具体实施方式

本说明书中提到的所有出版物和专利申请都指示了本发明所属领域的技术人员的水平。将所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度就像明确且单独指出通过引用将每个单独出版物或专利申请并入本文一样。

本文提供了具有植物恢复供体染色体组分的植物、植物部分、植物细胞或种子，其可用于使雄性不育植物恢复雄性可育性并促进鉴定具有植物恢复供体染色体组分的植物部分、植物细胞或种子。如本文所用，“植物恢复供体染色体组分”是包括与雄性可育性恢复基因座连接的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸的染色体或其片段。如本文所用，术语“植物源性”表示赋予植物表型标记物的多核苷酸来自植物。在一些实例中，相对于植物恢复供体染色体组分和雄性可育性恢复基因座，所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸是内源的。如本文所用，术语“内源”或“天然(native或natively)”是指正常地存在于指定植物中，在染色体(未修饰的)、植物细胞或植物中以其正常状态或位置存在。

在一些实例中，相对于正将其引入的植物恢复供体染色体组分、植物或植物细胞，所述植物源性多核苷酸是外源的。术语“外源的”是指非正常地存在于所述染色体组分、植物、植物细胞中；不以其在所述染色体组分、植物或植物细胞中的正常状态或位置存在，被引入到所述染色体组分、植物细胞或植物中，或源自不同的染色体、植物类型、植物物种，或如果来自相同的染色体、植物类型、植物物种则处于不同的位置，通过有意的人为干预对其组成和/或基因组基因座的天然形式进行了修饰。在一些实例中，所述植物恢复供体染色体组分包含一个或多个赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸，包括但不限于一个或多个天然的、编辑的、重新定位的、替换的或插入的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸或其组合。在存在两个或更多个植物源性多核苷酸的实施例中，例如，对于其序列，诸如它们的来源例如植物类型或物种、多核苷酸或氨基酸序列或在所述植物恢复供体染色体组分中的位置而言，所述多核苷酸可以彼此相同或不同。在一些实例中，所述一个或多个赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸对于正将其引入的植物、植物细胞或植物恢复供体染色体组分或其组合而言是外源的。

所述植物表型标记物在种子中的表达允许从不包含所述植物恢复供体染色体组分，即不具有所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸的种子中鉴定、选择和/或分选种子。在一些方面，所述植物表型标记物是非破坏性标记物。

所述植物表型标记物可与植物或种子的颜色、生理学或形态有关。作为合适的标记物的种子表型的实例包括但不限于种子颜色、种子颜色强度或样式、种子形状、种子表面质地、种子大小(包括种子大小宽度和/或长度)、种子密度或其他种子特性。种子表型颜色标记物的实例包括但不限于蓝粒、调节玉米中黄酮合成的P基因、花青素、Kala 4和其他胚乳着色性状。在一些实例中，所述植物源性多核苷酸是ThMYC4E，并赋予蓝粒表型。参见Li，Na等人“ThMYC4E，Candidate Blue Aleurone 1 Gene Controlling the AssociatedTrait in Triticum Aestivum[ThMYC4E，控制普通小麦相关性状的候选蓝粒基因1].”Harsh Raman.编辑PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]12.7(2017)：e0181116.PMC.Web.2018年9月13日，以其全文通过引用并入本文。参见公布的PCT专利申请WO 2019090496，以其全文通过引用并入本文及本序列表中。在存在两个或更多个植物源性多核苷酸的一些实施例中，这两个植物源性多核苷酸是编码赋予种子蓝粒表型的蓝粒颜色标记物的多核苷酸，并可用于种子鉴定、选择和分选。例如，对于其序列，诸如它们的来源例如植物类型或物种、多核苷酸或氨基酸序列或在所述植物恢复供体染色体组分中的位置而言，所述多核苷酸可以彼此相同或不同。

根据需要，可以修饰所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸，以增加其在植物中的表达，例如，增加所述植物表型标记物在植物、其植物部分或种子中的表达。在一些方面，可以例如通过编辑现有的调节区以替换、缺失和/或插入核苷酸以改善表达，来修饰植物源性多核苷酸的调节区以增加所述植物表型标记物的表达。参见例如于2018年10月4日公布的PCT专利公开案WO 2018183878，以其全文通过引用并入本文。可替代地或除此以外，可以修饰所述植物恢复供体染色体组分上植物表型标记物中的核苷酸以改变多核苷酸，因此它使用宿主植物优选的密码子。

在一些实施例中，所述植物恢复染色体组分中的蓝粒基因具有编码与SEQ ID NO：41或42的氨基酸序列、变体或其片段具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。可以从任何数量的来源合成、分离或获得编码赋予蓝粒表型的多肽的核酸序列，所述来源包括但不限于冰草属(Agropyron)、偃麦草属(Thinopyrum)或小麦属(Triticum)，诸如高冰草(Agropyronelongatum)、毛冰草(Agropyron trichophorum)、沙达小麦(Triticum thaoudar)、普通小麦(Triticum Aestivum)、一粒小麦(Triticum monococcum)和长穗偃麦草(Thinopyrumponticum)。蓝粒的来源和所述植物恢复供体染色体组分可以来自Sebesta Blue、BlueSando、Blue Baart、Blue Onas、Blue 1、PBB或Blue Norco或其他包含编码蓝粒的多核苷酸的附加系。所述种子中蓝粒的存在可以通过种子的糊粉层中蓝色的出现来指示，使用PCR或任何其他合适的测定法确认。本文所包括的植物表型标记物的实例并不意在限制。任何所需的植物表型标记物都可用于本文所述的方法和组合物中。

可以使用任何合适的种子表型标记物将种子分选为各种群体。例如，种子(例如缺少所述植物恢复供体染色体组分的种子)中植物表型标记物的不存在指示种子在种植时将产生雄性不育雌性植物。来自该种子的植物可以用作雄性不育雌性自交系用于杂交和种子增加生产。所述种子(例如具有所述植物恢复供体染色体组分的种子)中植物表型标记物的存在指示所述种子将产生雄性可育植物，其可用作雄性不育雌性植物的保持系。如本文其他地方所讨论的，可以使用任何合适的方法或仪器来对种子进行分选，只要其具有足够的灵敏度来检测表达表型标记物的种子和不表达表型标记物的种子之间的差异即可。

除了所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸之外，所述植物恢复供体染色体组分还包括能够与植物的雄性不育表型在功能上互补的雄性可育性恢复基因座。如本文所用，“雄性可育性恢复基因座”是指如下的一个或多个雄性可育性多核苷酸，当其在雄性不育雌性植物中表达时，通过与由雄性可育性多核苷酸中的一个或多个纯合突变引起的雌性植物的雄性不育状况互补使植物恢复雄性可育性。此类突变可以是一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入，其导致赋予植物雄性不育性。如本文所用，术语“雄性可育性多核苷酸”是指对小孢子发生中的特定步骤至关重要的多核苷酸之一，该术语适用于花粉形成的整个过程。在一些实例中，所述一个或多个雄性可育性多核苷酸包括但不限于Ms1、Ms5、Ms9、Ms22、Ms26或Ms45。在一些实施例中，分别地，所述雄性可育性恢复基因座利用但不限于Ms1、Ms5、Ms9、Ms22、Ms26或Ms45中的两个或更多个雄性可育性多核苷酸来与由Ms1、Ms5、Ms9、Ms22、Ms26或Ms45雄性可育性多核苷酸中的一个或多个纯合突变引起的雌性植物的雄性不育状况互补。

