一种高抑菌活性平卧菊三七生物碱的提取方法
阅读说明：本技术 一种高抑菌活性平卧菊三七生物碱的提取方法 (Method for extracting gynura procumbens alkaloid with high antibacterial activity ) 是由 李安平 余江帆 唐玉妹 王乐 李刚 于 2020-04-13 设计创作，主要内容包括：一种高抑菌活性平卧菊三七生物碱的提取方法,包括以下步骤：(1)粉碎过筛；(2)超临界CO-2萃取；(3)分离；(4)真空干燥；(5)高压结晶；(6)洗涤干燥；(7)电磁场结晶；(8)过滤；(9)洗涤干燥。本发明先用超临界CO-2萃取和大孔吸附树脂分离,然后通过高压结晶和电磁场结晶获得纯度≥95%的平卧菊三七生物碱晶体。本发明所提取到的平卧菊三七生物碱抑菌活性较强,对病毒RSV和HSV-1均有较好的抑制作用,其效果均接近黄连碱晶体,能广泛应用于食品和药品领域,市场前景广阔。(A method for extracting Gynura procumbens alkaloid with high antibacterial activity comprises the following steps: (1) pulverizing and sieving; (2) supercritical CO 2 Extracting; (3) separating; (4) vacuum drying; (5) high-pressure crystallization; (6) washing and drying; (7) crystallizing by an electromagnetic field; (8) filtering; (9) and (5) washing and drying. The invention uses supercritical CO firstly 2 Extracting, separating with macroporous adsorbent resin, and crystallizing under high pressure and electromagnetic field to obtain Gynura procumbens alkaloid crystal with purity of 95% or more. The gynura procumbens alkaloid extracted by the invention has stronger antibacterial activity, has better inhibiting effect on viruses RSV and HSV-1, has the effect similar to that of coptisine crystals, can be widely applied to the fields of food and medicine, and has wide market prospect.)
技术领域
本发明涉及一种植物生物碱的提取分离方法，具体涉及一种从平卧菊三七植物中提取具有高抑菌活性的生物碱提取分离方法。
背景技术
平卧菊三七(Gynura procumbens(Lour.)Merr.)为菊科，菊三七属攀援草本植物，2012 年被国家卫生部批准为新资源食品。大量研究表明，平卧菊三七含有大量的绿原酸、类黄酮和生物碱等活性成分，具有清热解毒、活血通络、提高人体免疫力和抗病毒等功效。
目前，平卧菊三七功效活性成分的提取分离工作主要集中在绿原酸、黄酮类化合物和多糖等方面，对于生物碱的提取方法研究较少。一些植物生物碱因其具有抑菌、抗肿瘤和降血糖等功效,而且成本低，因此成为研究的热点。特别是食品行业，为了延长产品货架期常常加入食品防腐剂，而过多食用人工合成的防腐剂不利于人体健康。因此，迫切希望能从平卧菊三七植物中提取高效安全的抑菌防腐剂。
生物碱是植物次生代谢产物中一类含氮的碱性有机化合物，多数具有复杂的含氮杂环，是中草药中重要的有效成分之一。目前从植物中分离出的生物碱约有5000～7000种，根据其结构的不同，可分为有机胺类、吲哚类、异喹啉类、吡啶类、莨菪烷类生物碱。大多数生物碱不溶于水或难溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇、丙酮等有机溶剂。有机溶剂的使用虽然有助于生物碱提取分离，但也会造成环境的污染和生物碱安全性差的问题。
