具体实施方式

水产养殖、农业和废水处理方法

根据一个优选的实施方式，优选使用下述的温育系统和优选的萌发方法，现场由营养萌发剂组合物与孢子组合物的组合或由预混的营养物孢子组合物产生温育的细菌溶液，并且将活性细菌进料到水产养殖应用中的养成池或喂养动物或应用于农业应用中的农作物或废水系统。温育的细菌溶液可以在自动化或半自动化系统中定期产生并且供应给水产养殖、农业、废水或环境修复应用，或者可以按需手动供给。对于水产养殖应用，优选温育的细菌溶液主要包含活化的营养细菌。在水产养殖应用中，还优选与温育的细菌溶液一起同时(在添加温育的细菌溶液时或临近添加温育的细菌溶液时)向养成池中添加一种或多种硝化增强剂。

优选实施方式的现场便携式温育器系统10A包含用于容纳混合在一起以形成营养物孢子组合物的营养萌发剂组合物和孢子组合物或用于容纳预混营养物孢子组合物的一个或多个容器以及非电、非电池且非燃气动力加热器。优选地，如图1A所示，系统10A包含容纳了一定量浓缩营养物孢子组合物的容器或小包34、较大的温育容器18和无焰加热器包19。包34优选包含根据下述营养物孢子组合物优选实施方式的此类组合物。最优选地，包34由对气体和水不可渗透的无孔材料制成。温育容器18优先包含透光或透明的塑料袋，其尺寸足以容纳营养物孢子组合物的包34、无焰加热器包19和任选(但优选)量在使用点提供的水16。也可以使用其它类型的容器。容器18优选地包括用于填充线的标记，该标记指示应向容器18中添加多少水以激活无焰加热器19和/或给营养物孢子组合物提供一些稀释剂。替代地，容器18可以包含将一定量的水(例如两杯)加到容器中的说明。优选地，容器18是密封型的，从而在加热期间不需要由使用者手动保持关闭状态。作为替代，容器18也可以是分隔型的，一侧容纳无焰加热器和添加的任何激活水，且另一侧容纳营养物孢子组合物的包34。使用点或附近的井、市政供水、瓶装水或养成池可以提供可添加到容器18中的水16。

温育器系统10还优选包含无焰加热器19，如美国专利号5,611,329中公开的那些，但是也可以将其它放热化学反应加热器用于无焰加热器19。无焰加热器19优选包含装有粉末状化学品混合物的袋，该混合物在存在另一化学品，水或空气的情况下会发生放热反应。一种优选的无焰加热器19包含填充有镁5原子量铁超腐蚀合金、惰性填料、氯化钠和消泡剂的透水且透气的塑料袋，诸如美国专利号5,611,329中描述的那些，其通过引用并入本文。另一优选的无焰加热器19在设置在外部透气袋内的内袋中包含化学品，该化学品在内袋破裂时会与空气反应，例如通常用于暖手器的类型。另一优选的无焰加热器19包含分隔袋或放置在外袋中的内袋。将第一化学品设置于分隔袋的一部分内或设置于内部部分，并且将与第一化学品以放热反应发生反应的第二化学品(或水或空气)设置于分隔袋的另一部分内或设置于外袋内。然后将内袋或袋之间的分隔物弄破，以使第一化学品和第二化学品相互接触，开始反应并向温育器罐18供热。

在期望产生温育的细菌溶液时，优选地将无焰加热器19置于容器18内并且还将浓缩的营养物孢子组合物的袋34置于容器18内。容器18也可以内部已经有加热器19和包34的方式出售，以含有需要产生温育的细菌溶液的主要组分的单一单元出售。如果通过水来激活无焰加热器19，则将水加入到容器18中，优选至容器18上指示的水平或加入所需的量，并且将开始化学反应并向营养物孢子组合物包34提供足够的热量以启动细菌孢子的萌发。如果不通过水活化，则使用者优选弄破内袋或袋之间的分隔物以启动化学反应或者打开先前密封的容器18以允许空气进入。

经过所需的温育期后(优选按照以下所述的优选温育方法)，从容器18中取出包34(现在含有温育的细菌溶液20)并且通过打开所述包并将其内容物倒入水产养殖、农业、废水或环境修复应用中，以将温育的细菌溶液20手动供应给所需的水产养殖、农业、废水或环境修复应用。由于包34是浓缩组合物，因此在农业应用中，优选将温育的细菌溶液添加到水源中，例如动物饮用水或农作物灌溉源，以帮助分散溶液。

另一优选实施方式的现场便携式温育器系统10B包含用于容纳混合在一起以形成营养物孢子组合物的营养萌发剂组合物和孢子组合物或用于容纳预混营养物孢子组合物的一个或多个容器以及非电、非电池和非燃气动力加热器。优选地，如图1B所示，系统10B包含容纳一定量营养萌发剂组合物12或浓缩营养萌发剂组合物24的容器或小包、细菌孢子溶液14或浓缩细菌孢子溶液30的容器或小包、密封型混合容器40、较大的温育容器18和无焰加热器包19。包12、24、14和30优选包含根据下述组合物优选实施方式的此类组合物。最优选地，包12、24、14和30以及容器40由不透气且不透水的无孔材料制成。系统10B中的容器18和无焰加热器19与关于系统10A描述的相同。系统10B中温育的细菌溶液的产生及其应用与系统10A中的相同，不同之处在于，由于营养萌发剂和孢子处于不同的包中，因此，包12/24和14/30的内容物必须倒入到混合容器40(优选密封型混合容器)中，然后将容器40放置在温育容器18内以进行加热，以便营养萌发剂和孢子在加热期间可以被混合在一起。替代地，混合容器和温育容器可以是同一容器，以便在将包12/24和14/30的内容物与任选的水一起直接添加或排入到容器18中时，温育容器18充当混合容器并且在同一容器加热。最优选地，如果温育容器18用作混合容器，其为分隔容器以将混合的营养物孢子组合物与无焰加热器分隔开来，或者将无焰加热器19的内容物密封，并且不得与营养物孢子组合物混合。

一旦温育期结束，将容器18的内容物(无焰加热器包19除外)供应到水产养殖、农业和废水处理应用。由于无焰加热器包18中的化学反应可能产生在特定水产养殖、农业和废水处理应用中可能不希望使用的反应副产物，优选使用(1)分隔容器18，一侧用于无焰加热器且隔开侧用于包34或12/24和14/30的内容物，这允许热量传递到细菌侧而不会与任何副产物接触，或(2)使用密封包(sealed packet)34或密封混合容器40以保护温育的细菌溶液免于接触此类副产物。一旦温育期结束，容器18、无焰加热器19以及容器18中的任何水内容物或副产品均可作为普通废物丢弃。

尽管优选使用营养萌发剂组合物以增强温育，但细菌孢子溶液14/30可以单独用于系统10A或10B以在应用于水产养殖、农业、废水或环境修复应用之前加热处理孢子。热处理孢子将有助于其萌发；但是，当还使用根据本发明优选实施方式的营养萌发剂组合物时能够改善结果。

优选地，无焰加热器19加热至根据下文所述温育方法的优选实施方式的所需温育温度。已知可商购的无焰加热器在约15分钟的反应时间后加热至约38℃(100F)。典型地，无焰加热器19会产生足够的热量并将热量保持长达30分钟，由此一包足以满足所需的温育期。但是，如果需要更长的温育期，则在前一包反应之后或期间，可以将一个或多个另外的无焰加热器包19添加到容器18中。此外，如果需要从无焰加热器19中以放热化学反应进行反应的最高温度中降低所述包的内容物的暴露温度，则添加至容器18的任何所述包34、12/24或14/30可以由绝缘材料制成。