根据需要，可以修饰所述雄性可育性恢复基因座以增加植物中雄性可育性多核苷酸的表达，例如以与雄性不育植物的雄性不育性互补或使雄性可育性恢复。在一些方面，例如，可以通过编辑现有的调节区以替换、缺失和/或插入核苷酸以改善表达来修饰调节区以增加所述雄性可育性恢复基因座或雄性可育性多核苷酸的表达。参见例如于2018年10月4日公布的PCT专利公开案WO 2018183878，以其全文通过引用并入本文。可替代地或附加地，可以修饰所述植物恢复供体染色体组分上的所述雄性可育性恢复基因座中的核苷酸或雄性可育性多核苷酸，以改变所述多核苷酸，因此其使用所述宿主植物优选的密码子。

在一些实例中，所述雄性可育性恢复基因座与植物中雄性可育表型增加有关。可以通过任何合适的技术来评估植物的雄性可育性状况，例如，观察植物的雄性组织发育，诸如单个植物的花药和种子的表型分析。参见例如本文的实例1。

在一些实例中，所述雄性可育性恢复基因座包括但不限于一个或多个天然的、编辑的、替换的、重新定位的或插入的雄性可育性多核苷酸或其组合。在所述雄性可育性恢复基因座中存在两个或更多个雄性可育性多核苷酸的实施例中，例如，对于其序列，诸如它们的来源例如植物类型或物种、多核苷酸或氨基酸序列或在所述植物恢复供体染色体组分中的位置而言，所述雄性可育性恢复基因座可以彼此相同或不同。在一些方面，相对于正将其引入的植物、植物细胞或植物恢复供体染色体组分或其组合而言，所述一个或多个雄性可育性恢复基因座是内源的。在一些方面，相对于正将其引入其中的植物、植物细胞或植物恢复供体染色体组分或其组合而言，所述一个或多个雄性可育性恢复基因座是外源的。所述雄性可育性恢复可包括本领域技术人员已知的本文所述的一个或多个雄性可育性多核苷酸，包括任何前述的同系物和直系同源物。

在一实例中，所述雄性可育性恢复基因座对于来自内源性雄性可育性多核苷酸中的赋予植物雄性不育性的一个或多个纯合突变的雄性不育表型在功能上互补。这包括但不限于Ms1、Ms5、Ms9、Ms22、Ms26或Ms45的一个或多个纯合隐性等位基因。由于小麦中的Ms1表现为隐性单基因，因此在一些实施例中，可能仅需要使位于染色体4BS上的ms1雄性可育性多核苷酸或等位基因突变，以赋予小麦植物雄性不育性。

存在许多已知的来自小麦和其他物种的雄性可育性多核苷酸和雄性可育性突变体，包括但不限于Ms1、Ms5、Ms9、Ms22、Ms26或Ms45。

于2016年3月31日公布的PCT专利WO 2016048891描述了称为“MS1”的雄性可育性基因，所述基因位于小麦染色体4BS上，且编码糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的nsLTP(LTPG)多肽(也称为TaLTPGI)，其对雄性可育性很重要。小麦Ms1序列的DNA和多肽序列的实例公开于2016年3月31日公布的WO 2016048891和2019年6月20日公布的WO 2019118342，各自以其全文并入本文及本序列表中。

小麦Ms5是正常花粉外壁发育所需的糖基磷脂酰肌醇锚定的脂质转移蛋白，且所述基因位于小麦3A染色体上。小麦Ms5的DNA和多肽序列的实例公开于2019年6月20日公布的WO 2019118342，各自以其全文并入本文及本序列表中。

于2015年7月9日公布的美国专利公开案US 20150191743 A1描述了称为“MS9”的雄性可育性基因，所述基因位于玉米染色体1上，并编码对雄性可育性至关重要的myb转录因子。所述Ms9表型最早于1932年在玉米中鉴定出。Beadle，(1932)Genetics[遗传学]17：413-431。发现它与染色体1上的P1基因连接。雄性生殖组织发育的破坏发生在减数分裂的极早期；绒毛细胞也可能受到影响。Greyson等人，(1980)Can.J.Genet.Cytol.[加拿大遗传学和细胞学杂志]22：153-166。玉米Ms9的基因组DNA和多肽序列的实例公开于2015年7月9日公布的美国专利公开案20150191743，以其全文并入本文。小麦Ms9位于小麦染色体4的长臂上。小麦Ms9的基因组DNA和多肽序列的实例公开于2019年6月13日公布的美国专利公开案US 20190177722 A1，以其全文并入本文及本序列表中。

于2009年2月5日公布的美国专利公开案US 20090038026 A1描述了一种雄性可育基因，称为“Mscal”或“MS22”，位于玉米7号染色体上且编码对雄性可育性至关重要的蛋白。首先，将被称为ms22或msca1的突变表型标注为雄性不育，其花药没有从穗中挤出，并且缺少产孢子组织。West和Albertsen(1985)Maize Newsletter[玉米时事通讯]59：87；Neuffer等人(1977)Mutants of maize[玉米突变体].Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]，冷泉港，纽约州。所述突变基因座最初称为ms22，但后来更改为msca1或雄性不育转化花药。参见Chaubal等人“The transformation of anthers in the mscalmutant of maize[玉米mscal突变体花药的转化]”Planta[植物学](2003)216：778-788。小麦Ms22位于小麦2号染色体的长臂上。小麦Ms22的基因组DNA和多肽序列的实例公开于2019年6月13日公布的美国专利公开案US 20190177722 A1，以其全文并入本文及本序列表中。

2009年4月14日授权的美国专利号7517975描述了位于玉米染色体1上的雄性可育性基因，称为“MS26”(也称为SB200或SBMu200)。玉米或水稻中的Ms26序列例如如美国专利7,919,676或8,293,970中所公开。在小麦中，所述Ms26基因位于小麦染色体4AS上。小麦Ms26的基因组DNA和多肽序列的实例公开于2019年6月13日公布的美国专利公开案US20190177722 A1，以其全文并入本文及本序列表中。

1995年12月26日授权的美国专利号5,478,369描述了在玉米9号染色体上克隆的雄性可育基因，称为“MS45”。在小麦中，所述Ms45基因位于小麦染色体4的长臂上。小麦Ms45的基因组DNA和多肽序列的实例公开于2019年6月13日公布的美国专利公开案US20190177722 A1，以其全文并入本文及本序列表中。

用于本文所述的方法和组合物中的雄性不育雌性植物可以使用本领域公认的任何数量的方法产生，包括但不限于诱变、阻抑和基因组编辑。在作物(诸如玉米、小麦和水稻)中引起雄性不育性的突变已通过多种方法产生，这些方法诸如X射线或紫外线照射、化学处理、或转座元件插入((Chaubal等人2000)Am J Bot 87：1193-1201)。可以使用诸如反义、共阻抑、RNAi、发夹形成之类的阻抑技术来破坏或阻止可育性基因等位基因的表达，以产生雄性不育雌性植物，例如产生赋予植物雄性不育性的纯合隐性等位基因。在一些情况下，雄性不育性是通过使用基因组编辑技术在内源性雄性可育性基因(例如雄性可育性多核苷酸)附近或引入遗传修饰(突变)而产生的，以导致不育性。参见，2015年2月26日公布的WO 2015026883，以及Singh，M.，Kumar，M.，Albertsen，M.C.等人Plant Mol Biol(2018)97：371-383。因此，该方法可以采用使用指导RNA/Cas核酸内切酶系统的CRISPR技术，其中所述Cas核酸内切酶由指导RNA引导以识别双链断裂并任选地在特定靶位点处将双链断裂引入细胞的植物基因组中。在一些实例中，所述小麦基因组(A、B和D)包含具有相似基因结构和功能的同源基因，需要三重突变体以产生雄性不育表型，例如雄性可育性多核苷酸中的一个、两个或三个纯合突变。在一些实施例中，所述雄性不育表型是由位于植物细胞基因组中Ms1、Ms5、Ms9、Ms22、Ms26或Ms45的一个或多个内源性雄性可育性基因座中或附近的靶位点处引入的遗传修饰(突变)引起的。参见，例如，于2019年6月13日公布的US 20190177722 A1和于2019年6月20日公布的WO 2019118342，各自以其全文并入本文。

