具体实施方式

定义

以下定义皆为协助读者提供。除非另有定义，本文中所使用的技术词汇、符号、其他科学或医学术语皆具有化学及医学领域中具通常知识者所理解的涵义。在某些情形下，本文所定义的通常涵义皆为达成便于理解及/或参照的目的，而本文所包含的定义不应被理解为和领域中具通常知识者所理解的定义有实质差异。

所有数值(如pH值、温度、时间、浓度及重量等)以及各数值的范围，皆为一般可能视需要增(+)减(-)0.1、1.0或10.0的近似值。所有数值皆可被理解为包含前饰词“约”。本文所述的试剂皆为示例性，而其等效物皆为本发明所属技术领域的习知技术。

除非另外指明，本文中的“一”和“该”等词包括多个所指对象。因此，例如一化合物即指涉一或多个化合物，或至少一化合物。因此，本文中的“一”、“一或多个”及“至少一个”等词可彼此替代使用。

本文所使用的“包含”意指组合物及方法包括所列出的元素，但不排除其他元素。“基本上由...组合而成”用以定义组合物及方法时，应指排除对组合物或方法具任何重要性的其他元素。“由...组合而成”应指在所主张的组合物及实质方法步骤中，排除高于微量的元素的其他成分。由前述各过渡词所定义的实施例，皆落于本发明范围中。由此，方法及组合物可包括其他步骤及成分(“包含”)或另外包括不重要的步骤和组合物(“基本上由...组合而成”)或者仅指涉所述的方法步骤或组合物(“由...组合而成”)。

“光学活性(optically active)”及“对映体活性(enantiomerically active)”等词指涉一系列具有不少于约10％、不少于约20％、不少于约30％、不少于约40％、不少于约50％、不少于约60％、不少于约70％、不少于约80％、不少于约90％、不少于约91％、不少于约92％、不少于约93％、不少于约94％、不少于约95％、不少于约96％、不少于约97％、不少于约98％、不少于约99％、不少于约99.5％、不少于约99.8％或不少于约99.9％的对映体过量值(enantiomeric excess,ee)的分子。在某些实施例中，光学活性或对映体活性化合物具有不少于约90％、不少于约95％、不少于约98％或不少于约99％的对映体过量值。

描述具光学活性的化合物所使用的前缀R及S，皆用以指涉关于分子手性中心的绝对组态。前缀(+)或(-)皆用于指涉化合物的旋光度(optical rotation)，即偏振光平面被具光学活性的化合物旋转的旋转方向。前缀(-)是指化合物为左旋性，即化合物将偏振光平面向左旋或逆时针旋转。前缀(+)是指化合物为右旋性，即化合物将偏振光平面向右旋或顺时针旋转。然而，旋光度的符号(+)和(-)与分子的绝对组态R和S无关。

“光学纯(optically pure)”及“对映体纯(enantiomerically pure)”等词指涉一系列具有不少于约80％、不少于约90％、不少于约91％、不少于约92％、不少于约93％、不少于约94％、不少于约95％、不少于约96％、不少于约97％、不少于约98％、不少于约99％、不少于约99.5％、不少于约99.8％或不少于约99.9％的对映体过量值的分子。在某些实施例中，光学纯或对映体纯的化合物具有不少于约90％、不少于约95％、不少于约98％或不少于约99％的对映体过量值。化合物的对映体过量值可由技术领域中具通常知识者通过标准方法测定，包括但不限于使用具旋光性固定相(optically active stationary phase)、同位素稀释液(isotopic dilution)、电泳、量热法(calorimetry)、偏振测量法(polarimetry)、利用手性衍生化法(chiral derivatization)的核磁共振解析度法(NMR resolutionmethods)、以及利用手性溶剂化试剂(chiral solvating agent)或手性位移试剂(chiralshift agent)的核磁共振法，来进行手性层析法(气相层析法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC))。

“实质上纯”、“实质上同质”等词是指足够同质，因此如技术领域中具通常知识者使用标准分析方法测定，无呈现立即可测得的不纯物，包括但不限于薄层层析法(TLC)、凝胶电泳(GE)、高效液相色谱法(HPLC)、气相层析法(GC)、核磁共振(NMR)及质谱仪(MS)；或足够纯，使得进一步纯化无法对物质的物理、化学、生物及/或药理性质(如酶活性及生物活性)造成可测得的变化。在某些实施例中，“实质上纯”或“实质上同质”指一系列分子，其中按重量百分比至少约50％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％为一化合物的单独立体异构物，其由标准分析方法测定。

“同位素变体”一词，是指包含具非自然比例同位素的一化合物，该同位素位于组成化合物的一或多个原子处。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”包含具非自然比例的一或多个同位素，包括但不限于氢(¹H)、氘(²H)、氚(³H)、碳-11(¹¹C)、碳-12(¹²C)、碳-13(¹³C)、碳-14(¹⁴C)、氮-13(¹³N)、氮-14(¹⁴N)、氮-15(¹⁵N)、氧-14(¹⁴O)、氧-15(¹⁵O)、氧-16(¹⁶O)、氧-17(¹⁷O)、氧-18(¹⁸O)、氟-17(¹⁷F)、氟-18(¹⁸F)、磷-31(³¹P)、磷-32(³²P)、磷-33(³³P)、硫-32(³²S)、硫-33(³³S)、硫-34(³⁴S)、硫-35(³⁵S)、硫-36(³⁶S)、氯-35(³⁵Cl)、氯-36(³⁶Cl)、氯-37(³⁷Cl)、溴-79(⁷⁹Br)、溴-81(⁸¹Br)、碘-123(¹²³I)、碘-125(¹²⁵I)、碘-127(¹²⁷I)、碘-129(¹²⁹I)及碘-131(¹³¹I)。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”具稳定形式，即不具放射性。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”包含具非自然比例的一或多个同位素，包括但不限于氢(¹H)、氘(²H)、碳-12(¹²C)、碳-13(¹³C)、氮-14(¹⁴N)、氮-15(¹⁵N)、氧-16(¹⁶O)、氧-17(¹⁷O)、氧-18(¹⁸O)、氟-17(¹⁷F)、磷-31(³¹P)、硫-32(³²S)、硫-33(³³S)、硫-34(³⁴S)、硫-36(³⁶S)、氯-35(³⁵Cl)、氯-37(³⁷Cl)、溴-79(⁷⁹Br)、溴-81(⁸¹Br)及碘-127(¹²⁷I)。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”具不稳定形式，即具放射性。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”包含具非自然比例的一或多个同位素，包括但不限于氚(³H)、碳-11(¹¹C)、碳-14(¹⁴C)、氮-13(¹³N)、氧-14(¹⁴O)、氧-15(¹⁵O)、氟-18(¹⁸F)、磷-32(³²P)、磷-33(³³P)、硫-35(³⁵S)、氯-36(³⁶Cl)、碘-123(¹²³I)、碘-125(¹²⁵I)、碘-129(¹²⁹I)及碘-131(¹³¹I)。应了解，在本文所提供的任一化合物中，根据技术领域中具通常知识者判断为可行时，例如任何氢可为²H、例如任何碳可为¹³C，或例如任何氮可为¹⁵N，且任何氧可为¹⁸O。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”包含具非自然比例的氘。