系统10A/10B优选为简单的便携式和手动操作系统，其中将营养萌发剂组合物的袋或容器以及孢子组合物(如果尚未与营养萌发剂组合物预混合)的袋或容器与无焰加热器包19一起手动加入到容器18中，根据需要向罐18手动加入水以稀释所述组合物和/或引发无焰加热器19中的化学反应，任选手动混合所述组合物，并且通过加水或破坏化学品的袋来手动触发无焰加热器19反应。一旦温育期结束，将温育的细菌溶液20手动排放到所需的水产养殖、农业或废水应用22。这允许使用非常简单的系统和方法在使用点生成温育的细菌溶液，并将该溶液提供给水产养殖、农业、废水或环境修复应用，而无需任何电源或电加热器或火焰加热器。系统10A和10B优选用于水产养殖、农业、废水或环境修复应用的紧急处理或零星处理，而本文所述的本发明的其它优选系统优选用于进行中的处理。一旦应用了温育的细菌溶液，容器18、用于营养物和孢子组合物的包以及无焰加热器包19均可以作为普通废物处理。系统10A和10B优选是轻量化的，重量优选小于5磅，以使易于将其携带到使用点。

图2-4示出了其它优选实施方式的现场温育器系统110、210和310。系统110、210和310也是简单的手动操作系统，类似于系统10A/10B，但是具有更多永久性或可重用的组件，诸如罐18和任选的管道系统以从水源16供应水。系统110优选包含用于容纳一定初始体积营养萌发剂组合物12和一定初始体积细菌孢子溶液14(如果细菌孢子未被包括在营养萌发剂组合物中)的一个或多个罐或容纳容器以及构造以接收营养萌发剂组合物12和孢子溶液14(如果尚未与营养萌发剂组合物预混合)的至少一部分的温育器罐、储器或其它类型的容器18。这些孢子和营养萌发剂组合物也可以到达与温育器18呈流体连通的容器中使用部位，在此种情况下，不需要单独的罐或容器。水产养殖、农业、废水或环境修复场所处或附近的水源16也任选但优选与温育器系统流体连通。井、市政供水源或养成池可将水16提供给温育器容器或储器18。

温育器系统110还优选包含无焰加热器19，如之前系统10A/10B所描述的。当将一部分营养萌发剂组合物和孢子组合物添加到温育器罐18中时，优选将无焰加热器19紧邻温育器罐18放置以向温育器罐19供热。无焰加热器19优选包含装有在另一化学品，水或空气存在下发生放热反应的化学品的粉末混合物的袋。一种优选的无焰加热器19包含装有镁5原子量铁超腐蚀合金、惰性填料、氯化钠和消泡剂的透水且透气的塑料袋，如美国专利号5,611,329中描述的那些，其通过引用并入本文。另一优选的无焰加热器19在设置于外部透气袋内的内袋中包含当该内袋破裂时会与空气反应的化学品，例如通常用于暖手器的类型。另一优选的无焰加热器19包含分隔袋或放置在外袋中的内袋。将第一化学品设置于分隔袋的一部分内或设置于内部部分，并且将与第一化学品以放热反应发生反应的第二化学品(或水或空气)设置于分隔袋的另一部分内或设置于外袋内。然后将内袋或袋之间的分隔物弄破，以使第一化学品和第二化学品相互接触，开始反应并向温育器罐18供热。无焰加热器19优选设置在罐18的下方，但是也可以围绕罐18的一侧或多侧设置或设置在罐18内。如果水是袋中化学品的反应物，则将来自水源16的水供应到无焰加热器19以引发放热反应。当水用作反应物时，也可以将无焰加热器19设置在容器或罐的内部，以使水与化学品的袋接触。

优选地，根据下述温育方法的优选实施方式，无焰加热器19加热到所需的温育温度内。已知可商购的无焰加热器在约15分钟的反应时间后加热至约38℃(100F)。典型地，无焰加热器19会产生足够的热量并将热量保持长达30分钟，由此一包足以满足所需的温育期。但是，如果需要更长的温育期，则可以使用一个或多个另外的无焰加热器19，在前一加热器反应之后或期间，在新的无焰加热器19中引发化学反应。此外，如果需要从无焰加热器19中以放热化学反应进行反应的最高温度中降低温育器18内容物的温度暴露，则温育器18和/或无焰加热器19的容器可以由绝缘材料制成。

与系统10A/10B一样，系统110优选手动操作。手动将营养萌发剂组合物的袋或容器和孢子组合物(如果尚未与营养萌发剂组合物预混合)的袋或容器、或一部分初始较大体积的这些组合物添加到罐18中，按需手动向罐18中加入水以稀释所述组合物(和/或如果无焰加热器19设置在罐18中，则在无焰加热器19内引发化学反应)，手动混合所述组合物，通过向加热器的单独容器(如果未设置在罐18内)加入水或破坏化学品的袋来手动触发无焰加热器19的反应。尽管优选单个无焰加热器19包就足够了，但是可以手动添加另外的包，并根据需要触发反应以在所需的温育期内将温度保持在所需范围内。一旦温育期结束，将温育的细菌溶液20排入所需的水产养殖、农业、废水或环境修复应用22。系统110优选包括一个或多个手动激活阀和管道，其连接至罐18和/或用于无焰加热器19的单独的容器，以协助将组合物和水添加到罐18中，按需向无焰加热器19中加入水，并且从罐18中排出温育的细菌溶液20，均优选通过重力流或通过市政供水中提供的压力来完成。这允许一种非常简单的系统和方法，在使用点生成温育的细菌溶液，并将该溶液供应给水产养殖、农业、废水或环境修复应用，而无需任何电源或电加热器或火焰加热器。

系统110的其它特征也可以是自动化的，包括阀和泵(根据需要，如果重力流动不充分)以使营养萌发剂组合物12、细菌孢子溶液14和任选的水16从其储存容器/源流动到温育器罐18并且从罐18排出温育的细菌(或活化的细菌)溶液20并且将其传输至水产养殖、农业、废水或环境修复应用22；温育器罐18内任选的混合器，和控制器或计时器，其用于激活阀、泵、任选混合器，用于控制营养物和孢子组合物流入温育罐18、添加水至无焰加热器19、温育时间和排放至水产养殖、农业、废水或环境修复应用22。在手动或自动形式中或其组合中，现场温育器系统110优选使用营养萌发剂组合物与细菌孢子组合物的组合(如下所述)或者使用营养物孢子组合物(与细菌孢子预混合的营养萌发剂组合物，也如下所述)(两者在本文中也称为“发酵剂材料”)，以产生要被排入水产养殖、农业、废水或环境修复应用22的温育的细菌溶液20。