因此，已知或创建的ms1/ms1/；ms5/ms5；ms9/ms9/；ms22/ms22/；ms26/ms26/；或ms45/ms45雄性不育的编辑或突变的植物可用于本文所述的方法和组合物中，例如，用作杂交种子生产中的雄性不育雌性植物。由于小麦中的Ms1表现为隐性单基因，因此在一些实施例中，可能仅需要使位于染色体4BS上的ms1雄性可育性多核苷酸或等位基因突变，以赋予小麦植物雄性不育性。

在一些实施例中，本文提供了互补于和恢复雄性不育雌性小麦植物的雄性可育性的组合物和方法，所述雄性不育雌性小麦植物在Ms1、Ms5、Ms9、Ms22、Ms26或Ms45雄性可育性多核苷酸中包含赋予小麦植物雄性不育性的一个或多个纯合突变。在一些实例中，所述雄性不育植物在隐性孢子体雄性可育性多核苷酸中包含一个或多个纯合突变。在一些实例中，当使用来自非小麦物种的植物恢复供体染色体组分来功能上互补赋予小麦植物雄性不育性的一个或多个纯合的Ms1、Ms5、Ms9、Ms22、Ms26或Ms45突变时，这些雄性不育小麦植物可以恢复雄性可育性。

在一些实施例中，所述小麦Ms1雄性可育性多核苷酸序列包括(a)包含SEQ ID NO：1、3或5所示序列的多核苷酸；(b)与SEQ ID NO：1、3或5具有至少85％、90％或95％序列同一性的多核苷酸；(c)编码与SEQ ID NO：2、4或6具有至少85％、90％或95％序列同一性的多肽的多核苷酸；以及(d)编码SEQ ID NO：2、4或6的多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，所述小麦Ms5雄性可育性多核苷酸序列包括(a)包含SEQ ID NO：7、9、12或14所示序列的多核苷酸；(b)与SEQ ID NO：7、9、12或14具有至少85％、90％或95％序列同一性的多核苷酸；(c)编码与SEQ ID NO：8、10、11、13或15具有至少85％、90％或95％序列同一性的多肽的多核苷酸；以及(d)编码SEQ ID NO：8、10、11、13或15的多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，所述小麦Ms9雄性可育性多核苷酸序列包括(a)包含SEQ ID NO：16、18或20所示序列的多核苷酸；(b)与SEQ ID NO：16、18或20具有至少85％、90％或95％序列同一性的多核苷酸；(c)编码与SEQ ID NO：17、19或21具有至少85％、90％或95％序列同一性的多肽的多核苷酸；以及(d)编码SEQ ID NO：17、19或21的多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，所述小麦Ms22雄性可育性多核苷酸序列包括(a)包含SEQ IDNO：22、24或26所示序列的多核苷酸；(b)与SEQ ID NO：22、24或26具有至少85％、90％或95％序列同一性的多核苷酸；(c)编码与SEQ ID NO：23、25或27具有至少85％、90％或95％序列同一性的多肽的多核苷酸；以及(d)编码SEQ ID NO：23、25或27的多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，所述小麦Ms26雄性可育性多核苷酸序列包括(a)包含SEQ IDNO：28、30或32所示序列的多核苷酸；(b)与SEQ ID NO：28、30或32具有至少85％、90％或95％序列同一性的多核苷酸；(c)编码与SEQ ID NO：29、31或33具有至少85％、90％或95％序列同一性的多肽的多核苷酸；以及(d)编码SEQ ID NO：29、31或33的多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，所述小麦Ms45雄性可育性多核苷酸序列包括(a)包含SEQ IDNO：34、36或38所示序列的多核苷酸；(b)与SEQ ID NO：34、36或38具有至少85％、90％或95％序列同一性的多核苷酸；(c)编码与SEQ ID NO：35、37或39具有至少85％、90％或95％序列同一性的多肽的多核苷酸；以及(d)编码SEQ ID NO：35、37或39的多肽的多核苷酸。

表1：SEQ ID NO的概述：

在一些方面，所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸和所述雄性可育性恢复基因座在所述植物恢复供体染色体组分上彼此天然连接。在一些方面，所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸和所述雄性可育性恢复基因座彼此天然连接，且都位于所述植物恢复供体染色体组分上着丝粒的同一例，即，在同一染色体臂上。在一些实施例中，它们都被连接在一起且位于所述植物恢复供体染色体组分的长臂上，或者两者都位于所述植物恢复供体染色体组分的短臂上且不被着丝粒分开。本文所述的本公开部分基于以下发现：来自Blue Norco的4EL染色体能够与Tams45-abd突变互补，参见例如本文的实例1。在一个实施例中，所述植物表型标记物是蓝粒，且作为与具有纯合Ms45突变的雄性不育雌性小麦植物中的雄性不育表型在功能上互补的雄性可育性恢复基因座在着丝粒的同一例上。

所述植物恢复供体染色体组分可以来自任何植物，只要它能够恢复雄性不育植物的可育性，使得所述植物产生能够使植物例如自体受精的有活力的花粉。在一些方面，所述植物恢复供体染色体组分来自玉米、水稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草、黑小麦、柳枝稷、小麦草、福尼奥米(fonio)、大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、棉花、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥属(Arabidopsis)、红花、偃麦草属、山羊草属(Aegilops)、黑麦属(Secale)、簇毛麦属(Haynaldia)、披碱草属(Elyymus)、大麦属(Hordeum)或其相关物种。在一些方面，所述植物恢复供体染色体组分包含来自植物的染色体4。在一些实施例中，所述植物恢复供体染色体组分是来自小麦属、偃麦草属、山羊草属、黑麦属、簇毛麦属、披碱草属或大麦属或其相关物种的4E、4EL或4H染色体。其他物种中所述植物恢复供体染色体组分的直系同源物可以在同一染色体例如4号染色体上，或位于不同的染色体上。在一些方面，所述植物表型标记物和所述雄性可育性恢复基因座在染色体4(其可以用作植物恢复供体染色体组分)上连接在一起。

在一些情况下，所述雄性可育性恢复基因座和所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸不是紧密连接或天然连接的。可以使用包括基因组编辑技术(诸如CRISPR、Talons、大型核酸酶等)在内的分子和生物学技术来增加它们的遗传连锁和/或减少它们在所述植物恢复供体染色体组分上的物理距离。

在一些实例中，将一个或多个赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸插入、重新定位或重排在所述植物恢复供体染色体组分上以相对于所述植物恢复供体染色体组分上的一个或多个雄性可育性恢复基因座增加遗传连锁、降低重组频率、降低交换频率、和/或减少物理距离或其组合。相对于所述植物恢复供体染色体组分和/或一个或多个雄性可育性恢复基因座，一个或多个赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸可以是内源的或外源的。相对于所述植物恢复供体染色体组分，一个或多个所述雄性可育性恢复基因座可以是内源的或外源的。

在一些实例中，将一个或多个雄性可育性恢复基因座插入、重新定位或重排在所述植物恢复供体染色体组分上以相对于所述植物恢复供体染色体组分上一个或多个赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸增加遗传连锁、降低重组频率、降低交换频率、和/或减少物理距离或其组合。相对于所述植物恢复供体染色体组分或所述一个或多个赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸，一个或多个雄性可育性恢复基因座可以是内源的或外源的。一个或多个所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸相对于所述植物恢复供体染色体组分可以是内源的或外源的。