“其“同位素变体”；或其医药上可接受的盐类、溶剂化物、水合物或前药”的表述，概念与“其中所述的化合物的一“同位素变体”；或其中所述的化合物的一医药上可接受的盐类、溶剂化物、水合物或前药”相同。

“给药”或“投予”药物予一病患(或其他对等表述方式)是指直接给药，可由医事人员对病患给药或由病患自己给药，以及/或间接给药，其可为开立药物的行为。举例而言，若医生嘱咐病患自行给药及/或替病患开立处方笺，即视同对病患投予药物。

“病患”、“受试者”及“有需要的受试者”等词可替代使用，意指需要癌症治疗的哺乳动物，癌症类型具体为白血病，更具体为T细胞急性淋巴性白血病。一般而言，该病患为人类。一般而言，该病患为确诊罹患癌症的人类。在某些实施例中，“病患”、“受试者”及“有需要的受试者”等词可指非人类哺乳类动物，如非人类灵长类、狗、猫、兔、猪、小鼠或大鼠，其用于筛选、定性及评估药物及疗法。

本文所使用的“有效量”一词，是指各活性试剂能对受试者产生预期疗效的所需剂量，试剂可单独或与一或多个其他活性试剂共同给药。技术领域中具通常知识者了解，有效量会依接受治疗病患的条件而变化，如病情严重性或病患个别参数，包括年龄、身体条件、身材、性别及体重、接受治疗时间、同时接受的疗程类型(若有)、给药特定途径或医事人员已知及专业内的因素。这些因素为技术领域中具通常知识者所习知，且仅需通过例行实验测定。给药时，一般倾向使用个别成分或组合的最大剂量，即根据严谨医疗判断的最高安全剂量。然而，技术领域中具通常知识者将了解，病患可能会基于医学、心理或任何其他因素，坚持使用较低剂量或可耐受剂量。

针对病情或病患的“治疗”或“疗法”，是指按步骤获得有助益或预期的结果，包括临床结果。根据本发明的目的，有助益或预期的结果包括但不限于减轻或改善癌症的一或多个症状；减缓病症严重程度；延后或减缓病情发展；改善、舒缓或稳定病况；或其他有助益的结果。某些情形下，癌症治疗可能会导致部分反应或病情无变化。

“医药上可接受”成分(如载体或赋形剂)，是指适合投予受试者以达本文所述治疗的化合物或组合物，且不会对疾病严重程度及治疗需要造成过多且有害的副作用。“载体”是指不会对生物体引发显著刺激，且不会破坏某化合物的生物活性及特性的材料。“赋形剂”是指添加入医药组合物以利投予该化合物的惰性物质。

可使用的医药上可接受载体或赋形剂已揭露于诸多文献中，包括由RaymondCRowe、Paul J Sheskey及Marian E Quinn编纂的Handbook of PharmaceuticalsExcipients一书。在一无限制实施例中，前述医药上可接受载体或赋形剂可选自由惰性稀释剂、分散剂及/或颗粒剂、表面活性剂及/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂及/或油所组成的群组。前述组合物选择性进一步包含至少一种额外的生物活性化合物或试剂。

医药组合物可包含但不限于一单位剂量的活性成分(例如本发明的化合物)。为达治疗目的，单位剂量可具备散装形式，例如但不限于片剂或胶囊，或可为体积可量测的溶液、悬浮液等包含单位剂量活性成分的液体。本文使用的“单位剂量”一词是指活性成分一单位的量，不限于通过经口、静脉内、肌肉内、经皮、皮下、脊髓腔内、穿皮、移植式、舌下、口腔内、直肠内、阴道内、眼部、耳部、鼻部、吸入式或喷雾式给药治疗患有包括但不限于酒瘾、鸦片类药物成瘾、疼痛缓解或其他疾病的患者。治疗可能需要定期投予单位剂量的本发明化合物，例如一日投予两次或两次以上的一单位剂量、每餐投予一单位剂量、每四小时投予一单位剂量或以其他间隔投予一单位剂量，或者每日仅投予一单位剂量。

实施例

在一实施例中，一种制备式1化合物的方法包含以下步骤：

步骤(1)：在含甲硼烷(BH₃)、B-二异松蒎基氯硼烷(B-Chlorodiisopinocampheylborane)(DIP-氯化物)、(S)-(-)-1,1’-联-2-萘酚((S)-(-)-1,1‘-Bi-2-naphthol)或硼氢化钠(NaBH₄)的环境下，使一式2化合物与一式3a化合物反应；及

步骤(2)：使步骤(1)的产物与以下化合物反应：

(A)脂肪酶丙烯酸树脂(lipase acrylic resin)、碳酸钠(Na₂CO₃)，以及乙酸异丙酯(isopropenyl acetate)和丁酸2,2,2-三氟乙基酯(2,2,2-trifluoroethyl butyrate)其中一者；或