因此，希望有一种兼顾安全性和高效性的平卧菊三七生物碱的提取分离方法，所提取分离的生物碱具有较强抑菌活性，可将其添加到食品中不仅能抑制各种有害微生物的生长，同时还能有助于消费者抵抗病毒，保持身体健康。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种提取过程对环境污染少，提取分离纯化效率高，产品安全性好且抑菌活性强的平卧菊三七生物碱的提取分离方法。
本发明提取的平卧菊三七生物碱化合物的分子式为C7H11NO2，命名为Arecaidine，化学结构式为：
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
一种高抑菌活性平卧菊三七生物碱的提取方法，包括以下步骤：
(1)粉碎过筛：将平卧菊三七全草洗净，去杂，沥干，干燥，粉碎，得平卧菊三七全草粉末；
(2)超临界CO2萃取：将步骤(1)所得平卧菊三七粉末置于萃取釜中，然后分别对萃取釜、分离釜和储罐预热，当达到设定温度时进行系统加压，加入无水乙醇作为夹带剂，循环萃取，经分离釜分离，获得提取液；
(3)分离：将步骤(2)所得提取液经大孔吸附树脂吸附，洗脱，收集，得到洗脱液；
(4)真空干燥：将步骤(3)所得洗脱液进行真空干燥，得到总生物碱干物质；
(5)高压结晶：在步骤(4)所得总生物碱干物质中加入无水乙醇，形成总生物碱无水乙醇饱和溶液，倒入压力容器中，加压待溶液温度充分冷却结晶后泄压，得到高压结晶混合溶液；
(6)洗涤干燥：将步骤(5)所获高压结晶混合溶液过滤，再将过滤所得湿晶体用无水冰乙醇洗涤1～2次，真空干燥至恒重，获得粗晶体；
(7)电磁场结晶：将步骤(6)所得粗晶体放入容器中用溶剂溶解，然后置于电磁场中进行真空浓缩结晶，结晶完成后，降至常温，破坏真空度，获得晶体混合溶液；
(8)过滤：将步骤(7)所得的晶体混合溶液用滤布过滤，获得结晶体；
(9)洗涤干燥：将步骤(8)所得的结晶体用无水冰乙醇洗涤，然后真空干燥，即获得高纯度的平卧菊三七生物碱结晶体。
进一步，步骤(1)中，所述干燥的温度为65℃～75℃，干燥至水分质量含量为8％～14％，过筛用筛网目数优选为60目。
进一步，步骤(2)中，所述萃取釜中超临界CO2萃取条件为：萃取温度45～55℃，萃取压力22～25MPa，萃取时间6～10min。
进一步，步骤(2)中，所述无水乙醇的加入方式优选为：每隔50～60min按平卧菊三七粉末质量1g︰1ml～1g︰3ml比例加入。
进一步，步骤(2)中，所述分离釜中的条件是：温度35～40℃，压力13～16MPa，时间4～6min。
进一步，步骤(3)中，所述大孔吸附树脂为D101型大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂的吸附流速为2～6BV/h，温度为30～60℃；所述洗脱是采用体积浓度为10～40％的乙醇作为洗脱液，流速为1～4BV/h，温度为10～40℃。
进一步，步骤(4)中，所述真空干燥的温度为55～60℃，真空度为50～90KPa，干燥的时间为4～6h。
进一步，步骤(5)中，所述总生物碱饱和溶液的配制方法是：按总生物碱干物质1g︰2ml～1g︰5ml比例加入无水乙醇，然后在温度为50～60℃条件下溶解；所述加压的压力优选为40～65Mpa，压力维持的时间优选为30～100min。
进一步，步骤(6)中，所述过滤用滤网目数为200～250目。所述无水冰乙醇的温度为 -25～-5℃。
进一步，步骤(7)中，所述溶剂溶解是指按粗晶体质量为1g︰2ml～1g︰5ml比例加入无水乙醇溶解。所述降至常温是指，按照1～2℃/min的速度由40～50℃缓慢降至常温。
进一步，步骤(7)中，所述电磁场的磁通量密度为0.2～0.7T。
进一步，步骤(7)中，所述真空浓缩结晶时的真空度为80～100KPa。
进一步，步骤(8)中，所述滤布的目数为200～250目。
进一步，步骤(9)中，所述真空干燥的温度为40～45℃，真空度为50～90KPa，时间为20～24h。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明通过超临界CO2萃取技术获得高纯度的生物碱提取液，然后将提取液置于高压下在冷却过程中加速晶核的形成和晶体的生长，从而快速获得生物碱结晶；