在其他实施例中，已经将所述雄性可育性恢复基因座和所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸编辑、插入、重新定位或重排或其组合，使得它们都位于所述植物恢复供体染色体组分上与其天然位置不同的位置。在一些实例中，所述植物表型标记物和雄性可育性恢复基因座位于所述植物恢复供体染色体组分的着丝粒的同一例上。在一些存在多于一个雄性可育性恢复基因座和/或赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸的实施例中，至少一个雄性可育性恢复基因座和至少一种植物源性多核苷酸位于植物恢复供体染色体组分上与其天然位置不同的位置。在一些实施例中，与位于其天然位置时所述原始植物源性多核苷酸和所述原始雄性可育性恢复基因座之间的物理距离相比，所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸与所述一个或多个雄性可育性恢复基因座之间的物理距离较小。在一些实施例中，与位于其天然位置时所述原始植物源性多核苷酸和所述原始雄性可育性恢复基因座之间的遗传连锁相比，所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸和所述一个或多个雄性可育性恢复基因座之间的遗传连锁增加。在一些方面，与位于其天然位置时所述原始植物源性多核苷酸和所述原始雄性可育性恢复基因座之间的重组频率相比，所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸和所述一个或多个雄性可育性恢复基因座的重组频率降低。在一些方面，与位于其天然位置时所述原始植物源性多核苷酸和所述原始雄性可育性恢复基因座之间的交换频率相比，所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸和所述一个或多个雄性可育性恢复基因座的交换频率较低。

在一些实施例中，当一个或多个雄性可育性恢复基因座已插入所述植物恢复供体染色体组分中时，所述天然或原始的雄性可育性恢复基因座可能会被破坏，从而使其不再表达且无法恢复雄性不育植物中的雄性可育性。在一些方面，从遗传学观点，所述方法可包括如果天然或原始的雄性可育性恢复基因座不与赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸位于所述植物恢复供体染色体组分的着丝粒的同一例上或与植物源性多核苷酸没有紧密联系，则破坏所述天然或原始的雄性可育性恢复基因座。

在一些实施例中，在将一个或多个赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸插入所述植物恢复供体染色体组分中的情况下，所述天然或原始的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸可以被破坏，从而使其不再表达并且不能向植物或其部分赋予标记物表型。在一些方面，所述方法可包括如果天然或原始的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸不与雄性可育性恢复基因座存在于植物恢复供体染色体组分的着丝粒的同一例上，或从遗传学的角度来看与雄性可育性恢复基因座没有紧密连接，则破坏所述天然或原始的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸。

在一些实施例中，所述植物恢复供体染色体组分具有与一个或多个雄性可育性恢复基因座连接的一个或多个修饰的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸。例如，与天然的、未修饰的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸的多核苷酸序列、拷贝数、表达水平或位置的相比，修饰的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸可能在其多核苷酸序列、拷贝数、表达水平或在所述植物恢复供体染色体组分内的位置方面被修饰。

在一些实施例中，所述植物恢复供体染色体组分具有与一个或多个修饰的雄性可育性恢复基因座连接的一个或多个赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸。例如，与天然的、未修饰的雄性可育性恢复基因座的多核苷酸序列、拷贝数、表达水平或位置相比，修饰的雄性可育性恢复基因座可以在其多核苷酸序列、拷贝数、表达水平或在所述植物恢复供体染色体组分内的位置方面被修饰。

在一些实施例中，所述植物恢复供体染色体组分具有与一个或多个修饰的雄性可育性恢复基因座连接的一个或多个修饰的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸。例如，与天然的、未修饰的雄性可育性恢复基因座的多核苷酸序列、拷贝数、表达水平或位置相比，修饰的雄性可育性恢复基因座可以在其多核苷酸序列、拷贝数、表达水平或在所述植物恢复供体染色体组分内的位置方面被修饰。例如，与天然的、未修饰的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸的多核苷酸序列、拷贝数、表达水平或位置的相比，修饰的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸可能在其多核苷酸序列、拷贝数、表达水平或在所述植物恢复供体染色体组分内的位置方面被修饰。

在一些方面，所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸和所述雄性可育性恢复基因座位于染色体的相对臂上。可以使用任何合适的技术和工艺来将所述赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸和所述雄性可育性恢复基因座带入染色体的同一臂，例如易位、基因组编辑、臂间倒位或其组合。

在一个实施例中，所述Ms1雄性可育性恢复基因座和编码蓝粒(Bal)基因的植物表型标记物的植物源性多核苷酸最初位于不同的染色体臂上。在一些方面，所述Ms1雄性可育性恢复基因座位于来自高冰草的染色体4ES或来自大麦(Hordeum vulgare)的4HS和位于Blue Norco的4EL上的蓝粒(Bal)基因上。在一个实施例中，诱导4HS-4EL的杂交(嵌合)植物恢复供体染色体组分中的双链断裂，例如，大麦Ms1-H基因和4HS的着丝粒之间的一条双链断裂，以及Ba1基因与4HS-4EL的着丝粒之间的一条双链断裂。将包含着丝粒和Ms1-H的染色体片段以相反的取向重新连接到端粒末端，导致臂间倒位，而Ms1-H和Ba1现在位于新染色体的同一臂上。参见例如图3。

可以使用本领域技术人员已知的任何合适的技术将所述植物恢复供体染色体组分引入植物细胞、植物部分或植物，例如雄性不育植物中。在一些方法中，使用基因组编辑、转化、胚胎培养或染色体易位技术将所述植物恢复供体染色体组分引入所述植物细胞、植物部分或植物中。在一些实施例中，所述植物细胞是小麦植物细胞，其具有在雄性可育性多核苷酸(例如，Ms45)中的一个或多个纯合突变和在功能上互补于赋予小麦植物雄性不育性的雄性不育纯合突变的植物恢复供体染色体组分。

可以使用任何合适的方法将所述植物恢复供体染色体组分易位到植物的基因组中。所述易位可以是罗伯逊易位或非罗伯逊易位。在一些方面，所述植物恢复供体染色体组分是易位的，并且取代现有的植物染色体臂，例如，小麦、大麦或黑麦植物。在一些实施例中，所述植物恢复供体染色体组分可以用于替换植物染色体(例如，小麦、大麦或黑麦)的短臂或长臂。

在一些实施例中，使用靶向方法引入所述植物恢复供体染色体组分，从而将植物恢复供体染色体组分引入受体植物基因组中的位置，从而最小化、避免对受体植物的任何潜在不良影响，或者靶向位置提供了潜在的有利优点。例如，可以将所述植物恢复供体染色体组分引入小麦植物中的染色体臂或取代小麦植物中的染色体臂，其中缺少染色体臂或一对染色体臂(单体或双体)的小麦植物具有正常的表型。在另一个实例中，可以将所述植物恢复供体染色体组分引入小麦植物中的染色体臂或取代小麦植物中的染色体臂，其中缺少染色体臂将具有降低植物恢复供体染色体组分的传播率的作用，例如降低雄性或雌性传播率。在一个实施例中，所述植物恢复供体染色体组分被小麦植物中的染色体5A(5AL)的长臂取代，因此结果是所述植物恢复供体染色体组分-5AS。

在一些实例中，具有易位的和/或取代的植物恢复供体染色体组分可以赋予优于独立的(附加)植物恢复供体染色体组分的优点。一个优点是减少了独立(附加)植物恢复供体染色体组分的配子传播，这使得在雌性种子增加期间产生的包含所述雄性可育性多核苷酸中的一个或多个纯合突变且不包含所述植物恢复供体染色体组分的种子的百分比增加。