替代地，根据如图3所示的另一优选实施方式，温育器系统210使用浓缩的营养萌发剂组合物24和浓缩的孢子组合物30，使用来自容器/源26的稀释剂或水将其稀释以形成工作营养萌发剂组合物28和工作孢子组合物32，将其各自的一部分进料到温育器18中以产生一批激活的细菌20。代替源26或除源26之外，源16中的水也可用作稀释剂源。此外，仅营养萌发剂组合物24或孢子组合物30之一可以为浓缩形式并且在进料到温育器18中之前需要稀释。根据另一优选的实施方式，在仅一种被浓缩时，除了或代替源26和/或源16的水/稀释剂，可以将非浓缩组合物用作浓缩组合物的稀释剂。根据另一优选的实施方式，将浓缩的营养物孢子组合物34用于如图4所示的系统310。使用来自源26和/或源16的水/稀释剂稀释浓缩的营养物孢子组合物以制备工作营养物孢子组合物36，然后进料到温育器18中以产生一批活化的细菌20。替代地，营养物孢子组合物可以不是浓缩形式并且在进料到温育器18之前不需要任何稀释剂(类似于图2中直接进料的营养萌发剂组合物12)，在此种情况下，不需要水/稀释剂源26。在这一替代实施方式中，仍然可以按需任选地将来自源16的水进料到温育器18中。采用任何温育器系统实施方式，可以将稀释剂进料到温育器18中以在该温育器内而非在向温育器进料之前稀释浓缩的组合物。如本领域普通技术人员将理解的，可以将来自系统10A/10B、110、210和310的要素的任何组合一起使用。

优选地，根据本文所述的优选萌发方法在温育器容器或罐18中萌发细菌孢子。可商购的无焰加热器通常能够在大约12-15分钟内加热到比起始温度(或环境温度)高约38℃(100F)的温度。根据一个优选的实施方式，在容器或温育器18中使用无焰加热器19将营养萌发剂组合物和孢子组合物(或营养物孢子组合物)加热至约35℃至约90℃的温度，更优选约38℃至约90℃。温育温度可以是35℃至约90℃范围内的任何个体温度或子范围。根据另一优选的实施方式，组合物被加热至35-55℃范围内的温度，更优选38-50℃或38-60℃范围内的温度，且最优选41℃至44℃范围内的温度。温育期可根据最终用途应用和使用的特定无焰加热器19而有所差异，但优选2-60分钟，更优选约10-15分钟。为了产生用于水产养殖、农业、废水或环境修复应用的活性细菌，优选的温育期为约20分钟至60分钟，并且为了益生应用而产生亚稳态细菌，优选约2分钟至5分钟。为了给营养细菌提供另外的生长时间，温育期可以为约4至6小时。如果需要，在系统10A/10B中的化学反应结束之前，可以从容器18中取出包34或混合容器40。类似地，如果需要，在系统110、210或310中的化学反应结束之前，可以排出温育器18的内容物。

根据细菌在水产养殖、农业、废水或环境修复应用中的所需用途，诸如用于处理水或作为水生物种的益生菌，可以使用不同的温育期以提供主要仍为孢子形式的细菌、主要是亚稳态细菌(其中孢子既不休眠也不处于营养生长阶段，在本文中也称为活化状态)或主要是完全营养细菌的温育的细菌溶液。此外，当需要完全营养的细菌时，在温育期之后，可以将细菌溶液在温育器罐18或另一中间容器中放置一段时间，以使细菌繁殖，然后再排放到水产养殖、农业、废水或环境修复应用中。最优选地，细菌溶液将保持在30至45℃的温度下，更优选地，根据需要加热营养细菌溶液以将溶液温度保持在33至42℃范围内，并且最优选在36℃至39℃的范围内，以在该温育后生长期促进生长。当需要益生菌应用时，通过使用较短的温育期，在排入水产养殖应用时，细菌主要保持孢子状态或亚稳状态，这使细菌有更好的机会生存到水生物种的肠道中，在肠道中它们作为益生菌最有益。在温育期结束时，将温育的细菌溶液20排入水产养殖、农业、废水或环境修复应用。取决于所用细菌的种类、温育温度、温育时间和所用营养物的含量，温育的细菌溶液20可以包含完全营养细菌、亚稳态细菌、孢子或其组合。

在温育期期间和/或在温育后生长期期间，可以根据需要使用新的化学品袋代替无焰加热器19中的化学品袋以将温度保持在所需的范围内。

每批温育的细菌溶液20包含约1x10⁸–1x 10¹⁰cfu/mL的亚稳态、营养细菌物种和/或孢子。在水产养殖、农业和废水应用中，一旦排放入适用的水源22(例如养成池或废水罐)中，每批中的细菌量将根据水源中的水量进行稀释。最优选地，将足够量的细菌溶液20添加到适用的水源22中，以基于养成池、饮用水、废水罐或系统或其它水容器中的稀释度提供有效量的活化细菌。在本上下文中，“有效量”可以指在施用后可以有效改善植物或动物的性能或改善废水状况的细菌和/或营养剂组合物的量。可以通过监测包括但不限于水质的一个或多个特性来衡量或评估性能的改善：水的澄清度、氨水平、亚硝酸盐水平、硝酸盐水平、疾病发生率、死亡率、收获重量、肉品质、动物个体大小、溢价重量、抗生素使用和添加剂使用。“有效量”还可以指这样的量，该量可以减少动物肠中一种或多种病原性细菌(包括但不限于大肠杆菌和沙门氏菌)的量、竞争性排除和/或消除所述一种或多种病原性细菌。“有效量”也可以指能够减少NH₃(例如可能由动物向其环境中排泄的NH₃)和/或H₂S水平的量，H₂S在废水应用中可能是一个问题。

根据用于包含的水产养殖应用的一个优选实施方式，养成池中细菌的有效量可以为约1至约9x 10²CFU/mL。根据另一优选的实施方式，包含的水产养殖应用的有效量为约1至约9x 10²至约10⁸CFU/mL。根据另一优选的实施方式，养成池中温育的细菌的有效量可以为养成池中水总量的约0.001％至约2％v/v及其中的任何范围或值。作为另一个例子，每天四次向养成池中投加约500mL包含约1x10⁹–1x 10¹⁰cfu/mL细菌物种的温育的细菌溶液，足以处理含有100,000加仑水的养成池。如本领域普通技术人员可以理解的，根据池塘的大小，基于池塘的状况、水生物种、池塘的温度和其它因素，可使用其它体积的细菌溶液和投加间隔来处理养成池，以在池塘中达到所需的有效细菌量。

可以提供多个温育器系统110、210或310以向水产养殖、农业、废水或环境修复应用提供更大量的温育的细菌溶液，实现向所述应用中添加所需的有效量，以在不同的时间或以不同速率向所述应用提供不同种类的细菌，和/或围绕应用中水源的周界隔开排放温育的细菌溶液(诸如养成池，以协助将细菌分散在整个池塘中)。可以向养成池或其它水源(如果尚未到位)加入泵或其它混合装置以协助将温育的细菌溶液(和(如果使用)硝化增强剂或表面积增强剂)分散在整个养成池或水源中。

优选将便携式现场温育器10A/10B构造为每个容器18和无焰加热器19生成单批温育的细菌溶液。可以根据需要通过使用多个系统10A或10B产生多个批次，容器18和无焰加热器19在单次使用后丢弃。

优选将现场温育器系统110、210和310构造成从比系统10A/10B使用的更大的营养萌发剂组合物/孢子组合物或营养物孢子组合物的容器温育多批温育的细菌溶液，由此在需要补充发酵剂材料之前的很长一段时间内定期间隔排放出多批细菌。根据需要定期更换或补充进料到温育器的营养萌发剂组合物/孢子组合物或营养物孢子组合物的量。处理周期优选是连续的，并且温育器全年运行(除了定期停机以维护或补充营养萌发剂组合物)。