2)本发明将粗结晶溶液置于电磁场中进行减压浓缩结晶分离，通过磁场作用对分子和原子的聚集状态、迁移速度和方向产生影响，增加生物碱间的碰撞机会，促进晶核形成和晶体生长，同时借助于粗结晶溶液中各种物质之间极性、电荷和磁敏感性等的不同对它们产生的影响，从而增加物质之间的分离度，达到分离纯化的目的；
3)本发明未使用任何有毒有害的化学试剂，对环境无污染；
总之，本发明克服了现有技术的不足，提供了一种高纯度平卧菊三七生物碱的提取方法，且制得生物碱具有较强的抑菌活性，对病毒RSV和HSV-1均有较好的抑制作用，其效果均接近黄连碱晶体。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
实施例1
本实施例包括以下步骤：
(1)粉碎过筛：将平卧菊三七全草洗净去杂，沥干后置于70℃温度条件下干燥至水分质量含量为10％，接着用粉碎机粉碎，过60目筛，得平卧菊三七全草粉末；
(2)超临界CO2萃取：将步骤(1)所得平卧菊三七粉末置于萃取釜中，然后分别对萃取釜、分离釜和储罐预热，当达到设定温度时进行系统加压，每隔50min按平卧菊三七粉末的质量1g︰1ml比例加入无水乙醇作为夹带剂，循环萃取，经分离釜获得提取液；萃取釜中超临界CO2萃取条件为：温度50℃，压力23MPa，时间8min；分离釜工作条件为：温度35℃，压力15MPa，时间5min；
(3)分离：将步骤(2)所得提取液经D101型大孔吸附树脂吸附，洗脱，收集，得到洗脱液；大孔吸附树脂的吸附流速为3BV/h，温度为40℃；洗脱时采用体积浓度为25％的乙醇作为洗脱液，流速为2BV/h，温度为35℃；
(4)真空干燥：将步骤(3)所得洗脱液进行真空干燥，干燥温度为55℃，真空度为70KPa，干燥5h，得到总生物碱干物质；
(5)高压结晶：在步骤(4)所得总生物碱干物质中按1g︰2ml比例加入无水乙醇，然后在温度为50℃条件下溶解，形成饱和溶液，接着将其倒入于压力容器中，再在45MPa压力条件下维持50min，待溶液温度充分冷却结晶后泄压，得到高压结晶溶液；
(6)洗涤干燥：将步骤(5)所获高压结晶溶液用200目筛网过滤，然后用温度为-10℃无水冰乙醇洗涤晶体1次，接着真空干燥至恒重，获得粗晶体；真空干燥条件为：温度为55℃，真空度为60KPa，时间为5h；
(7)电磁场结晶：在步骤(6)所得粗晶体按质量1g︰3ml比例加入无水乙醇溶解，然后置于磁通量密度为0.3T的电磁场中进行真空浓缩结晶，其中真空度控制为85KPa，溶液按照 1℃/min的速度由45℃缓慢降到常温，破坏真空度，获得晶体溶液；
(8)过滤：将步骤(7)获得的晶体溶液用200目滤布过滤，获得结晶体；
(9)洗涤干燥：将步骤(8)获得的结晶体用温度为-15℃的无水冰乙醇洗涤2次，接着在温度为45℃，真空度为70KPa的条件下干燥22h，获得纯度为95％的平卧菊三七生物碱结晶体，收率为73％。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于将步骤(5)中所述结晶压力由45MPa调整为常压，并且按上述实施例1所述完成实验步骤(6)洗涤干燥后获得粗晶体，然后分别测定步骤(5)开始出现晶体时间、粗晶体纯度和回收率，结果见表1。
实施例2
实施例2与实施例1的区别仅在于将步骤(5)中所述结晶压力由45MPa调整为40MPa，并且按上述实施例所述完成实验步骤(6)洗涤干燥后获得粗晶体，然后分别测定步骤(5) 开始出现晶体时间、粗晶体纯度和回收率，结果见表1。
实施例3
实施例3与实施例1的区别仅在于将步骤(5)中所述结晶压力由45MPa调整为60MPa，并且按上述实施例所述完成实验步骤(6)洗涤干燥后获得粗晶体，然后分别测定步骤(5) 开始出现晶体时间、粗晶体纯度和产品回收率，结果见表1。
表1高压结晶的压力对生物碱粗晶体结晶的影响
注：表中数据右上角**表示实施例2和3与对比例1相比存在极显著性差异，P＜0.01。
从表1可以看出，实施例2和3的开始出现晶体时间、粗纯度和回收率与对比例1相比均存在极显著性差异，P＜0.01。在生物碱结晶过程中给一定的压力有助于晶体的析出，施加 40MPa和60MPa压力后分别在41min和38min时就开始结晶，而在常温下却要在63min之后才开始结晶。所得生物碱晶体的纯度由对比例1的46.52％提高到实施例2的78.14％和实施例3的79.77％，产品回收率由对比例1的56.08％提高到实施例2的68.81％和实施例3的70.33％。