在一些实施例中，可通过罗伯逊易位创建易位的、取代的植物恢复供体染色体组分。参见例如图4。通过将合适的小麦和供体染色体置于单体状态，可以将非整倍体原种用于定向产生小麦染色体供体罗伯逊易位。可将易位的、取代的植物恢复供体染色体组分与雄性可育性多核苷酸中的一个或多个纯合突变或单个隐性可育性基因一起渗入各种优良雌性系中，以促进杂交种子生产。由于Ms1表现为单个隐性基因，因此在一些实施例中，可能仅需要将位于染色体4BS上的Ms1多核苷酸或等位基因中的一个突变渗入雌性小麦系，以产生雄性不育性。

在一实例中，使用育种技术将所述植物恢复供体染色体组分引入所述雄性不育植物中。在一些实例中，所述雄性不育植物与包含所述植物恢复供体染色体组分的植物杂交。可以使用具有与受体(例如雄性不育)植物相同的染色体碱基数的植物，将所述植物恢复供体染色体组分引入植物，例如雄性不育植物中。在一些实例中所述，雄性不育植物是小麦植物，例如二倍体、四倍体或六倍体。在一些实例中，所述植物恢复供体染色体组分可以来自或引自小麦植物，例如二倍体、四倍体或六倍体小麦、山羊草属、黑麦属、冰草属(Agropyrin)、簇毛麦属、大麦属或披碱草属植物或与雄性不育植物杂交亲和并可以受精的任何其他植物。

在一些方面，所述植物恢复供体染色体组分相对于受体植物(例如雄性不育植物或其宿主植物，例如雄性可育植物)可以是外源的。例如，所述植物恢复供体染色体组分可以来自与所述雄性不育植物不同物种或植物的植物，例如，具有小麦植物中的小麦草或大麦的植物恢复供体染色体组分。因此，在一些实例中，所述植物恢复供体染色体组分来自非小麦植物或物种。在一些实施例中，所述植物恢复供体染色体组分不与任何雄性不育雌性植物的染色体(例如小麦染色体)配对或重组。

所述植物恢复供体染色体组分可以来自任何野生或栽培植物，包括但不限于玉米、水稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草、黑小麦、柳枝稷、小麦草、偃麦草属、山羊草属、黑麦属、簇毛麦属、披碱草属、大麦属、大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、棉花、玉米或其相关物种。所述植物恢复供体染色体组分可以来自任何数量的植物物种，包括但不限于偃麦草属、山羊草属、黑麦属、簇毛麦属、披碱草属或大麦属物种。在一些实施例中，所述植物恢复供体染色体组分可以来自具有来自玉米、水稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草、黑小麦、柳枝稷、小麦草、偃麦草属、山羊草属、黑麦属、簇毛麦属、披碱草属、或大麦属、大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、棉花、玉米或其相关物种的一个或多个染色体的小麦系。可以和/或从端体附加系，诸如单端体或双端体附加系，或二体附加系，引入所述植物恢复供体染色体组分。在一些实例中，具有所述植物恢复供体染色体组分的植物来自小麦系，包括但不限于Blue Sando、Blue Baart、Blue Onas、Blue 1、PBB或Blue Norco小麦系。非限制性实例包括但不限于小麦变种Blue Baart(其具有长穗偃麦草染色体4E的二体附加)、Blue Norco(其具有长穗偃麦草染色体4E的双端体附加)或具有大麦染色体4H的二体附加的小麦系。Blue Norco、非整倍体系、单体系、二体系和其他小麦系已是公众可得的，并且可以从许多中心获得，诸如国家小谷物收集中心(美国农业部-农业研究服务处，国家小谷物收集中心，阿伯丁，爱达荷州83210，美国)或小麦遗传资源中心(堪萨斯州立大学，堪萨斯州，美国)。

在一些实施例中，所述植物恢复供体染色体组分来自两个、三个或多个相同或不同的物种，以制备杂交(嵌合)植物恢复供体染色体组分。在一些实施例中，所述杂交(嵌合)植物恢复供体染色体组分具有来自一种植物或物种的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸和来自不同植物或物种的雄性可育性恢复基因座。在所述杂交(嵌合)植物恢复供体染色体组分中赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸可能具有来自玉米、水稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草、黑小麦、柳枝稷、小麦草、偃麦草属、山羊草属、黑麦属、簇毛麦属、披碱草属、大麦属、大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、棉花、玉米或其相关物种的一个或多个染色体或染色体片段。所述杂交(嵌合)植物恢复供体染色体组分中的雄性可育性恢复基因座可能具有来自玉米、水稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草、黑小麦、柳枝稷、小麦草、偃麦草属、山羊草属、黑麦属、簇毛麦属、披碱草属、大麦属、大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、棉花、玉米或其相关物种的一个或多个染色体或染色体片段。在一个实例中，所述植物表型标记物来自长穗偃麦草，例如4E染色体，且所述育性恢复基因座来自大麦(Hordeum vulgare/barley)，例如染色体4H，以制备4H-4E的杂交(嵌合)植物恢复供体染色体组分。在一些实施例中，所述杂交(嵌合)植物恢复供体染色体组分包括来自大麦的染色体4的短臂和来自长穗偃麦草的4E号染色体的长臂，例如来自Blue Norco，以制备4HS-4EL的杂交(嵌合)植物恢复供体染色体组分。所述植物表型标记物和育性恢复基因座可以来自任何合适的系，包括但不限于二体附加，诸如大麦4H、长穗偃麦草染色体4E、冰草属4E或其组合。

可以使用常规方法和众所周知的方法确认植物、植物部分、植物细胞或种子含有所述植物恢复供体染色体组分，包括表型标记物或雄性可育性恢复基因座或两者。植物恢复供体染色体组分应保留植物中的雄性可育性恢复活性，特别是促进雄性组织发育的能力。可以通过任何合适的技术来评估植物的雄性可育性状况，例如，观察植物的雄性组织发育，诸如单个植物的花药和种子的表型分析。参见例如本文的实例1。

与对照相比，缺乏雄性可育表型的植物或缺乏所述植物源性表型标记物赋予的表型的植物、植物部分、植物细胞或种子可以证明所述植物恢复供体染色体组分的不存在，例如因杂交或突变而丢失。可替代地或另外地，例如，可以稍后在多个植物杂交之后或自后续世代中确认所述植物恢复供体染色体组分的存在或不存在。

如果需要，可以将由所述植物或杂交产生的种子一起收获，并分选为分开的群体。例如，包含与所述可育性恢复基因座连接的植物源性植物表型种子标记物的种子是可以分选和分开以用作保持系的种子，并且可以使缺乏与所述育性恢复基因座连接的植物源性植物表型标记物(植物恢复供体染色体组分)的种子生长并在杂交中用作雄性不育母本。所述种子可以手工、机械或光学方式分选到这些群体中。为了促进高通量和分析，所述分选可以采用半自动化或自动化方法。可以使用包括多光谱或高光谱成像、uv、可见光或NIR光谱系统和/或光学扫描在内的光学传感技术对种子群体进行分选。例如，当来自所述植物恢复供体染色体组分的植物表型标记物是颜色标记物诸如蓝粒时，纯合蓝色种子将比杂合蓝色种子更强烈地着色，并且可以在此基础上进行分选，例如具有不同浓度或表达水平的蓝粒的种子。参见例如图2。另外地或可替代地，可以使用任何其他合适的技术，包括但不限于流式细胞术或qPCR，评估种子中所述植物恢复供体染色体组分(例如，所述植物表型标记物)的存在。