(B)蛋白酶、碳酸钠，以及乙酸异丙酯和丁酸2,2,2-三氟乙基酯其中一者；且在含甲醇的环境下使步骤(B)的产物与甲醇钠(sodium methoxide)反应，

其中R为一脂肪链或Rx；

其中Rx为氢、一未经取代或经取代环状基、一拉电子基或一推电子基。

在一实施例中，该反应可如下述途径所示：

在一实施例中，一种制备式1化合物的方法包含以下步骤：

步骤(1a)：在含甲硼烷、DIP-氯化物、(S)-(-)-1,1’-联-2-萘酚或硼氢化钠的环境下，使一式2化合物与一式3a化合物反应；

步骤(1b)：使步骤(1a)的产物与乙酸酐(Ac₂O)反应：及

步骤(2)：使步骤(1b)的产物与以下化合物反应：

(A)脂肪酶丙烯酸树脂及碳酸钠；且在含甲醇的环境下使步骤(A)的产物与甲醇钠反应；或

(B)蛋白酶及碳酸钠，

其中R为一脂肪链或Rx；

其中Rx为氢、一未经取代或经取代环状基、一拉电子基或一推电子基。

在一实施例中，该反应可如下述途径所示：

在一实施例中，一种制备式4化合物的方法包含以下步骤：

步骤(1)：在含甲硼烷、DIP-氯化物、(S)-(-)-1,1’-联-2-萘酚或硼氢化钠的环境下，使一式2化合物与一式3b化合物反应；及

步骤(2)：使步骤(1)的产物与以下化合物反应：

(A)脂肪酶丙烯酸树脂、碳酸钠，以及乙酸异丙酯和丁酸2,2,2-三氟乙基酯其中一者；且在含甲醇的环境下使步骤(A)的产物与甲醇钠反应；或

(B)蛋白酶、碳酸钠，以及乙酸异丙酯和丁酸2,2,2-三氟乙基酯其中一者，

其中R为一脂肪链或Rx；

其中Rx为氢、一未经取代或经取代环状基、一拉电子基或一推电子基。

在一实施例中，该反应可如下述途径所示：

在一实施例中，一种制备式4化合物的方法包含以下步骤：

步骤(1a)：在含甲硼烷、DIP-氯化物、(S)-(-)-1,1’-联-2-萘酚或硼氢化钠的环境下，使一式2化合物与一式3b化合物反应；

步骤(1b)：使步骤(1a)的产物与乙酸酐(Ac₂O)反应：及

步骤(2)：使步骤(1b)的产物与以下化合物反应：

(A)脂肪酶丙烯酸树脂及碳酸钠；或

(B)蛋白酶及碳酸钠；且在含甲醇的环境下使步骤(B)的产物与甲醇钠反应，

其中R为一脂肪链或Rx；

其中Rx为氢、一未经取代或经取代环状基、一拉电子基或一推电子基。

在一实施例中，该反应可如下述途径所示：

在一实施例中，该脂肪链的碳数为C₆至C₂₀。

在一实施例中，该环状基为一芳香基、一环状饱和或部分未饱和基、或一杂环基。较佳地，该杂环基包括N、O或S等杂原子。

在一实施例中，该拉电子基为一卤基(F、Cl、Br、I)、亚硝基(-N＝O)、氨羰基(aminocarbonyl)(-CONH₂；-CONHR；-CONR₂，其中R＝烷基)、羧基(-CO₂H)、烷氧羰基(-CO₂R，其中R＝烷基)、甲酰基(-CHO)、酰基(-COR，其中R＝烷基)、卤代甲酰基(-COX，其中X＝Cl、Br、I)、三卤甲基(-CX₃，其中X＝F、Cl、Br、I)、氰基(-C≡N)、硝基(-NO₂)、铵基(ammoniumgroup)(-NR₃ ⁺，其中R＝烷基或H)、叠氮基(-N^- ₃)或磺酰基(-SO₂R，其中R＝H、CF₃、烷基)。较佳地，该烷基为C₁-C₅烷基。

在一实施例中，该推电子基为一低碳数烷基(如-CH₃、-C₂H₅)、乙烯基(-CH＝CH₂)、苯基(-C₆H₅)、酰氧基(-OCOR，其中R＝烷基)、酰胺基(acylamido)(-NHCOR，其中R＝烷基)、烷硫基(-SR，其中R＝烷基)、氢硫基(sulfhyfryl)(-SH)、羟基(-OH)、烷氧基(-OR，其中R＝烷基)、氨基(amino group)(-NH₂；-NHR；-NR₂，其中R＝烷基)。较佳地，该烷基为C₁-C₅烷基。

在一实施例中，化合物OBI-3424(S-form)经Corey-Bakshi-Shibata(CBS)不对称还原法及脂肪酶酯化的两个结合步骤被成功合成，产率54％(源自化合物OBI-3424-5)及99％光学纯度。通过CBS还原法及应用脂肪酶的两个化学酶结合步骤建立立体化学结构(stereo chemistry)，以使光学纯度达至少99％(图1)。

实例

本发明的诸多特征及实施例将通过以下代表性实例详细说明。以下实例仅具示例性，不作为限制本发明内容之用。本发明技术领域中具通常知识者将立即理解，特定实例仅用于说明本发明内容，更完整的描述如所附权利要求所述。本申请所述的各实施例及特征，应被理解为可和本申请其他实施例互换和结合。

临床测试化合物OBI-3424由“Asymchem”经三步骤率先合成，产率为19％(见底下的途径1)。为提升产率并减少可能的不纯物，发明人尝试设计其他合成途径(见途径2)，最后选定两种方法以达成目的。首先，在较后续的阶段再引进不稳定的磷酸盐结构(labilephosphate motif)，而在最后阶段形成氮丙啶，以避免对间苯衍生物产生亲核性破坏。合成途径经消旋(racemic)化合物OBI-3424-6完成，其使用还原剂硼氢化钠制备而成，在后续步骤中则进行磷酸化并形成氮丙啶。其次，为改善立体选择性，立体中心设计为可通过CBS不对称还原法及脂肪酶选择性保护富集(enrichment)的结合建立(见途径3)。结合这些方法预期可产出产率优、具高光学纯度的产物。因此，本发明开发出替代合成途径以获得化合物OBI-3424。CBS试剂被其对映体取代，以制备以S-form为主的化合物OBI-3424-6混合物。少量R-form化合物OBI-3424-6可在经脂肪酶处理后被选择性乙酰化。接着，纯S-form化合物OBI-3424-6可经由管柱纯化获得。

途径1：化合物OBI-3424的GMP合成方法(临床)

途径2：化合物OBI-3424合成的新路径设计

途径3：建构化合物OBI-3424-6的立体化学结构

材料及方法

器材如表2所列。

表2：器材列表

反应途径2及反应途径3使用的化学合成试剂如表3所列。

表3：试剂列表

注*：两种CBS试剂皆用于制备化合物OBI-3424-6R/S混合物：(S)-5,5-联苯-2-甲基-3,4-丙醇-1,3,2-恶唑硼烷((S)-5,5-diphenyl-2-methyl-3,4-propano-1,3,2-oxazaborolidine)(CAS编号：112022-81-8)可生成以R-form为主的产物，而(R)-5,5-联苯-2-甲基-3,4-丙醇-1,3,2-恶唑硼烷((R)-5,5-diphenyl-2-methyl-3,4-propano-1,3,2-oxazaborolidine)(CAS编号：112022-83-0)则能生成以S-form为主的产物。

实验用基质(Substrates)

基质1：1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝基苯基)乙醇

(1-(3-(3-N,N-dimethylaminocarbonyl)phenoxyl-4-nitrophenyl)ethanol)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.97(d,J＝0.4Hz,1H),7.41(t,J＝8.0Hz,1H),7.26-7.19(m,2H),7.11-7.09(m,2H),7.03(d,J＝1.2Hz,1H),4.88(q,J＝6.4Hz,1H),3.08(s,3H),2.97(s,3H),1.44(d,J＝6.4Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ170.5(C),156.2(C),154.0(C),150.0(C),140.2(C),138.0(C),130.2(CH),126.0(CH),122.6(CH),120.8(CH),119.9(CH),118.2(CH),117.1(CH),68.9(CH),39.5(CH₃),35.3(CH₃),25.2(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd for C₁₇H1₈N₂O₅Na 353.1108,found353.1108.

基质2：1-(3-氟-4-硝基苯基)乙-1-醇

(1-(3-fluoro-4-nitrophenyl)ethan-1-ol)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.00(t,J＝8.0Hz,1H),7.34(dd,J＝12.0,1.6Hz,1H),7.29-7.27(m,1H),4.99(q,J＝6.8Hz,1H),2.49(s,1H),1.51(d,J＝6.8Hz,3H)ppm；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ157.0(C),155.3(C),155.2(C),154.4(C),126.2(CH),121.2(CH),115.2(CH),114.9(CH),68.9(CH),25.3(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd for C₈H₈FNO₃Na208.0380,found 208.0354.