在系统110、210或310中，在处理周期的过程中，优选每4至6小时将温育的细菌溶液20从一个或多个温育器18中排放至水产养殖、农业、废水或环境修复应用22一次。在系统10A/10B中，优选使用每个一次性容器18将单剂温育的细菌溶液20供应至水产养殖、农业、废水或环境修复应用。在处理周期中，可以通过使用多个系统10A/10B以所需的间隔(例如每4至6小时)手动提供多个剂量。根据水产养殖、农业、废水或环境修复应用的大小，池塘/水生或动物物种的状况以及物种或动物的类型，可以使用根据本发明的系统和方法的其它剂量施用间隔。剂量之间的时间可以根据需要通过改变向温育器中添加成分的时间和/或温育时间来改变。温育的细菌溶液可以更频繁地排放到更大的池塘(例如2000万加仑)或更大的农业、废水系统或环境修复场所应用。对于水产养殖、废水或环境修复处理应用，优选排放具有营养细菌(vegetative bacteria)的温育的溶液。为了获得营养细菌，优选在排入养成池之前温育至少4到6个小时，但是也可以使用更长的温育时间以使细菌有更多的繁殖时间。对于水生或农业物种的益生应用，优选温育约2至5分钟。在此类应用中，对于大型池塘或农业设施，如果需要，温育的细菌溶液20可以一天排放多次，甚至每4到6分钟一次。

优选将如下所述的各种芽孢杆菌属物种用于根据本发明的水产养殖处理方法，但是也可以使用其它细菌。例如，认为适用于本发明方法的细菌属包括以下属中的任何一个或多个物种：芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteriodes)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、明串珠菌属(Lueconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、巨球形菌属(Megasphaera)、假单胞菌属(Pseudomonas)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)。可在现场产生的益生细菌包括下列中的任一种或多种：嗜淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylophilus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、栖瘤胃拟杆菌(Bacteriodesruminocola)、栖瘤胃拟杆菌(Bacteriodes ruminocola)、猪拟杆菌(Bacterioides suis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacteriumthermophilum)、乳脂肠球菌(Enterococcus cremoris)、双醋酸乳酸肠球菌(Enterococcusdiacetylactis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、中间肠球菌(Enterococcusintermedius)、乳酸肠球菌(Enterococcus lactis)、嗜热肠球菌(Enterococcusthermophiles)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、香肠乳杆菌(Lactobacillusfarciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdennii)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilacticii)、啤酒片球菌(Pediococcus cerevisiae)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)和谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)。

对于水产养殖应用，如美国申请序列号15/907,682和美国专利号9,908,799所述的，在向养成池排放至少一剂(或是批)温育的细菌溶液时，优选同时添加一种或多种硝化增强剂。可以定期(例如按季节或根据需要)而不与每剂细菌一起添加碱度增强剂，包括碳酸钙或钙化的海藻，以减少磷酸盐。可以以高于溶解的量添加该试剂以在它们缓慢溶解时提供碱度的持续来源。缓慢溶解的碱度增强剂(例如钙化的海藻)也用作表面积改性剂，为硝化细菌生物膜的生长提供支撑表面，并且它们还有助于营养物的输送。此外，可以根据需要将仅用作表面积改性剂的试剂(如金属片或塑料片)与一批或一剂温育的细菌溶液和一种或多种碱度增强剂一起添加至养成池中以降低氮或磷，但是优选地仅添加一次且不与每剂温育的细菌溶液一起添加。这些表面增强剂相似地为所添加的细菌的生物膜的生长提供支撑表面，其有助于有利细菌更快的发展。最优选地，每7.5百万加仑的养成池添加约100磅此类硝化增强剂，并且该量可以按其它养成池体积缩放。用于硝化增强剂的优选分散方法可以包括使用至养成池中水的自动化设备或手动应用。用于播撒或以其它方式分散至少一种小球、粒料或颗粒形式的硝化增强剂的自动化或手动操作的装置是可商购的，并且是本领域技术人员众所周知的。此外，可以使用自分散添加剂系统和方法将这些硝化增强剂分散于池塘中，其采用2015年4月17日提交的美国专利申请系列号14/689,790中所描述的在水溶性封装中的泡腾材料和处理剂，其通过引用并入本文。

营养萌发剂组合物

根据本发明一个优选实施方式的营养萌发剂组合物包含一种或多种L-氨基酸、D-葡萄糖(其增加L-氨基酸对孢子外膜中其同源受体的结合亲和力并且是任选的)、D-果糖(任选的，取决于细菌种类)、为孢子萌发提供适当pH的生物缓冲剂(诸如HEPES钠盐、磷酸盐缓冲剂或Tris缓冲剂)、任选的钾离子源(诸如KCl)和工业防腐剂。在另一优选的实施方式中，营养萌发剂组合物进一步包含D-葡萄糖和D-果糖。最优选，当同时使用D-葡萄糖和D-果糖时，包括钾离子源，诸如KCl。如本领域普通技术人员可以理解的，D-果糖、D-葡萄糖和D-果糖的组合以及钾离子源的使用取决于细菌的种类。优选使用与具有相对中性pH的孢子组合物pH相容的防腐剂。根据另一优选的实施方式，营养物孢子组合物还包含一种或多种芽孢杆菌属物种的孢子以及优选的一种或多种萌发抑制剂。包含孢子的营养萌发剂组合物在本文中称为营养物孢子组合物、制剂或溶液。替代地，可以在使用点将孢子单独地添加到根据本发明的营养萌发剂组合物。当单独添加时，孢子优选是本文所述孢子组合物或孢子制剂的一部分，但是也可以使用其它可商购的孢子产品。根据另一优选的实施方式，营养萌发剂或营养物孢子组合物为浓缩形式，最优选为浓缩液体，并且在使用点稀释。

优选的L-氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-缬氨酸或L-半胱氨酸中的一种或多种。L-氨基酸可以任何合适来源的形式提供，诸如其纯净形式和/或大豆蛋白水解产物。在浓缩营养萌发剂组合物的进一步实施方式中，可以大豆蛋白的水解产物形式提供L-氨基酸。当为浓缩形式时，孢子组合物优选包含以下物质的溶液：一种或多种上述L-氨基酸，重量范围为各自约8.9至约133.5g/L，更优选约13.2至约111.25g/L并且最优选约17.8至约89g/L；D-葡萄糖(任选的)和/或D-果糖(任选的)，重量范围为各自约18至约54g/L，更优选各自约27至约45g/L并且最优选各自约30至约40g/L；KCl(任选的，作为钾离子源)，重量范围为约7.4至约22.2g/L，更优选约11.1至约18.5g/L并且最优选约14至约16g/L；生物缓冲剂，诸如磷酸二氢钠，重量范围为约10至约36g/L，更优选约15至约30g/L并且最优选约20至约24g/L，和/或磷酸氢二钠，重量范围为约30至约90g/L，更优选约21.3至约75g/L并且最优选约28.4至约60g/L。生物缓冲剂还可以10-126g/L的总量包含一种或多种磷酸盐缓冲剂。一种或多种生物缓冲剂有助于将营养萌发剂组合物保持在用于孢子萌发的适当pH下，约pH6-8。除了或替代磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲剂，孢子组合物可以包含其它磷酸盐缓冲剂、Tris碱，其重量范围为约15至约61g/L，更优选约24至约43g/L并且最优选约27至约33g/L；或HEPES缓冲剂，重量范围为约32.5至约97.5g/L，更优选约48.75至约81.25g/L并且最优选约60至约70g/L。任选地，也可以将磷酸二氢钾用作钾离子源，优选其重量范围为约13.6至约40.8g/L，更优选约20.4至约34g/L并且最优选约26至约29g/L。任选地，也可以将磷酸氢二钾用作钾离子源，优选其重量范围为约8.7至约26.1g/L，更优选约13至约21.75g/L并且最优选约16至约19g/L。根据另一优选的实施方式，可以调整KCl、磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠的量以使营养萌发剂溶液和/或营养物孢子溶液的pH可以为约6、约7或约8。