可替代地，可以混合种子(未分选)，以使种子的第一部分包含雄性可育性多核苷酸的一个或多个纯合突变(将产生雄性不育雌性植物的种子)，而种子的第二部分包含雄性可育性多核苷酸的一个或多个纯合突变和包含与雄性可育性恢复基因座连接的赋予植物表型标记物的植物源性多核苷酸的植物恢复供体染色体组分(将产生雄性可育植物的种子)。可以使用作为种子颜色标记物的植物表型标记物来将杂交小麦或自交小麦种子与保持系小麦种子进行分选并分开。在一些实例中，将种子的混合物种植在一起以增加产生的雄性不育雌性种子的数量。种子的混合物可以放在袋子或其他合适的容器中。所述方法可以包括将父本和母本植物的种子的混合物种植在田地的同一行中，而不是分开的行中。使父本和母本植物生长，并且所述父本植物使所述母本植物受精以产生种子。所得的种子在种植时将产生雄性不育或雄性可育植物的种子的混合物。在一些实例中，将所产生的会得到雄性可育植物的种子的百分比可以为所产生的种子的至少约20％、25％、30％、35％、40％或45％。在一些实例中，将所产生的会得到雄性不育雌性植物的种子的百分比为所产生的种子的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一些方面，与在未将雌性不育种子和雄性不育种子一起种植在同一行而是各自种植在雄性和雌性行的分开的行的田间产生的雄性不育雌性种子的数量相比，该方法增加了将得到雄性不育雌性植物的种子数量。

本文还提供了从本文描述的方法获得或产生的植物细胞、植物或种子。在一些方法中，将雄性不育雌性植物用来自包含与雌性植物的雄性不育状况互补的植物恢复供体染色体组分的植物的花粉受精。该方法产生的种子可能是在种植时将产生雄性不育或雄性可育植物的种子的混合物。所述种子中植物表型标记物的不存在指示所述种子缺乏所述植物恢复供体染色体组分且在种植时将产生雄性不育雌性植物。来自这些种子的植物可以用作雄性不育雌性自交系，用于杂交种子的生产。所述种子中植物表型标记物的存在指示所述种子包含所述植物恢复供体染色体组分且将产生雄性可育植物。如果需要，从该种子生长的植物可用作保持系。所述种子可以是未分选的、与其他种子混合的、或使用如本文其他地方所述的且为本领域技术人员已知的常规技术和仪器分选并分开到群体中。

由于雄性不育植物(例如雄性不育小麦植物)本身不能保持，因此本文提供了用于保持小麦植物的纯合隐性雄性不育状况的组合物和方法，包括使用植物恢复供体染色体组分进行小麦植物的雄性可育性的恢复。例如，当该突变体等位基因处于纯合状态时，例如分别地编码小麦Ms1、Ms5、Ms9、Ms22、Ms26和Ms45多肽的内源性小麦Ms1、Ms5、Ms9、Ms22、Ms26和Ms45多核苷酸，对雄性可育性至关重要的基因中的突变可赋予小麦植物雄性不育表型。由于小麦中的Ms1表现为隐性单基因，因此在一些实施例中，可能仅需要使位于染色体4BS上的ms1雄性可育性多核苷酸或等位基因突变，以赋予小麦植物雄性不育性。

当将与能够赋予雄性不育性的纯合隐性等位基因在功能上互补的雄性可育性恢复基因座引入所述雄性不育植物并在其中表达时，雄性可育性就恢复到所述植物中，从而可以产生有活力的花粉并能够使杂交亲和性雌性植物受精。

保持所述纯合隐性状况或雄性不育状况可包括将植物恢复供体染色体组分引入所述小麦植物中以形成保持系植物。一旦将所述植物恢复供体染色体组分引入具有雄性可育性多核苷酸的一个或多个纯合突变的植物中，其就恢复了所述植物的雄性可育性，使得所述植物产生能够自体受精的有活力的花粉或杂交亲和性植物。在一些实施例中，所述植物恢复供体染色体组分可以作为所述小麦基因组中的附加的染色体，作为所述小麦基因组中的易位染色体或作为所述小麦基因组中的小麦染色体的取代染色体存在于所述保持系小麦植物中。因此，本文提供了一种小麦植物或细胞，其小麦染色体中的一个或多个被来自非小麦植物或物种的植物恢复供体染色体组分取代。例如，在一些实施例中，所述小麦植物或细胞具有有两个染色体的同源染色体对。第一染色体对于所述小麦植物是天然的，而第二染色体包含植物恢复供体染色体组分。所述植物恢复供体染色体组分可以与任何小麦染色体一起移位或取代，只要它对所述小麦植物没有有害作用即可。在一些实施例中，所述添加、易位或取代不应干扰赋予雄性不育表型的一个或多个小麦植物纯合突变。在一些实施例中，所述植物恢复供体染色体组分可以取代5AL小麦染色体或易位到5AL小麦染色体中。

来自这些具有染色体取代的植物的小麦种子是整倍体，但是具有一个或多个被所述植物恢复供体染色体组分取代或包含所述植物恢复供体染色体组分的染色体。可以使用任何适当的技术，诸如基因组原位杂交(GISH)或荧光原位杂交(FISH)，来检测小麦植物或细胞中染色体的数量或所述植物恢复供体染色体组分的易位或取代。

所述小麦植物的雄性不育状况可以通过使包含所述植物恢复供体染色体组分的保持系植物自体受精而保持，这将导致混合的种子群体的产生。所述种子的一部分将包含所述一个或多个纯合的雄性不育突变，而所述种子的一部分将包含所述一个或多个纯合的雄性不育突变和所述植物恢复供体染色体组分。可以种植自保持系的自体受精产生的种子，并选择和分选来自这些植物的种子以用于雄性不育性保持或杂交种子生产。在一些实例中，选择过程利用任何合适的种子标记物作为植物表型标记物来鉴定此类种子。因此，本文提供了通过使所述保持系植物自体受精而从小麦植物产生种子的方法。在其他实施例中，对于雄性可育性多核苷酸的一个或多个突变纯合的雄性不育小麦植物可由来自与其杂交亲和的雄性可育植物的花粉受精。在一些方面，所述雄性可育植物包含植物恢复供体染色体组分。

本文还包括用于使植物恢复雄性可育性的方法和组合物，所述植物在雄性可育性多核苷酸中具有赋予植物雄性不育性的一个或多个纯合隐性突变。在一些方面，所述方法包括引入所述植物恢复供体染色体组分，其在功能上与来自所述雄性不育小麦植物中的一个或多个纯合突变的雄性不育表型互补，使得所述小麦植物变为雄性可育。可以使用本文描述的和本领域技术人员已知的任何数量的方法引入所述植物恢复供体染色体组分。

用于本文描述的方法和组合物中的植物或植物恢复染色体组分可以是单子叶植物或双子叶植物。单子叶植物包括但不限于玉米、水稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、粟、燕麦、黑小麦、福尼奥米、甘蔗、草坪草、柳枝稷、偃麦草属、山羊草属、黑麦属、簇毛麦属、披碱草属或大麦属或其相关物种。双子叶植物包括但不限于大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、棉花、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥属或红花或其相关物种。

附加定义：

除非上下文另外明确指示，否则本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，对“植物”的提及包括多个此类植物；对“细胞”的提及包括本领域技术人员已知的一种或多种细胞及其等同物等。

在本公开的上下文中，术语“杂交的”或“杂交”(cross或crossing)是指经由授粉将配子融合从而产生子代(即，细胞、种子、或植物)。该术语涵盖有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，即当花粉和胚珠(或小孢子和大孢子)是来自同一植物或基因相同的植物时)。

“表达”通常是指功能产品的产生。例如，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(如得到mRNA或功能性RNA的转录)和/或mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“配子”是指具有1n组(单倍数)的染色体的生殖细胞，其在正经历有性生殖的生物体中在受精期间可以与异性的另一配子融合。如本文所用，经历无性生殖的生物体中的配子是指具有2n数量(未减少数量)的染色体的细胞。