基质3：1-(3-(4-(三氟甲基)苯氧基)-4-硝基苯基)乙-1-醇

(1-(3-(4-(trifluoromethyl)phenoxyl)-4-nitrophenyl)ethan-1-ol)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.01(d,J＝8.4Hz,1H),7.62(d,J＝8.8Hz,2H),7.31(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.18(d,J＝2.0Hz,1H),7.07(d,J＝8.4Hz,2H),4.95(q,J＝6.4Hz,1H),2.02(s,1H),1.48(d,J＝6.4Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.2(C),153.7(C),149.0(C),140.7(C),127.43(CH),127.40(CH),126.3(CH),121.6(CH),119.1(CH),117.8(CH),69.1(CH),25.5(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd for C₁₅H₁₂F₃NO₄Na 350.0611,found350.0607.

基质4：1-(3-(4-(2-甲基苯基)苯氧基)-4-硝基苯基)乙-1-醇

(1-(3-(4-(2-methylphenyl)phenoxyl)-4-nitrophenyl)ethan-1-ol)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.32(dd,J＝6.4,2.0Hz,2H),7.27-7.20(m,5H),7.16(d,J＝1.6Hz,1H),7.07(dd,J＝6.8,2.0Hz,2H),4.91(q,J＝6.8Hz,1H),2.29(s,3H),1.47(d,J＝6.4Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ154.8(C),153.2(C),150.8(C),140.8(C),140.2(C),138.1(C),135.4(C),130.8(CH),130.4(CH),129.8(CH),127.4(CH),126.1(CH),125.8(CH),120.1(CH),118.4(CH),117.6(CH),69.3(CH),25.4(CH₃),20.5(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd for C₂₁H₁₉NO₄Na 372.1206,found 372.1204.

基质5：1-(2-氯-4-硝基苯基)乙-1-醇

(1-(2-chloro-4-nitrophenyl)ethan-1-ol)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.21(d,J＝2.4Hz,1H),8.16(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),7.85(d,J＝8.4Hz,1H),5.34(q,J＝6.4Hz,1H),2.24(s,1H),1.51(d,J＝6.8Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ150.5(C),147.2(C),132.1(C),127.3(CH),124.6(CH),122.2(CH),66.8(CH),23.6(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd for C₈H₈ClNO₃Na 224.0085,found 224.0085.

基质6：1-(3-氯-4-硝基苯基)乙-1-醇

(1-(3-chloro-4-nitrophenyl)ethan-1-ol)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.87(d,J＝8.4Hz,1H),7.58(d,J＝2.0Hz,1H),7.40(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),4.97(q,J＝6.4Hz,1H),2.40(s,1H),1.51(d,J＝6.4Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ152.1(C),146.5(C),128.7(CH),127.3(C),125.9(CH),124.4(CH),68.9(CH),25.4(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd for C₈H₈ClNO₃Na 224.0085,found 224.0065.

基质7：1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)乙-1-醇

(1-(3-methoxy-4-nitrophenyl)ethan-1-ol)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.83(d,J＝8.4Hz,1H),7.16(d,J＝1.6Hz,1H),6.97(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),4.96(q,J＝6.4Hz,1H),3.97(s,3H),2.42(s,1H),1.50(d,J＝6.4Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ153.3(C),138.1(C),126.0(CH),117.0(CH),110.1(CH),69.5(CH),56.4(CH₃),25.4(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd for C₉H₁₁NO₄Na 220.0580,found220.0555.

基质8：1-(2-甲氧基-4-硝基苯基)乙-1-醇

(1-(2-methoxy-4-nitrophenyl)ethan-1-ol)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.86(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.71(d,J＝2.0Hz,1H),7.59(d,J＝8.4Hz,1H),5.18(q,J＝6.4Hz,1H),3.96(s,3H),2.43(s,1H),1.49(d,J＝6.4Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ156.4(C),147.9(C),141.3(C),126.3(CH),116.2(CH),105.3(CH),65.5(CH),55.9(CH₃),23.1(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd for C₉H₁₁NO₄Na220.0580,found 220.0557.

基质9：1-苯基乙醇

(1-phenylethanol)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.35-7.30(m,4H),7.27-7.24(m,1H),4.84(q,J＝6.4Hz,1H),2.31(s,1H),1.46(d,J＝6.4Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ145.7(C),128.4(CH),127.4(CH),125.3(CH),70.3(CH),25.0(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd forC₈H₁₀ONa 145.0624,found 145.0621.

基质10：2-辛醇

(2-Octanol)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ3.83-3.75(m,1H),1.76(s,1H),1.46-1.26(m,10H),1.18(d,J＝6.0Hz,3H),0.89(t,J＝6.8Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ68.1(CH),39.3(CH₂),31.8(CH₂),29.3(CH₂),25.7(CH₂),23.4(CH₃),22.6(CH--₂),14.0(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd for C₈H₁₈ONa 153.1250,found 153.1237.

基质11：N-[4-(1-羟乙基)苯基]乙酰胺

(N-[4-(1-Hydroxyethyl)phenyl]acetamide)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.50(d,J＝8.4Hz,2H),7.31(d,J＝8.4Hz,2H),4.79(q,J＝6.4Hz,1H),2.11(s,3H),1.42(d,J＝6.4Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ171.8(C),143.5(C),138.9(C),127.1(CH),121.2(CH),70.6(CH),25.6(CH₃),23.9(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd for C₁₀H₁₃NO₂Na 202.0838,found 202.0809.

基质12：1-O-乙酰基-1-(3-(3-N,N-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝基苯基)乙烷

(1-O-acetyl-1-(3-(3-N,N-dimethylaminocarbonyl)phenoxyl-4-nitrophenyl)ethane)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.96(d,J＝8.4Hz,1H),7.42(td,J＝7.6,2.4Hz,1H),7.24-7.20(m,2H),7.09-7.04(m,3H),5.78(q,J＝6.8Hz,1H),3.10(s,3H),2.98(s,3H),2.06(s,3H),1.48(d,J＝6.8Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ170.3(C),169.9(C),155.9(C),150.0(C),149.4(C),140.6(C),138.4(C),130.2(CH),126.2(CH),122.8(CH),121.2(CH),119.6(CH),118.7(CH),117.1(CH),70.9(CH),39.5(CH₃),35.3(CH₃),22.1(CH₃),21.2(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd for C₁₉H₂₀N₂O₆Na395.1214,found 395.1146.

基质13：1-O-乙酰基-1-(3-氟-4-硝基苯基)乙烷

(1-O-acetyl-1-(3-fluoro-4-nitrophenyl)ethane)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.06(dd,J＝8.4,7.2Hz,1H),7.30-7.25(m,2H),5.87(q,J＝6.8Hz,1H),2.13(s,3H),1.55(d,J＝6.8Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ169.9(C),157.0(C),154.3(C),150.9(C),150.8(C),126.5(CH),121.82(CH),121.79(CH),115.8(CH),115.6(CH),70.6(CH),22.1(CH₃),21.0(CH₃)ppm；HRMS(ESI,M+Na⁺)calcd forC₁₀H₁₀FNO₄Na 250.0486,found 250.0445.