在另一优选的实施方式中，营养萌发剂组合物进一步包含一种或多种工业防腐剂，其最终(总)重量范围为0.8-3.3g/L，更优选1.2-2.7g/L，最优选1.6-2.2。防腐剂对于长期存储有益。合适的防腐剂包括NaCl、D-丙氨酸、山梨酸钾以及化学防腐剂。化学防腐剂可以是具有活性成分甲基氯异噻唑啉酮(约1.15％至约1.18％v/v)和甲基异噻唑啉酮(约0.35-0.4％v/v)的防腐剂；具有活性成分重氮烷基脲(约30％)、尼泊金甲酯(约11％)和尼泊金丙酯(约3％)的防腐剂；和仅含活性成分尼泊金甲酯的防腐剂；以及具有尼泊金甲酯、尼泊金丙酯和重氮烷基脲的其它防腐剂)。具有甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮作为活性成分的化学防腐剂的非限制性例子为Linguard ICP和KATHON^TM CG(具有包含约1.15-1.18％甲基氯异噻唑啉酮和约0.35-0.4％甲基异噻唑啉酮的活性成分)。具有重氮烷基脲、聚对羟基苯甲酸酯(polyparaben)和尼泊金甲酯作为活性成分的化学防腐剂的非限制性例子包括Germaben II。在化学防腐剂的活性成分为甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮的情况下，该化学防腐剂可以约0.8至约3.3g/L，更优选约1.2至约2.7g/L，且最优选约1.6至约2.2g/L包括在浓缩营养液中。在化学防腐剂的活性成分为重氮烷基脲、尼泊金甲酯和/或尼泊金丙酯的情况下，该化学防腐剂可以约0.3至约1％(wt/wt)包括在浓缩营养液中。在一些方面，可以包括在营养物制剂中的具有重氮烷基脲、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯的化学防腐剂的量为约10g/L。在尼泊金甲酯的情况下，包括在浓缩营养液中的防腐剂可以为约0.27至约1.89g/L，更优选约0.81至约1.35g/L，且最优选约1.0至约1.18g/L。根据另一优选的实施方式，在营养物制剂可用于产生有效用于涉及虾或其它贝类的水产养殖应用的营养物孢子制剂的情况下，防腐剂可以包括一定量的尼泊金甲酯和山梨酸钾。根据另一优选的实施方式，营养萌发剂溶液可以用于产生有效用于植物和/或废水的营养物孢子制剂，该营养物孢子制剂可以包括一定量的Linguard ICP或KATHON^TM CG。

根据又另一优选实施方式，营养萌发剂组合物可进一步任选地包含渗透保护剂化合物。在一个优选实施方式中，可以包括由某些细菌物种产生的天然渗透保护剂依克多因。浓缩营养萌发剂组合物中依克多因(任选的)的量范围可以为约0.625至约4.375g/L，更优选约1.875-3.125g/L并且最优选的量为约2-3g/L。根据另一优选的实施方式，营养萌发剂组合物可以进一步包含其它标准成分，包括但不限于有助于有效成分分散的表面活性剂、确保孢子组合物保质期的附加防腐剂、缓冲剂、稀释剂和/或营养物制剂和/或孢子制剂中通常包含的其它成分。

上述成分的量是本发明的重要方面，因为较高的浓度将使某些成分不溶，而较低浓度对孢子萌发无效。

根据另一优选的实施方式，根据本发明实施方式的营养萌发剂浓缩组合物为浓缩形式并且在使用点在萌发之前在水、孢子组合物或任何其它适当的稀释剂或它们的组合中以稀释成工作溶液，如下进一步描述。根据各个优选实施方式，可以通过使用水或其它适合的稀释剂以0.01％至50％(v/v)浓缩营养萌发剂组合物与稀释剂的比率(但也可以使用其它量)稀释根据本文优选实施方式的浓缩营养萌发剂组合物，从而制备工作营养萌发剂溶液。可以随时随地将根据本发明的浓缩营养萌发剂组合物稀释2至1X 10⁶倍或其中的任何范围或值，以产生工作营养萌发剂溶液。最优选地，稀释度在浓缩液约0.1至约10％范围内，余量为水或其它合适的稀释剂。可以基于上述稀释因子和上述浓缩量计算工作营养液(来自浓缩制剂的稀释液)中存在的上述成分的量。

浓缩营养萌发剂组合物的使用减少了运输、存储和包装的成本，并且使得在使用点处的孢子组合物的剂量施用更加容易。最优选地，浓缩营养萌发剂组合物为液体形式，其更容易且更快速地在使用点与稀释剂混合，但是也可以使用固体形式，诸如粒料或砖块或粉末。在营养萌发剂组合物中包括一般的工业防腐剂以协助长期存储。

最优选地，根据本发明的或用于本发明方法的营养萌发剂组合物中的所有成分均满足美国联邦GRAS标准。

营养物孢子组合物

根据另一优选的实施方式，该组合物是一种营养物孢子组合物，其包含预混在一起的上述用于营养萌发剂组合物的成分和孢子。

根据一个优选的实施方式，营养物孢子组合物包含处于无菌水中的益生细菌。更优选地，营养物孢子组合物进一步包含氯化钾、谷氨酸一钠、谷氨酸二钠、果糖、钙、L-丙氨酸、D-葡萄糖、钠盐中的一种或多种。还可以使用其它成分。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽胞杆菌是最优选用于该实施方式的营养物孢子组合物中的细菌，但是也可以使用其它细菌。

根据一个优选的实施方式，营养物孢子组合物优选包含按重量计10％至90％的一种或多种芽孢杆菌属孢子或孢子共混物(包含40-60％一种或多种芽孢杆菌属物种的孢子粉和60-40％盐)。根据另一优选的实施方式，营养物孢子组合物包含按重量计约5％的一种或多种芽孢杆菌属孢子或孢子共混物。营养物孢子组合物中孢子的总浓度范围可以为约1x10⁵CFU/mL或孢子/g至1x 10¹⁴CFU/mL或孢子/g或其中的任何具体浓度或范围。

营养物孢子组合物还优选包含一种或多种萌发抑制剂和/或防腐剂。用于浓缩营养物孢子组合物的优选萌发抑制剂或防腐剂包括NaCl，其具有相对较高的浓度，范围为约29至约117g/L，更优选约43至约88g/L，且最优选约52至约71g/L；和/或D-丙氨酸，其量范围为约8至约116g/L，更优选约26至约89g/L，且最优选约40至约50g/L；和/或山梨酸钾，其量范围为约1.25至约8.75g/L，更优选约3.75至约6.25g/L，且最优选约4.5至约5.5g。根据本发明的营养物孢子组合物也可以使用上述用于优选营养萌发剂组合物的其它化学防腐剂。这些萌发抑制剂或防腐剂在使用点稀释和激活之前将孢子保持在非活性状态，并防止孢子过早萌发。当将根据该实施方式的孢子组合物用于本发明的优选方法时，使用萌发抑制剂是特别优选的，其中在使用点进行萌发。在包括孢子的情况下，上述用于营养萌发剂组合物的其它成分的量(诸如L-氨基酸，生物缓冲剂等)构成孢子组合物的余量，对应于上述优选范围按比例减少。优选的营养物孢子组合物也为浓缩形式并且如上关于营养萌发剂组合物所述在使用点稀释为工作溶液，并且下文进行了进一步描述。