术语“基因组”是指存在于生物体的每个细胞或病毒或细胞器中的遗传物质(基因和非编码序列)的完整补体；和/或从一个亲本作为(单倍体)单元遗传的完整染色体组。

如本文所用，“雄性不育植物”是不产生有活力的雄性配子或以其他方式能够受精并且为雌性可育的植物。

术语“植物”意指整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子和植物的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于根、茎、枝、叶、花粉、种子、肿瘤组织以及各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以是在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中的。术语“植物器官”是指植物组织或构成植物的形态上和功能上不同部分的一组组织。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA的聚合物。

如本文使用的，“多核苷酸”包括提及具有天然核糖核苷酸的基本性质的脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸、或其类似物，因为在严格的杂交条件下，它们与和天然存在的核苷酸基本上相同的核苷酸序列杂交和/或允许翻译成与一个或多个天然存在的核苷酸相同的一个或多个氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构或调节基因的全长或亚序列。除非另外指明，所述术语包括提及指定序列以及其互补序列。因此，出于稳定性或其他原因而具有经修饰的主链的DNA或RNA是“多核苷酸”，如该术语在本文中所意指的。此外，仅举两个例子，包含稀有碱基(诸如肌苷)或修饰的碱基(诸如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA是多核苷酸，如该术语在本文中所使用的。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。

“子代”包括植物的任何后续世代。

“在植物中有功能性的启动子”是能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其起源是否来自植物细胞。

如本文使用的“启动子”包括提及DNA的在转录开始的上游并参与RNA聚合酶以及其他蛋白质的识别和结合以启动转录的区域。

“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子。

术语“阻抑(suppress、suppressed、suppression、suppressing)”以及“沉默”在本文中可互换使用并且包括减低、减少、下降、降低、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”并没有指定机制，并且包括但不限于反义、共阻抑、病毒阻抑、发夹阻抑、茎环阻抑、基于RNAi的方法和基于小RNA的方法等。

如本文所用，术语“小麦”是指小麦属的任何物种，包括其前体以及通过与其他物种杂交而产生的子代。小麦包括具有由42条染色体组成的AABBDD的基因组组构的“六倍体小麦”和具有由28条染色体组成的AABB的基因组组构的“四倍体小麦”。六倍体小麦包括普通小麦、斯卑尔脱小麦(T.spelta)、莫迦小麦(T.mocha)、致密小麦(T.compactum)、圆粒小麦(T.sphaerococcum)、瓦维洛夫小麦(T.vavilovii)及其种间杂交。四倍体小麦包括硬粒小麦(T.durum)(也称为硬粒小麦(durum wheat)或硬圆锥小麦(Triticum turgidumssp.durum))、拟二粒小麦(T.dicoccoides)、二粒小麦(T.dicoccum)、波兰小麦(T.polonicum)及其种间杂交。另外，术语“小麦”包括六倍体或四倍体小麦属物种的可能祖先，诸如针对A基因组的乌拉尔图小麦(T.uartu)、一粒小麦(T.monococcum)或野生一粒小麦(T.boeoticum)，针对B基因组的拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides)和针对D基因组的节节麦(T.tauschii)(也称为方穗山羊草(Aegilops squarrosa)或粗山羊草(Aegilops tauschii))。用于本公开的小麦栽培品种可以属于但不限于任何以上列出的物种。还包括通过常规技术使用小麦属物种在与非小麦属物种(诸如黑麦(rye/Secalecereale))的有性杂交中作为亲本生产的植物，包括但不限于黑小麦属(Triticale)。在一些方面，所述小麦植物适合于谷物的商业生产，诸如六倍体小麦或硬粒小麦的商业品种，其具有本领域技术人员已知的合适的农学特性。

实例

在以下实例中，除非另有说明，份数和百分比以重量计，并且度数为摄氏度。应当理解的是，尽管这些实例说明了本公开的实施例，但仅是通过说明的方式给出的。从上述讨论和这些实例，本领域技术人员可以对本公开进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。此类修改也当视为落入所附权利要求的范围内。

实例1：来自长穗偃麦草的单端体染色体可以互补于Ms45三重突变并恢复育性

如本文所证明，来自Blue Norco的4EL染色体能够与Tams45-abd突变互补。BlueNorco，蓝粒小麦，是二端体附加系，其具有额外一组4EL(2n＝42”+2t)，可以从USDA-ARS(PI542465)获得。将Tams45-abd植物作为父本与Blue Norco杂交。种植杂交种子(颜色为蓝色)，并筛选F1子代以确认TaMS45-A、-B和-D突变的存在，并使其自花授粉。

种植淡蓝色的F2种子(对于4EL是单体的，即4EL的一个拷贝)，并针对TaMs45突变体等位基因对子代进行基因分型，并使其自花授粉并结实。从这些植物收获的种子中，各自种植64个浅蓝色种子(带有4EL)和白色种子(没有4EL)以获得针对TaMs45突变体等位基因进行基因分型的F3植物。鉴定来自白色和蓝色籽粒的三重纯合(Tams45-abd)突变植物，并通过对单个植物的花药和种组的表型分析雄性可育性。总共分析了12株三重纯合Tams45-abd植物，其中六株来自白色种子，六株来自蓝色种子(表2)。来自白色种子的Tams45-abd植物的花药形状干缩并且尺寸较小，而来自蓝色籽粒的Tams45-abd植物的花药类似于野生型植物(图1)。带有4EL染色体的所有六株Tams45-abd植物均是雄性可育的，其种组与野生型植物相当，而没有4EL染色体的六株植物的种组显示可忽略不计(表2；注意：在这些植物中观察到的种子很可能由于开放受精，因为这些头部没有装袋，并且这些植物与可育开花植物非常接近)。

为了基于蓝白色选择测试雄性不育保持系系统，从可育F3植物收获种子，并种植来自三株F3植物(总共＝36个白色和蓝色种子)的12个目测分选的白色和浅蓝色种子，以获得F4代。来自白色种子的所有36株植物都是雄性不育的，而来自蓝色种子的所有36株植物都是雄性可育的(表2)。该数据表明，单体4EL染色体可以互补于和恢复雄性可育性并保持三重纯合Tams45突变体。此外，有可能基于颜色从保持系植物的种子中鉴定出将产生雄性不育或雄性可育植物的种子。

表2.TaMs45三重纯合突变体与4EL染色体的互补。

*注意：头部没有装袋，并且在同一时期的可育植物附近生长

实例2：产生4HS-4EL杂交染色体

在此实例中，使用罗伯逊易位创建了4HS-4EL杂交染色体。例如，通过使适当的植物恢复供体染色体组分处于单体状况，可以将非整倍体原种用于以定向方式创建罗伯逊易位。在该实例中，使用了中国春小麦系，所述系具有来自Betzes大麦的染色体4H的二体附加(2n＝44)。(从美国堪萨斯州立大学小麦遗传资源中心获得的小麦原种TA#3700，其具有大麦染色体4H的二体附加(2n＝44))在该实例中使用了小麦品种Blue Baart，该品种具有长穗偃麦草染色体4E的二体附加(2n＝44)，并且具有蓝粒。(V，D，J，Martinek P，Watanabe N，Vyhnánek T和J.2015.Variation in genomecomposition of blue-aleurone wheat[蓝粒小麦的基因组组成的变异].Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]128：273-282)。在这两个系之间进行杂交，使所得的F₁种子生长，并使植物自花授粉。可以使用任何合适的方法来筛选F₂或F₃代中新的4HS-4EL染色体的存在，例如，蓝色的存在指示4EL的存在，4ES标记物的不存在，4HS标记物(诸如Mmag 053)的存在，和4HL标记物(诸如HVM40)的不存在(Molnár I，Linc G，Dulai S，NagyED和Molnár-Láng MM.2007.Ability of chromosome 4H to compensate for 4D inresponse to drought stress in a newly developed and identified wheat-barley4H(4D)disomic substitution line[在新开发和鉴定的小麦-大麦4H(4D)二体取代系中，染色体4H补偿4D响应干旱胁迫的能力].Plant Breeding[植物育种]126：369-374)。例如，可以通过使用标准的细胞遗传学技术(诸如GISH(基因组原位杂交))进一步筛选候选系，以确认是否存在杂交4HS-4EL染色体。