实例1：化合物OBI-3424中间产物的合成(由化合物OBI-3424-3制备化合物OBI-3424-5)

合成化合物OBI-3424-3

在圆底烧瓶中，将化合物OBI-3424-1(9g，48.6mmol)、二甲基甲酰胺(0.1g，mmol)和亚硫酰氯(SOCl₂，30mL，mmol)的混合物在75℃下回流3小时。在回流过程中，在室温(约25℃)下，将无水MgCl₂(2.79g，mmol)、丙二酸二甲酯(dimethyl malonate)(5.7mL，mmol)和三乙胺(triethylamine)(14.1mL，mmol)于另一圆型烧瓶中混合。将混合后得到的白色悬浮液搅拌1.5小时，使之变为白色泥状物(white mud)。回流3小时后，将化合物OBI-3424-1和SOCl₂的反应混合物冷却至约40℃。接着使用旋转蒸发仪浓缩反应混合物，以除去过量溶剂。接着，将所得浆液(syrup)用15mL甲苯稀释。将所得的甲苯溶液滴加到预先制备的白色泥状物混合物中。混合1.5小时后，使用TLC(EtOAc/正己烷体积比＝1：4)检查反应。以30mL、6N的HCl处理所得混合物，并以60mL EtOAc萃取。再次使用60mL EtOAc萃取水层。合并的有机层经MgSO₄干燥、过滤，并使用旋转蒸发仪浓缩(水浴温度约35℃，压力约130mbar)，得到带红色的浆液。将所得浆液与30mL、6N HCl混合，再于100℃下回流约17小时。接着将所得反应粗产物冷却至室温，以60mL EtOAc稀释并萃取。再次用60mL EtOAc萃取水层。收集有机层，用MgSO₄干燥、过滤，并使用旋转蒸发仪浓缩(水浴温度约35℃，压力约130mbar)，得到带红色的浆液。使用管柱层析法通过硅胶垫(10g化合物OBI-3424-1使用200g凝胶粉末)纯化所得浆液。用硅胶混合己烷/EtOAc/CH₂Cl₂体积比＝12/1/0.5的管柱。建议使用以下冲提液(eluent)系统：己烷/EtOAc/CH₂Cl₂＝12/1/0.5(1管柱体积)、10/1/1(2-3管柱体积)。使用旋转蒸发仪(水浴温度约35℃，压力约130mbar)和高真空(约25℃，约17小时)浓缩所收集的产物，以取得预期产物化合物OBI-3424-3黄色固体(5.4g，分离产率55％)。

合成化合物OBI-3424-4

将间羟基苯甲酸(m-hydroxybenzoic acid)(15g)溶于THF(无水，300mL)中，然后在氮气保护下将反应冷却至-30℃。搅拌20分钟后，在15分钟内将三乙胺(67mL)加入到冷却的反应中。搅拌15分钟后，反应物变为白色悬浮液。在15分钟内将氯甲酸异丁酯(isobutylchloroformate)(31mL)添加到所得悬浮液中。搅拌2小时后，以TLC检查反应(CH₂Cl₂/EtOAc体积比＝2/1)。在间羟基苯甲酸停止反应后，在30分钟内将二甲胺(溶于THF中浓度2M，270mL)加入反应中。加入后，再搅拌反应30分钟，接着加热至室温(约25℃)，并持续搅拌18小时。反应完成后，将水(90mL)加入反应中，然后使用旋转蒸发仪除去THF(水浴温度35℃，约100mbar)。然后，使用冷却的1N HCl(30mL)和EtOAc(200mL)萃取反应粗产物。将水层用EtOAc(200mL)萃取两次。合并有机萃取物并以MgSO₄干燥、过滤，然后利用旋转蒸发仪浓缩至约30％体积，其中有些晶体析出(水浴温度35℃，约120mbar)。将所得的粗样品边搅拌(360rpm)边以己烷(200mL)处理，以形成白色悬浮液。过滤所得固体，并用冷却的己烷/EtOAc混合物(体积比＝20/1)洗涤，再使用高真空系统干燥约16小时(25℃)，以取得预期的化合物OBI-3424-4白色固体(12.7g，71％分离产率)。

合成化合物OBI-3424-5

在室温(约23℃)及氮气保护下，将化合物OBI-3424-3(0.35g)加入置于适当二口圆底瓶中的化合物OBI-3424-4(0.25g)的无水THF溶液(4mL)中。将反应混合物冷却15分钟至0℃。将Cs₂CO₃(0.84g)加入冷却的反应中。加入1小时后，使用TLC检查反应(CH₂Cl₂/EtOAc体积比＝2/1，化合物OBI-3424-5的Rf值＝0.3)。化合物OBI-3424-4反应停止后，将反应以8mL EtOAc稀释，并用4mL饱和NH₄Cl萃取。将水层以8mL EtOAc萃取两次。合并有机层并以4mL饱和食盐水(brine)洗涤、以MgSO₄干燥，接着使用旋转蒸发仪浓缩(水浴约35℃，约130mbar)，取得黄色浆液。使用管柱层析法通过硅胶垫纯化所得浆液。建议使用以下冲提液系统：(己烷/EtOAc体积比＝5/1)己烷/EtOAc＝4/1(1管柱体积)、己烷/EtOAc＝1/1(1管柱体积)、己烷/EtOAc＝1/2(3管柱体积)，直到收集到预期产物为止。使用旋转蒸发仪(水浴温度约35℃，约140mbar)和高真空(约25℃，16小时)浓缩分离液，以取得化合物OBI-3424-5淡黄色固体(0.46g，分离产率93％)。

发明人根据文献记载的方法(PCT专利公开号WO 2016/145092A1)，首先成功合成出产率可接受的化合物OBI-3424-3和化合物OBI-3424-4。接着，将化合物OBI-3424-3和化合物OBI-3424-4耦合，以制备化合物OBI-3424-5，在基本处理条件下产率约80％。基于操作便利并为了提高产率，发明人测试了数种条件。几次测试后发现，无水THF和Cs₂CO₃能带来最高的产率(表4)。使用THF作为反应溶剂和Cs₂CO₃作为碱时分离产率最好。此外，一般认为Cs₂CO₃是操作方便的温和碱，操作上可有利于大量生产。

表4：改善OBI-3424-5制备条件

注：所有溶剂均为无水(商业)溶剂，无需进一步处理即可直接使用。

实例2：由化合物OBI-3424-5合成化合物OBI-3424-6(消旋)

途径4：由化合物OBI-3424-5合成化合物OBI-3424-6(消旋)

为证明所设计的路径是否可行(见途径2)，将化合物OBI-3424-5迅速被硼氢化钠还原，以得到化合物OBI-3424-6(消旋)，分离产率为85％(见途径4)，反应在冰浴中稳定进行。请注意，添加硼氢化钠后会释放出氢气。将所得化合物OBI-3424-6(消旋)进一步用于化合物OBI-3424的合成，观察其反应。