对比例2
对比例2与实施例1的区别仅在于将步骤(7)中所述电磁场强度由磁通量密度为0.3T 调整为不另外施加磁场强度，按上述实施例1所述得到平卧菊三七生物碱结晶体，然后测定步骤(7)开始出现晶体时间、最终晶体的纯度和回收率，结果见表2。
实施例4
本发明实施例4与实施例1的区别仅在于将步骤(7)中所述电磁场强度由磁通量密度为0.3T调整为0.6T，按上述实施例1所述得到平卧菊三七生物碱结晶体，然后测定步骤(7) 开始出现晶体时间、最终晶体的纯度和回收率，结果见表2。
表2电磁场强度对生物碱结晶的影响
注：表中数据右上角**表示实施例1和4与对比例1相比存在极显著性差异，P＜0.01。
从表2可看出，本发明实施例1和4的开始出现晶体时间、产品纯度和产品回收率与对比例2相比均存在极显著性差异，P＜0.01。与没有电磁场的对比例2相比，分别处于磁通量密度为0.3T的实施例1和磁通量密度为0.5T的实施例4条件下所进行得生物碱结晶，开始出现结晶时间由对比例2的耗时51min提前到实施例1的27min和实施例4的26min，所得生物碱晶体的纯度由对比例2的81.52％提高到实施例1的95.14％和实施例4的97.01％，产品回收率由对比例2的61.94％提高到实施例1的72.40％和实施例4的78.26％。
表3平卧菊三七生物碱晶体对抑菌圈直径的影响/mm
供试样品
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
沙门氏菌
黑曲霉
实施例1晶体
12.54±0.25b
13.29±0.17c
10.86±0.25b
13.47±0.49a
12.86±0.25a
实施例4晶体
15.59±0.12a
14.02±0.42b
11.95±0.34a
13.65±0.16a
12.82±0.28a
无菌水(空白对照)
7.00±0.01c
7.00±0.01d
7.00±0.01c
7.00±0.01b
7.00±0.01b
黄连碱(阳性对照)
16.34±0.63a
15.11±0.12a
12.12±0.15a
13.10±0.12a
12.10±0.12a
注：同一列数据上标不同字母的数值之间具有显著性差异，P＜0.05；
分别将本发明实施例1和实施例4方法制备的2种平卧菊三七生物碱晶体，以及黄连碱(生物碱标样)用无菌水配制成2mg/mL的样品溶液，无菌水作为空白对照，采用平板打孔法测试其抑菌效果。取100μL配制的样品溶液放入平板孔径为7mm的圆孔内，细菌培养基放入 37℃的恒温培养箱中培养24h，霉菌培养基放入28℃的恒温培养箱中培养48h。观察并用游标卡尺测定培养皿抑菌圈的直径，结果见表3。
参见表3，本发明实施例1和实施例4提取的2种不同纯度生物碱晶体对5种常见细菌的抑菌效果显著高于无菌水对照(P＜0.05)，说明其具有广谱抑菌效果。实施例4方法提取的生物碱晶体与黄连碱具有最强的抑菌效果，但两者间没有显著性差异(P＞0.05)，表明实施例4方法提取的平卧菊三七生物碱晶体具有较强的抑菌活性。
表4平卧菊三七生物碱晶体对RSV和HSV-1病毒的抑制作用
分别将实施例1晶体、实施例4晶体和黄连碱晶体(生物碱标样)用无菌水配制成不同浓度测试其对病毒的抑制作用，无菌水作为空白对照。实验病毒采用呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)和Ⅰ型单纯性疱疹病毒(herpes simplex virustype 1,HSV-1)，病毒抑制效果评估选择药物半数中毒浓度(TC50)、半数有效浓度(EC50)和治疗指数[TI＝半数中毒浓度(TC50)/半数有效浓度(EC50)]等3个指标评估。治疗指数TI越大，说明此样品对病毒抑制效果越好。
从表4可知道，实施例1晶体和实施例4晶体对病毒RSV和HSV-1的治疗指数TI较大，抑制作用较强，其效果均接近黄连碱晶体。平卧菊三七生物碱晶体在其有效浓度范围内，随稀释浓度的增大，生物碱浓度减小，其抑制率减小，表现出较为明显的量效关系。
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