用于根据本发明优选实施方式的营养物孢子组合物中的优选的芽孢杆菌属孢子包括下列物种：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、巨大芽胞杆菌、凝结芽孢杆菌、慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、乳酸杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)、多粘芽孢杆菌、短小芽胞杆菌、简单芽胞杆菌(Bacillus simplex)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)。如本领域普通技术人员可以理解的，也可以使用其它芽孢杆菌属孢子种类。优选地，营养物孢子组合物包含1至20或更多个芽孢杆菌属物种，更优选3至12个芽孢杆菌属物种。根据另一优选的实施方式，营养物孢子组合物包含3株芽孢杆菌细菌，最优选2株芽孢杆菌细菌(各自可以是地衣芽孢杆菌株)和第三株是枯草芽孢杆菌属。根据另一优选的实施方式，孢子共混物中的孢子包含约80％地衣芽孢杆菌(每菌株40％)和20％枯草芽孢杆菌。

在另一优选的实施方式中，用作益生菌的营养物孢子组合物包含一种或多种天然益生的芽孢杆菌菌株，因为它们有助于分解消费者消化道中的营养物质。菌株优选产生一种或多种以下酶：水解蛋白质的水解蛋白质，水解淀粉和其它碳水化合物的淀粉酶，水解脂肪的脂肪酶，协助复杂糖中糖苷键的水解并协助纤维素的降解的糖苷酶，将纤维素降解为葡萄糖的纤维素酶，脂肪酶样酶的酯酶，和降解木聚糖(一种在植物细胞壁中发现的多糖)的木聚糖酶。产生这些酶的芽孢杆菌属菌株是本领域众所周知的。

根据另一优选的实施方式，营养物孢子组合物为浓缩形式并且在使用点进行萌发之前使用水或任何其它适合的稀释剂或其组合稀释为工作溶液，如下进一步描述。根据各个优选实施方式，可以使用水或其它适合稀释剂以0.01％至50％(v/v)浓缩营养萌发剂组合物与稀释剂的比率(但也可以使用其它量)稀释根据本文优选实施方式的浓缩营养物孢子组合物，以制备工作营养物孢子溶液。可以随时随地将根据本发明的浓缩营养物孢子组合物稀释2至1X 10¹³倍或其中的任何范围或值以生产工作营养萌发溶液。最优选地，稀释度范围为约0.1至约10％的浓缩物和余量为水或其它适合稀释剂。可以基于上述稀释因子和浓缩量计算工作营养液(浓缩制剂的稀释溶液)中存在的上述成分(诸如L-氨基酸和萌发抑制剂)的量。

最优选地，根据本发明或用于本发明方法的营养物孢子组合物中的所有成分均符合美国联邦GRAS标准。

孢子组合物

根据本发明一个优选实施方式的益生菌孢子组合物包含一种或多种细菌物种、任选的表面活性剂、增稠剂和充当防腐剂的任选的一种或多种酸化剂、酸或酸的盐。根据另一优选的实施方式，在增稠剂不是益生元的程度上或除了是益生元的任何增稠剂之外，孢子组合物进一步包含一种或多种益生元。根据另一优选的实施方式，孢子组合物进一步包含一种或多种水活度降低剂。最优选地，根据本发明的孢子组合物包含各种悬浮的益生菌孢子物种，如下更详细的描述。使用孢子形式的这些物种增加了在水产养殖应用场所附近可能遇到的恶劣环境条件下益生菌的稳定性。孢子组合物中孢子的总浓度范围可以为约1x10⁵CFU/mL或孢子/g至1x 10¹⁴CFU/mL或孢子/g或其中的任何具体浓度或范围。

根据优选实施方式的孢子组合物中包括适合的增稠剂。增稠剂优选为在非气候控制的水产养殖环境中通常出现的变化温度下不会分离或降解的增稠剂。增稠剂有助于稳定悬浮液，以便细菌混合物保持均匀并分散在一定体积的孢子组合物中，不会从悬浮液中沉降出来。当用于根据本文所述本发明优选实施方式的温育系统和水产养殖处理方法中时，这确保了益生菌物质的浓度均匀地分布在整个容器中，使得在整个处理周期中，递送至温育器的孢子剂量保持一致或相对一致(取决于所用的具体递送方法和控制机制)。

最优选的增稠剂是黄原胶，其是由葡萄糖的五糖重复单元、甘露糖和葡萄糖醛酸和已知的益生元组成的多糖。与其它一些胶不同，黄原胶在宽范围的温度和pH内都非常稳定。另一种优选的增稠剂是阿拉伯胶，它也是已知的益生元。其它优选的增稠剂包括刺槐豆胶、瓜尔豆胶和阿拉伯胶，它们也被认为是益生元。除了益生元的益处外，这些纤维不与矿物质和维生素结合，因此不限制或干扰它们的吸收，并且甚至可以改善水生生物对某些矿物质(例如钙)的吸收。也可以使用不被视为益生元的其它增稠剂。

优选的实施方式可以任选地包括一种或多种益生元，如果所用的增稠剂不是益生元，则优选使用，但也可以在益生元增稠剂之外使用。益生元被分为二糖、低聚糖和多糖，并且可以包括菊粉、低聚果糖、果糖-低聚糖(FOS)、半乳糖-低聚糖(GOS)、反式半乳糖-低聚糖(TOS)和短链果糖-低聚糖(scFOS)、大豆果糖-低聚糖(soyFOS)、葡萄糖-低聚糖、葡萄糖-低聚糖、乳糖醇、麦芽糖-低聚糖、木糖-低聚糖、水苏糖、乳果糖、棉子糖。甘露低聚糖(MOS)是可能不富含益生细菌群的益生元，但会结合并去除肠道中的病原体，并且被认为刺激免疫系统。

优选的实施方式还优选包括一种或多种酸化剂、酸或酸的盐以充当防腐剂或用于酸化孢子组合物。优选的防腐剂是乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸、丙酸钠、丙酸钙、甲酸、甲酸钠、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾和山梨酸钙。还可以使用其它已知的防腐剂，优选通常被认为是安全的(GRAS)食品防腐剂。优选地，孢子组合物的pH为约4.0至7.0。更优选地，其为约4.0至5.5且最优选约4.5，以在使用或添加至温育器中之前防止孢子的过早萌发，如下所述。降低孢子组合物的pH还可对酵母、霉菌和病原菌具有抗菌活性。

根据任一优选实施方式的孢子组合物任选地包括一种或多种水活度降低剂，诸如氯化钠、氯化钾或玉米糖浆(70％玉米糖浆溶液)。水活度降低剂有助于抑制微生物生长，以便孢子组合物在被温育以排放到水产养殖、农业、废水或环境修复应用的使用点或消耗的时间之前的存储时，细菌孢子不会过早萌发。它们还有助于抑制污染微生物的生长。