将化合物OBI-3424-5(500mg)溶于甲醇，并冷却至0℃。将硼氢化钠(58mg)添加到此溶液中(注意：反应期间会释放出气体)。搅拌30分钟后，以TLC检查反应(CH₂Cl₂/EtOAc体积比＝2/1，化合物OBI-3424-5的Rf值＝0.3，化合物OBI-3424-6的Rf值＝0.2)。反应完成后，将反应以EtOAc(50mL)和1N HCl(5mL)稀释。分离所得的粗产物。再次用EtOAc萃取水层。收集有机层并以MgSO₄干燥、过滤，接着使用旋转蒸发仪浓缩取得浆液(水浴温度35℃，约70mbar)。使用管柱层析法通过硅胶垫(硅胶＝20g)纯化所得浆液。建议使用以下冲提液系统：(密封的己烷/EtOAc体积比＝3/1)、冲提液：己烷/EtOAc＝1/1(1管柱体积)、CH₂Cl₂/EtOAc＝2/1(1管柱体积)、CH₂Cl₂/EtOAc＝1/1(3管柱体积)，直到获得预期产物。使用旋转蒸发仪(水浴温度约35℃，约120mbar)和高真空(约25℃，16小时)浓缩所得产物，以取得化合物OBI-3424-6(消旋)黄色浆液(428mg，85％分离产率)。

实例3：合成化合物OBI-3424-6-LR

1981年，S.Itsuno率先提出此方法。几年后，E.J.Corey表示，在含有甲硼烷/THF的环境下，经调整后的催化剂可快速、大量地以高镜像选择性方式还原非手性酮。具催化性的恶唑硼烷被称为Corey-Bakshi-Shibata(CBS)还原。该催化剂被应用在许多基质上，并且具有良好的高镜像选择性(J.Mol.Catal.B Enz.1997,3:65-72)。根据公开的实验结果，类似的基质更倾向通过S-CBS催化剂形成R-form产物。因此，发明人在基质(化合物OBI-3424-5)中尝试使用S-CBS，发现选择性大约为R/S体积比3:1至6:1。为了提升R-form产物的对映体过量值ee％，发明人接着组合脂肪酶选择性乙酰化法(lipase selective acetylation)以提高R/S比(见途径2)。非手性醇的脂肪酶选择性乙酰化法为一项成熟技术。根据公开的实验结果，脂肪酶倾向与R-form基质反应。测试两种不同的脂肪酶CAL-B和PAL后发现，使用CAL-B能得到较佳的结果。结合S-CBS还原法和脂肪酶乙酰化法后，HPLC中化合物OBI-3424-6终产物的ee％可提高至不低于97％。

步骤1：S-CBS不对称还原(以R form为主)

接着，我们聚焦于不对称还原及和光学纯度提升。已知Prof.E.J.Corey(J.Am.Chem.Soc.1987,109:7925-7926)开发出商业CBS试剂((S)-5,5-联苯-2-甲基-3,4-丙醇-1,3,2-恶唑硼烷，CAS编号：112022-81-8)。该试剂可用酮进行手性还原，以提供良好的R-form醇产率，并使甲硼烷在THF中有高立体选择性。化合物OBI-3435-5以0.2mol当量的CBS试剂和1.05mol当量的硼烷(在THF中的浓度为1M)处理，在数小时内于氮气保护下得到还原产物(化合物OBI-3424-6对映体混合物)，产率为80％。经手性HPLC分析测得光学解析度为48％(图2)。将CBS的量增加到0.5mol当量并将反应温度降至-20℃，便可将光学纯度提高至70％ee，不过，产率会降至65％，反应时间会拉长至22小时(表5)。

表5：CBS还原试验(以R form为主)

步骤2：脂肪酶选择性酰基保护

具有高R-form选择性的脂肪酶是用于分离化合物OBI-3424-6R/S混合物的极佳酶，它可以向R-form化合物OBI-3424-6主动添加乙酰基，并被动留下未乙酰化的S-form化合物OBI-3424-6(见途径5)。接着用脂肪酶处理该对映体混合物，以选择性酯化R-form对映体的羟基。所得乙酰化产物“化合物OBI-3424-6-Ac”的光学纯度可提升至99％ee值。接着在温和的碱性条件下，除去化合物OBI-3424-6-Ac的乙酰基，以得到自制化合物OBI-3424-6-LR，并成功转化为“化合物OBI-3424-LR”，分离产率为77％。

途径5：以CBS还原法和脂肪酶富集的组合法制备化合物OBI-3424-6-LR

实例4：合成化合物OBI-3424-6-LS

步骤1：R-CBS不对称还原(以S form为主)

结构确认后，发明人接着修饰合成途径以产生化合物OBI-3424-6(见途径6)。CBS试剂被替换为(R)-5,5-联苯-2-甲基-3,4-丙醇-1,3,2-恶唑硼烷(CAS编号：112022-83-0)。不对称还原化合物OBI-3424-5后得到R/S比为1/4的化合物OBI-3424-6对映体混合物，分离产率为90％(图3)。接着使用酶(脂肪酶)处理该混合物以提升光学纯度。

途径6：由不对称还原化合物OBI-3424-5到合成以S-form为主的化合物OBI-3424-6

步骤2：脂肪酶选择性酰基保护

令人欣喜的是，脂肪酶可选择性地使R/S混合物中的R-form化合物OBI-3424-6乙酰化。纯化后可直接获得被动选择和未乙酰化的S-form化合物OBI-3424-6(OBI-3424-6-LS)。相较于合成化合物OBI-3424-6-LR的步骤(除去化合物OBI-3424-6-Ac的乙酰基)，此处省略了一个步骤。使用硅胶垫进行简单管柱纯化后，可以收集到具77％产率和99％ee值的化合物OBI-3424-6-LS(途径7，图4)。

途径7：经酶催化反应形成S-form化合物OBI-3424-6

实例5：化合物OBI-3424-6R/S混合物的一般合成

在氮气保护下，于0℃混合甲硼烷(溶于THF中浓度为1M，1.05mol当量)和CBS试剂(0.2mol当量)(注：分别使用两种不同的CBS试剂，自(S)-5,5-联苯-2-甲基-3,4-丙醇-1,3,2-恶唑硼烷获得以R-form为主的产物，同时使用(R)-5,5-联苯-2-甲基-3,4-丙醇-1,3,2-恶唑硼咯烷得到以S-form为主的产物)。搅拌5分钟后，将化合物OBI-3424-5(1.0mol当量，即取0.45g化合物溶于2mL无水THF中)加入反应中。进行搅拌反应并在氮气保护下加温至25℃。搅拌添加物约1.5小时后，以TLC检查反应(CH₂Cl₂/EtOAc体积比＝2/1，化合物OBI-3424-6的Rf值＝0.3)。在化合物OBI-3424-5停止反应后，将反应粗产物与EtOAc混合(^v/_v为反应粗产物的4倍)并冷却1N HCl(25％体积的EtOAc)。萃取并分离反应粗产物，接着以EtOAc萃取水层两次。使用饱和NaHCO₃、饱和食盐水洗涤合并后的有机层，并以MgSO₄干燥、过滤，然后利用旋转蒸发仪浓缩(水浴温度35℃，约100mbar)取得黄色浆液。使用管柱层析法通过硅胶垫纯化所得浆液。建议使用以下冲提液系统：(密封的己烷/EtOAc体积比＝3/1)、冲提液：己烷/EtOAc＝1/1(1管柱体积)、CH₂Cl₂/EtOAc＝2/1(1管柱体积)、CH₂Cl₂/EtOAc＝1/1(3管柱体积)，直到获得预期产物。使用旋转蒸发仪(水浴温度约35℃，约120mbar)和高真空(约25℃，16小时)浓缩收集到的产物，以取得化合物OBI-3424-6R/S混合物黄色浆液(分离产率约90％，使用含手性柱的HPLC测定R/S比率)。