实例3：使用CRISPR-cas9诱导的臂间倒位将Ms1和Ba1放置在同一染色体臂上

在此实例中，在Ms1补体(同系物)和Ba1基因位于不同染色体臂上(例如分别位于4ES或4HS和4EL上)的情况下，在小麦中使用臂间倒位将Ms1和Ba1基因置于同一染色体臂上。这种方法的一个优点是，它将Ms1和Ba1性状基因放置在同一染色体臂上，并避免由于着丝粒处的染色体断裂而分离它们以及种子可能被误分类为雄性不育(实际上它们是雄性可育的)。

在该实例中，起始材料可以使用本文实例2中所述的4HS-4EL染色体。将诱导两个DSB：一个在Ms1-H基因和4HS的端粒之间，另一个在Ba1基因和4HS-4EL的着丝粒之间。大麦Ms1-H基因的取向是最接近端粒的5’端和最接近着丝粒的3’端。将分析Ms1-H基因5’的DNA序列(http：//plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/Tools/Blast)中cas9的原型间隔子相邻基序(PAM)的NGG序列。对于发现的每个位点，将评估17bp的上游序列，以找到小麦基因组中不存在的独特切割位点。

克隆并测序位于染色体4J长臂(4E^b)上和着丝粒与BaThb基因之间的标记物片段；将分析所得序列中cas9的原型间隔子相邻基序(PAM)的NGG序列。对于每个位点，将评估17bp的上游序列，以找到小麦基因组中不存在的独特切割位点。

当鉴定了两个位置的一个或多个合适位点和指导RNA时，通过CRISPR-cas9使用标准方法诱导两个DSB。在特定频率下，将包含着丝粒和Ms1-H的染色体片段以相反的取向重新连接到端粒末端，从而导致臂间倒位，而Ms1-H和Ba1现在位于新染色体的同一臂上。将设计仅在发生臂间倒位时才产生PCR产物的PCR引物。

实例4：4E-ms45系统的替代构建

该实例描述了使用4E-ms45构建杂交系统的一个实施例。4EL染色体臂将被易位到小麦基因组中，取代现有的小麦染色体臂，而不是通过附加近端着丝粒染色体(诸如4EL)提供种子颜色标记物(蓝粒＝BA)和功能性优势Ms45等位基因。

被4EL靶向取代的小麦染色体臂的适当选择可以在独立的(附加)4EL赋予一些优点。一个可能的优点是减少了附加端体染色体的配子传播，例如，降低了雄性和/或雌性传播率。这将使待在雌性种子增加(自花授粉)期间产生的非蓝色种子的百分比增加。在此实例中，4EL将被小麦染色体臂5AL取代。包含5AS-4EL染色体的配子将缺少5AL的拷贝。参见例如图4。

即使在雄性和/或雌性传播率减少的情况下，也可能会产生一些纯合的4EL(蓝色)种子。可以使用种子分选来鉴定和检测这些纯合蓝色种子的存在。例如，纯合的蓝色种子将比杂合的蓝色种子具有更深的颜色，并可以在此基础上进行分选。认为5AS-4EL纯合植物可能是雄性不育的，因此几乎不需要或不需要种子分选就可以从蓝色种子群体中除去此类种子。

可以使用罗伯逊易位创建5AS-4EL染色体。在该实例中，通过使适当的小麦和植物恢复供体染色体组分处于单体状态，非整倍体原种可用于以定向方式创建小麦-植物恢复供体染色体组分罗伯逊易位。在该实例中，使用中国春非整倍体小麦系，其针对小麦5A染色体的单体性而分离。(从美国堪萨斯州立大学小麦遗传资源中心获得了针对小麦5A号染色体的单体性而分离的原种TA#3045)在该实例中使用了小麦品种Blue Baart，该品种具有长穗偃麦草染色体4E的二体附加(2n＝44)，并且具有蓝粒(V，D，J，Martinek P，Watanabe N，Vyhnánek T和J.2015.Variation in genomecomposition of blue-aleurone wheat[蓝粒小麦的基因组组成的变异].Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]128：273-282)。使中国春非整倍体小麦系的10个种子生长，这些种子针对小麦5A染色体的单体性而分离，取样了根尖，并通过标准方法进行了染色体计数，以鉴定单体(2n-1＝41)植物。单体植物产生约75％的缺体(n-1＝20)雌性配子。鉴定出的单体植物作为雌性与Blue Baart杂交。由缺体配子产生的F₁种子将具有42条染色体的组成，包括15A+14E，均源自雄性父本Blue Baart，并具有蓝粒颜色。使F₁种子生长，并使所述植物自花授粉。

可以通过任何合适的方法来筛选新的5AS-4EL染色体的存在，例如，通过蓝粒种子颜色的存在(指示4EL的存在和4ES标记物的不存在)进行筛选。这将指示所述4E染色体的断裂。例如，可以通过使用标准的细胞遗传学技术(如FISH(荧光原位杂交))进一步筛选候选系，以确认是否存在杂交5AS/4EL染色体。

一旦建立，将使此类系自花传粉以确认5AS/4EL纯合子的雄性不育，以及作为雄性和雌性相互杂交以确定花粉和卵子的传播频率。可以将所述5AS/4E染色体与4A、4B和4D上的隐性ms45等位基因一起渗入各种优良雌性系中，以促进杂交种子生产。

实例5：使用4E或4H附加染色体来互补于小麦Ms9三重突变并恢复可育性

在该实例中，已经使用指导TA-Ms9-CR2 ggaggtacaccaactacctg(SEQ ID NO：40)制备了靶向TA-Ms9基因的小麦CAS9-CRISPR构建体。

将用该构建体转化小麦植物，且将评估内源性小麦Ms9基因在所有三个小麦基因组中的突变。将进行杂交和随后的自花授粉，以将纯合的Ms9突变合并进单一植物。将通过检查单个植物上的花药和种组来评估在所有三个基因组中对于Ms9突变纯合的小麦植物的雄性不育性。

如果实现了雄性不育性，则可以通过将它们与包含4EL附加染色体的小麦保持系(诸如实例1中所述的Blue Norco)杂交来保持这些小麦植物。所述TA-Ms9基因映射于小麦染色体4的长臂，其与4EL附加染色体的长臂具有同线性，这应该为所述TA-ms9突变提供了互补功能，恢复雄性可育性。还可以评估包含大麦染色体4作为附加染色体的小麦系(大麦4H)的可能Ta-ms9恢复。如通过在个体植物上的花药检查和种组所确定的，通过在这些植物中互补于所述ms9突变的能力来评估在所述小麦保持系中通过所述4E、4EL或4H附加染色体对这些雄性不育小麦植物的雄性可育性的恢复。

如实例1中所述，所述4EL附加染色体在长臂上还包含蓝粒基因(BA)，其给出显性的蓝色种子表型。因此，将来自自花授粉的纯合TA-ms9突变体并在存在所述4EL附加染色体的情况下恢复的种子分离为蓝色和非蓝色种子。可以使这些所得种子生长并评估雄性可育性和不育性。如实例1中所证明的，期望非蓝色种子来源的植物将是雄性不育的，而蓝色种子来源的植物将是雄性可育的，并且后者可以充当杂交系统中TA-ms9突变的保持系。