任选的表面活性剂优选为一种被动物安全摄取的表面活性剂，但是其它表面活性剂可以用于其它应用，诸如递送至植物。最优选地，表面活性剂聚山梨醇酯80。尽管任一实施方式可以使用任何GRAS或AAFCO批准的表面活性剂或乳化剂，但存在某些动物可能不能很好地耐受所有批准的表面活性剂的担心。由于通过使用增稠剂也可以实现表面活性剂在稳定悬浮液以使细菌混合物保持均质且不会沉降出来的益处，因此没有必要添加表面活性剂。如果在根据本第二实施方式的孢子组合物中使用表面活性剂，优选以与第一实施方式中大致相同的重量百分比范围使用。

用于根据本发明的孢子组合物的优选细菌与上文为优选营养物孢子组合物描述的那些相同。最优选地，孢子组合物中使用的细菌种类是芽孢杆菌属的一个或多个物种。益生细菌的最优选物种包括以下：短小芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌(Bacillus mesentericus)、变种纳豆枯草芽孢杆菌、或多云芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)，但也可以使用在使用国家批准为益生菌的任何芽孢杆菌物种。优选细菌为孢子形式，因为孢子形式对于环境波动(诸如环境温度变化)更稳定。最优选地，在根据本发明的孢子组合物中使用的孢子是包含约40-60％盐(食盐)和60-40％细菌孢子的干粉共混物。孢子优选从液体发酵浓缩物喷雾干燥。盐用于将纯喷雾干燥的孢子粉稀释至最终孢子粉共混物中的标准孢子数。在生产发酵过程中，不同的芽孢杆菌菌株会以不同的速率生长，从而导致发酵批液的最终计数数目不同。将发酵液离心以将孢子浓缩在液中。然后，将浓缩液喷雾干燥，得到仅含有芽孢杆菌孢子的粉末。在喷雾干燥的芽孢杆菌孢子粉中添加盐有助于标准化批次之间每克孢子的共混计数。也可以使用其它形式的细菌孢子或孢子共混物。最优选地，将干燥的孢子共混物与孢子组合物中使用的一部分水预混合，约占总水量的3-30％，并将所得的细菌孢子溶液添加到其它成分中，包括剩余的水。这有助于将细菌孢子分散在整个孢子组合物中。

根据本发明第一优选实施方式的益生菌孢子组合物优选包含提供10⁸cfu/ml孢子悬浮液(最优选约1.0X 10⁸至约3.0X 10⁸cfu/ml孢子组合物，当稀释于水产养殖、农业、废水或环境修复应用中的水中时，其提供大约10¹至104cfu/ml应用水)的细菌孢子、0.00005至3.0％的表面活性剂和0.002至5.0％的增稠剂以及任选地约0.01至2.0％一种或多种酸或酸的盐作为防腐剂，所有百分比均以孢子组合物的重量计。根据本发明另一优选实施方式的益生菌孢子组合物包含提供10⁹cfu/ml孢子悬浮液(其当在池塘水中稀释时提供约10¹至10⁴cfu/ml池塘水)的细菌孢子、约0.1至5.0％增稠剂(优选也充当益生元的增稠剂)、约0.05-0.5％一种或多种防腐剂、任选的约0.1-20％一种或多种水活度降低剂以及任选的0.1-20％一种或多种酸化剂，所有百分比均以组合物的重量计。两个优选实施方式中的孢子组合物的余量均为水并且本文中的百分比是重量百分比。优选使用去离子水或蒸馏水以去除盐分或外部细菌，但也可以使用自来水或其它水源。

根据另一优选的实施方式，孢子组合物包含：约1％至10％的细菌孢子共混物，该细菌孢子共混物含有盐以及孢子形式的短小芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌、变种纳豆枯草芽孢杆菌或多云芽孢杆菌中的一种或多种；总计约0.3％至1％的一种或多种酸或酸的盐；约0.2％至0.5％的增稠剂；约0.1-0.3％的氯化钠、氯化钾或它们的组合；约0.00005％至3.0％的表面活性剂；和86.2％至98.4％的水。根据另一优选的实施方式，孢子组合物包含：约0.01％至10％的细菌孢子共混物；约0.1-0.33％山梨酸、其盐或它们的组合；约0.1-0.34％柠檬酸、其盐或它们的组合；约0.1-0.33％苯甲酸、其盐或它们的组合；约0.2-0.5％黄原胶；约0.00005％至3.0％的表面活性剂；和约0.1-0.3％的氯化钠、氯化钾或它们的组合，所有百分比均以组合物的重量计。根据又另一优选实施方式，孢子组合物包含：约5％的细菌孢子或孢子共混物；约0.25％的增稠剂；总计约0.3％的一种或多种酸或酸的盐；约0.1％的表面活性剂；约0.2％的氯化钠、氯化钾或它们的组合(除了孢子共混物中的任何盐之外)；和水。根据另一优选的实施方式，酸或酸的盐是山梨酸钾、苯甲酸钠和无水柠檬酸中的一种或多种。

制备了根据本发明优选实施方式的益生菌孢子组合物的几个实例并测试了不同参数。下表1示出了这些孢子组合物。

表1

每种孢子组合物的余量为水(在这些实例中为约1L)。除了孢子组合物编号1使用自来水之外，每种孢子组合物均使用去离子水。所示的百分比是重量百分比。每个制剂的目标pH都在约4.0至5.5之间，但发现某些制剂的实际pH值远低于预期。制剂编号1的目标pH在5.0到5.5之间，但其实际pH为约2.1-2.3，这太低，可能对孢子有害，会造成包装的稳定性问题，并且受更严格的运输法规约束。制剂编号1也表现出弱增稠。制剂编号2与编号1相同，区别在于水源不同。制剂编号2的实际pH为约2.2-2.3并且也表现出弱增稠。降低了制剂编号3中的酸及酸的盐的量以提高pH并且确定在使用与编号1和编号2相同量的增稠剂时稠度是否有所改善。虽然制剂编号3相对于编号1和2有所改善，但是其仍然表现出弱增稠并且其实际pH为6.6，超过目标值范围。向制剂编号4中添加了额外的酸以降低pH并且添加了额外的增稠剂。制剂编号4具有改善的增稠，但进一步改善增稠将是有益的。制剂编号5中的酸量大幅增加，这导致实际pH为约1.0。制剂编号6中的酸量降低并且增稠剂增加，这导致孢子组合物太稠而无法滴落。制剂编号7增加了增稠剂和水活度降低剂的量，但出现了苯甲酸和山梨酸混合的问题。制剂编号8中去除了苯甲酸和山梨酸。制剂编号1-7提供了2X 10¹¹cfu/gm且编号8提供了1X 10¹¹cfu/gm的细菌孢子。这些样品制剂中，编号8是最优选的，因为其表现出了充足的增稠并且具有约4.5+/-0.2的实际pH，并且使用更少的孢子共混物。

优选的是，根据本发明优选实施方式的孢子组合物使用约0.01％至约0.3％的细菌孢子共混物且更优选约0.03％至0.1％的细菌孢子共混物。降低孢子共混物的用量会大幅降低孢子组合物的成本。取决于最终用途应用，可以在根据本发明的孢子组合物中使用不同量的孢子共混物。例如，在用于鸡的孢子组合物中可以使用较小百分比的孢子共混物，而在用于猪的孢子组合物中则使用较大的百分比。