此外，发明人亦测试数种手性还原剂(如DIP-氯化物、硼氢化钠或(S)-(-)-1,1'-联-2-萘酚)以取代CBS催化剂。

使用(R)/(S)-Me-CBS试剂的方法

在氮气保护下，将含不同酮基质与(R)/(S)ME-CBS催化剂(Tokyo ChemicalIndustry Co.,Ltd.)的溶液冷却10分钟至0℃。将甲硼烷(于THF中的浓度为1M)(AcrosOrganics；批号：A0400505)缓慢加入反应中，并搅拌10分钟。接着将反应混合物在室温下搅拌1小时。反应完成后，将反应混合物用1N HCl和水终止反应(quenched)。使用两份EtOAc萃取水层。使用NaHCO₃和饱和食盐水洗涤所收集的有机层，以无水MgSO₄干燥、过滤，并利用旋转蒸发仪浓缩取得黄色粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI SilysiaChemical Ltd.；批号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。

使用(+)/(-)-DIP-氯化物试剂的方法

在氮气保护下，将含不同酮基质的THF溶液(Acros Organics；批号：1850266)冷却10分钟至0℃。将(+)/(-)-DIP-氯化物(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)缓慢加入反应中，并搅拌10分钟。接着将反应混合物在室温下搅拌3小时。反应完成后，将反应混合物用1N HCl和MeOH终止反应。使用两份EtOAc萃取水层。使用NaHCO₃和饱和食盐水洗涤所收集的有机层，以无水MgSO₄干燥、过滤，并利用旋转蒸发仪浓缩取得黄色粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI Silysia Chemical Ltd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。

使用硼氢化钠(NaBH₄)的方法

将含不同酮基质的MeOH溶液降至室温。将硼氢化钠缓慢加入反应中。接着将反应混合物在室温下搅拌1小时。反应完成后，将反应混合物用水终止反应。使用两份EtOAc萃取水层。使用NaHCO₃和饱和食盐水洗涤所收集的有机层，以无水MgSO₄干燥、过滤，并利用旋转蒸发仪浓缩取得粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI Silysia ChemicalLtd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。

使用(S)-(-)-BINOL试剂的方法

在氮气保护下，于室温下搅拌(S)-(-)-1,1'-联-2-萘酚(东京化学工业株式会社；批号：4HN7B-OD)和三甲基铝(trimethylaluminum)溶液(Sigma-Aldrich,Inc.；批号STBG1135V)10分钟后，形成白色沉淀。将酮基质2和2-丙醇(Tedia Company Inc.；批号：15040128)加入反应，并于室温下搅拌16小时。反应完成后，利用旋转蒸发仪浓缩反应混合物取得粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI Silysia Chemical Ltd.；批号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。

表6显示使用不同的化合物OBI-3424-6手性还原试剂所得的产率。如表所示，CBS催化剂是合成化合物OBI-3424-6的最有效试剂，反而无法使用硼氢化钠产生S-form或R-form的专一产物。

表6：使用不同的化合物OBI-3424-6手性还原试剂所得的产率

此外，发明人亦使用R-CBS/S-CBS、(-)-DIP-氯化物/(+)-氯化物、硼氢化钠或(S)-(-)-1,1'-联-2-萘酚测试数种酮基质(见表7)。表7显示使用不同酮基质所得的产率。

表7：不同酮的镜像选择性还原-以S-form为主

注：

1、使用基质及(S)-(-)-1,1’-联-2-萘酚(Tokyo ChemicalIndustry Co.,Ltd.,CAS编号：18531-99-2)试剂的产率为11％、9％ee、S form。

2、使用基质及(S)-Me-CBS催化剂试剂的产率为>99％、34％ee、Rform。

3、使用基质及(+)-DIP-氯化物试剂的产率为96％、91％ee、Rform。

实例6：利用脂肪酶酶催化选择法(lipase enzymatic selection)自化合物OBI-3426-6R/S混合物中分离对映体

使用乙酸异丙酯将化合物OBI-3424-6溶解，以作为预混合物溶液。将脂肪酶(CALB)和碳酸钠添加到预混合物溶液中，并置于室温(25℃)下。请注意，反应时间与R-form和S-form选择的时间不同(第2.1节，R-选择为4小时，而S-选择为20小时)。反应完成后，将上层溶液过滤(或移液(pipetted)))以去除脂肪酶树脂，并移至干净的试管中进一步纯化(TLC检查系统中，CH₂Cl₂/EtOAc/己烷体积比＝1/2/1)。利用旋转蒸发仪浓缩酶催化反应溶液(水浴温度约35℃，压力约50mbar)以得到浆液。接着将该浆液置于硅胶垫上(密封的正己烷/EtOAc体积比＝5/1)，建议使用以下冲提液系统：正己烷/EtOAc体积比＝3/1(1管柱体积)，接着为1/1(1.5管柱体积)，接着为1/4(3管柱体积)，直到收集到预期产物为止；以TLC检查冲提液系统中，CH₂Cl₂/EtOAc/己烷＝1/2/1，化合物OBI-3424-6-LS的Rf＝0.3，化合物OBI-3424-6-Ac的Rf＝0.5)。在此步骤中将获得化合物OBI-3424-6-LS。此外，发明人亦测试不同种类的脂肪酶(例如取自米曲菌(Aspergillus oryzae)的脂肪酶B或取自南极假丝酵母(Candida Antarctica)固定化的脂肪酶)的反应活性。取得在室温下溶解于乙酸异丙酯(Sigma-Aldrich Inc.；批号：STBH5768)中的羟基质溶液。将碳酸钠(Showa.；批号：KDL-100W)和脂肪酶丙烯酸树脂(Sigma-Aldrich,Inc.；批号：SLBW1544)或固定在Immobead 150上的南极假丝酵母脂肪酶B，或取自米曲菌(Sigma-Aldrich,Inc.；批号：BCBZ7604)的重组物或取自南极假丝酵母固定化的脂肪酶(Sigma-Aldrich,Inc.；批号BCBD5551)加入溶液中。将反应混合物在室温下放置16小时。过滤反应混合物，并以旋转蒸发仪浓缩之以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI Silysia Chemical Ltd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。

