答。因此，一定浓度下的SGVSLAALKKALAAAGYDVEK能够提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的作用，从而调节机体的免疫力。

二、生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)

1.实验材料与仪器：

试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。

仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。

2.实验方法：

无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行元代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×10⁶个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO₂ 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：

式中：A₁为空白对照在570nm处下的吸光值；A₂为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A₃为实验组在570nm处下的吸光值。

3.实验结果及分析：

表2生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK对体外淋巴细胞增殖的影响

注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)。

实验结果见表2。由表2可知，在生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK的刺激指数大于BSA，说明SGVSLAALKKALAAAGYDVEK一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且SGVSLAALKKALAAAGYDVEK的刺激指数达到了1.165，和阴性对照组具有极显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司

<120> 一种生物活性肽SGVSLAALKKALAAAGYDVEK及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys Lys Ala Leu Ala Ala Ala Gly

1 5 10 15

Tyr Asp Val Glu Lys

20

<210> 2

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Glu

1 5 10 15

Lys Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Lys Lys Thr Gly Ala Ala Ala Gly

20 25 30

Lys Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala

35 40 45

Val Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys

50 55 60

Lys Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg

65 70 75 80

Ile Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln

85 90 95

Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala

100 105 110

Ala Ser Gly Glu Ala Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala Lys

115 120 125

Ala Lys Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Ala Thr Gly

130 135 140

Ala Ala Thr Pro Lys Lys Thr Ala Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys

145 150 155 160

Lys Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ala Lys Lys Val Ser Lys Ser Pro Lys

165 170 175

Lys Val Lys Ala Ala Lys Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys

180 185 190

Ala Lys Ala Pro Lys Ala Lys Ala Ser Lys Pro Lys Ala Ser Lys Pro

195 200 205

Lys Ala Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Arg Lys Lys

210 215 220