另外，发明人亦测试另一种试剂，即丁酸2,2,2-三氟乙基酯(2,2,2-trifluoroethyl butyrate)代替乙酸异丙酯。取得在室温下溶解于丁酸2,2,2-三氟乙基酯(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.；批号：CORPC-HQ)中的羟基质溶液。将碳酸钠(Showa.；批号KDL-100W)和脂肪酶丙烯酸树脂(Sigma-Aldrich，Inc.；批号SLBW1544)加入溶液中。将反应混合物在室温下放置16小时。过滤反应混合物，并以旋转蒸发仪浓缩以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI Silysia Chemical Ltd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。表8显示使用不同脂肪酶所得的产率。如表所示，使用不同种类的脂肪酶所得的产率无显著差异。

表8：使用不同脂肪酶所得的化合物OBI-3424-6-LS产率

注：使用丁酸2,2,2-三氟乙基酯的产率为74％、96％ee、S form。

此外，发明人亦使用不同种类脂肪酶测试数种基质(见表9)。表9显示使用数种不同基质和脂肪酶所得的产率。

表9：经不同脂肪酶催化的选择性转酯化

实例7：以S-form为主的脂肪酶选择性水解

步骤A：在室温下，将乙酰基质溶于THF(Acros Organics；批号：1850266)和0.1MpH 7.0的磷酸钾缓冲液(Sigma-Aldrich,Inc.；批号：MKBX6388V)中。将脂肪酶丙烯酸树脂(Sigma-Aldrich,Inc.；批号：SLBW1544)加入溶液中。将反应混合物在室温下放置16小时。过滤反应混合物，并利用旋转蒸发仪浓缩以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI Silysia Chemical Ltd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。

步骤B：在室温下，将乙酰基质溶于MeOH(BioSuperStar Co.,Ltd.；批号：14022569)中。将NaOMe加入溶液中。接着于室温下搅拌反应混合物1小时。反应完成后，将反应混合物用HCl(溶于MeOH，浓度1N)终止反应，并利用旋转蒸发仪浓缩以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI Silysia Chemical Ltd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。表10显示使用乙酰基质的脂肪酶试剂的产率。

表10：使用乙酰基质的脂肪酶试剂所得的产率

实例8：自化合物OBI-3426-6R/S混合物进行蛋白酶酶催化选择性转酯化

步骤A：在室温下，将羟基基质溶于丁酸2,2,2-三氟乙基酯(Tokyo ChemicalIndustry Co.,Ltd.；批号：CORPC-HQ)中。将来自不同种类的蛋白酶(Sigma-Aldrich,Inc.，取自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，批号：SLBX1986；或取自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)，批号：SLCB9815)加入溶液中。将反应混合物在室温下放置16小时。过滤反应混合物，并利用旋转蒸发仪浓缩以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI Silysia Chemical Ltd.；目录号：SY350)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。

步骤B：在室温下，将乙酰基质溶于MeOH中。将NaOMe加入溶液中。接着于室温下搅拌反应混合物1小时。反应完成后，将反应混合物用HCl(溶于MeOH，浓度1N)终止反应，并利用旋转蒸发仪浓缩以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI SilysiaChemical Ltd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。表11显示使用不同蛋白酶所得的产率。如表所示，使用两种蛋白酶皆得到低产率。

表11：使用不同蛋白酶所得的产率

实例9：以S-form为主的蛋白酶选择性水解

在室温下，将乙酰基质溶于乙醚(Avantor Performance Materials,Inc.；批号：0000128533)和0.1M、pH 7.0的磷酸钾缓冲液(Sigma-Aldrich,Inc.；批号：MKBX6388V)中。将蛋白酶(Sigma-Aldrich,Inc.，取自地衣芽孢杆菌；批号：SLBX1986)加入溶液中。将反应混合物在室温下放置16小时。过滤反应混合物，并利用旋转蒸发仪浓缩以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI Silysia Chemical Ltd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。表12显示使用乙酰基质的蛋白酶所得的产率。

表12：使用乙酰基质的蛋白酶试剂所得的产率

实例10：酮的镜像选择性还原-以R-form为主

步骤A：在室温下，将羟基基质溶解于乙酸异丙酯(Sigma-Aldrich,Inc.；批号：STBH5768)中。将碳酸钠和脂肪酶丙烯酸树脂(Sigma-Aldrich,Inc.；批号：SLBW1544)加入溶液中。将反应混合物在室温下放置16小时。过滤反应混合物，并以旋转蒸发仪浓缩以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI Silysia Chemical Ltd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。

步骤B：在室温下，将乙酰基质溶于MeOH中。将NaOMe加入溶液中。接着于室温下搅拌反应混合物1小时。反应完成后，将反应混合物用HCl(溶于MeOH，浓度1N)终止反应，并利用旋转蒸发仪浓缩以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI SilysiaChemical Ltd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。表13显示使用乙酰基质的脂肪酶试剂所得的产率。

表13：使用乙酰基质的脂肪酶试剂所得的产率

实例11：以R-form为主的脂肪酶选择性水解

在室温下，将乙酰基质溶于乙醚(Avantor Performance Materials,Inc.；批号：0000128533)和0.1M、pH 7.0的磷酸钾缓冲液中。将蛋白酶(Sigma-Aldrich,Inc.；批号：SLBW1544)加入溶液中。将反应混合物在室温下放置16小时。过滤反应混合物，并利用旋转蒸发仪浓缩以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI Silysia ChemicalLtd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。表14显示使用乙酰基质的脂肪酶试剂所得的产率。

表14：使用乙酰基质的脂肪酶试剂所得的产率

实例12：以R-form为主的蛋白酶选择性水解

步骤A：在室温下，将乙酰基质溶于乙醚(Avantor Performance Materials,Inc.；批号：0000128533)和0.1M、pH 7.0的磷酸钾缓冲液中。将蛋白酶(Sigma-Aldrich,Inc.；取自地衣芽孢杆菌，批号：SLBX1986)加入溶液中。将反应混合物在室温下放置16小时。过滤反应混合物，并利用旋转蒸发仪浓缩以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJISilysia Chemical Ltd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。

步骤B：在室温下，将乙酰基质溶于MeOH中。将NaOMe加入溶液中。接着于室温下搅拌反应混合物1小时。反应完成后，将反应混合物用HCl(溶于MeOH，浓度1N)终止反应，并利用旋转蒸发仪浓缩以得到粗产物。将残余物以管柱层析法通过硅胶垫(FUJI SilysiaChemical Ltd.；目录号：HT80186)纯化。冲提液系统的EtOAc/己烷体积比＝1/4至3/1。利用旋转蒸发仪和高真空浓缩收集到的分离液以取得产物。表15显示使用乙酰基质蛋白酶所得的产率。

表15：使用乙酰基质蛋白酶试剂所得的产率

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