测试了制剂编号8的孢子组合物在不同温度下的保质期。将制剂编号8的样品密封在塑料袋中，诸如如下所述的优选递送系统中使用的塑料袋，并且在约4-8℃(39-46°F)、30℃(86°F)和35℃(95°F)的温度下存储两个月以模拟益生菌孢子组合物可能在农业环境中存储和使用的典型温度范围。在储存期的第一个月末，观察并测试了每个样品。所有三个样品的pH均为约4.5，并且三个样品中的任何一个都没有沉降、分层或外观变化，表明在存储期间细菌孢子保持悬浮并分散在整个孢子组合物中。所有样品均不含任何真菌污染或革兰氏阴性细菌污染。在时间计数为零(最初存储样品时)时，每个样品含有的细菌孢子为约2.12X 10⁸cfu/mL。在一个月的存储期结束时，样品含有的细菌孢子为约2.09X 10⁸cfu/mL孢子悬浮液(最低温度样品)、1.99X 10⁸cfu/mL(中温样品)和2.15 10⁸cfu/mL(高温样品)。在不同的样品中，尤其是在增稠的样品中，细菌计数稍有变化；但是，这些被认为是可比计数。存储两个月后再次测试了每个样品。样品含有的细菌孢子为约2.08X 10⁸cfu/ml(最低温度样品)；2.01X 10⁸cfu/ml(中温样品)；和2.0X 10⁸cfu/ml(高温样品)。目标保质期为约2X10⁸cfu/ml孢子悬浮液，因此样品在存储两个月后均处于目标保质期内。这些测试结果表明，根据本发明优选实施方式的益生菌孢子组合物在一定温度范围内是稳定的，所述细菌孢子在整个孢子组合物中保持存活、悬浮和分散。在每个样品制剂中使用的孢子共混物(40-60％孢子粉和60-40％盐)是相同的，提供至少约2X 10¹¹个孢子/克。共混物中的孢子种类是多种枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌株。在添加到其它成分之前，通过搅拌将孢子共混物粉末与100mL水预混合30分钟。与水预混合有助于将孢子共混物与其它成分混合和将孢子分散在整个孢子组合物中。

尽管根据本发明的优选孢子组合物，优选使用包含一种或多种芽孢杆菌属物种的益生菌孢子组合物，但本发明的方法可以使用包含其它细菌属和其它物种的孢子组合物。例如，以下属中的一个或多个物种：芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、片球菌属、肠球菌属、乳杆菌属和丙酸杆菌属(包括短小芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、马铃薯芽孢杆菌、变种纳豆枯草芽孢杆菌、或多云芽孢杆菌栖瘤胃拟杆菌、栖瘤胃拟杆菌、猪拟杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两岐双岐杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、乳酸片球菌、啤酒片球菌、戊糖片球菌、乳脂肠球菌、双醋酸乳酸肠、屎肠球菌、中间肠球菌、乳酸肠球菌、嗜热肠球菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、香肠乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、产丙酸丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌、谢氏丙酸杆菌)和/或一个或多个以下物种：肠膜明串珠菌、埃氏巨型球菌可以用于本发明的组合物和方法。

孢子组合物也可以为浓缩形式，使用较少的水，并按比例增加上述其它成分的量。此种浓缩孢子组合物在萌发之前可以在使用点用营养萌发剂组合物、水、其它合适的稀释剂或它们的组合稀释。最优选地，根据本发明优选实施方式的或用于本发明的优选方法的孢子组合物中的所有成分均符合美国联邦GRAS标准。

萌发的方法

根据一个优选的实施方式，根据本发明的在使用点萌发孢子的方法包括：提供营养物和孢子(优选提供营养萌发剂组合物和孢子组合物或者提供根据本发明的营养物孢子组合物，但是可以使用一起或分开含有孢子和营养物的其它可商购的产品)，在消耗点附近的使用点位置使用无焰加热器将它们加热至升高的温度或温度范围，和将它们在该温度或该范围内保持一段时间(温育期)以进行萌发。温育期的加热是在单一步骤中进行的并且将营养物和孢子一起加热。该方法还优选包含将萌发的孢子分散至水产养殖、农业、废水或环境修复应用的步骤，如先前所讨论。优选地，使用由放热化学反应供应的热量将营养萌发剂组合物和孢子组合物(或营养物孢子组合物)加热至温度范围38℃至约90℃，更优选35-55℃，甚至更优选范围38-50℃或38-60℃，并且最优选范围41℃至44℃。温育期可以根据最终用途应用而变化。对于益生菌应用，其中具有消化系统的水生物种(例如鱼或鳗鱼)会摄入细菌，优选温育期持续不超过10分钟。最优选地，在益生菌应用中，温育期为2-5分钟。以这种方式，在孢子完全萌发之前将孢子释放至水产养殖或农业中，由此孢子更有机会生存下来进入摄入物种的肠道，在肠道中它们是最有益的。为了在水产养殖应用(诸如可以使用虾类水产养殖应用来进行)或废水应用中处理水，优选的温育时间为至少一小时以使孢子在排入到水中之前完全萌发，更优选4至6小时，以使细胞在排入水中之前变得营养。最优选地，将优选根据本文讨论的本发明实施方式的营养萌发剂组合物和孢子组合物(或营养物孢子组合物)添加至温育器中，以在上述优选的温度范围和持续时间下温育孢子，从而生产出细菌处于营养状态的细菌溶液。温育优选在使用无焰加热器加热至所需范围内且含有营养萌发剂组合物和孢子的容器、罐或储器中进行。然后如先前所讨论的，将细菌溶液排入到水产养殖应用。如果使用浓缩营养萌发剂组合物，优选将稀释水与该营养萌发剂组合物一起加入到温育器中。

根据本发明的优选方法测试了根据本发明优选实施方式的各种营养萌发剂组合物。以下描述了所述组合物、方法和结果。

实施例1–为了萌发孢子，将FreeFlow LF-88益生菌(从NCH Corporation商购的孢子液体制剂)加入到1mL自来水中，最终浓度为约1x 10⁹CFU/mL，其中CFU代表菌落形成单位。将根据本发明优选实施方式的包含L-丙氨酸(89g/L)、磷酸二氢钠(20g/L)、磷酸氢二钠(60g/L)和Linguard CP(共1.6g/L)的营养萌发剂浓缩组合物添加到水和细菌的混合物中，提供按混合物的总重量计为4％的营养萌发剂组合物最终浓度。为了比较，使用相同量的FreeFlow LF-88益生菌和水但不添加营养萌发剂浓缩组合物来制备阴性对照反应。在设定为42℃的预温育加热块中或在环境室温(约23℃)下，将两种混合物(萌发剂和不具有营养萌发剂组合物的阴性对照)共混并且温育60分钟。

使用相差显微镜观察每个反应的孢子。使用标准程序准备载玻片。在OlympusBX41显微镜(100X油浸物镜)上观察孢子并且使用由cellSens Dimension软件包控制的Olympus UC30相机成像。

拍摄图像并将萌发的孢子计为视野中总孢子的百分比。针对每种情况(测试混合物)分析了总共10张代表性图像。萌发的孢子由于水的流入而失去了其折射性并且是相暗的(phase-dark)，而未萌发的孢子则是相亮的(phase-bright)。

图5显示了这些测试的代表性图像。图像A代表已根据本发明的优选孢子组合物和优选方法，使用营养萌发剂组合物且在温育期在42℃下加热而萌发的孢子。较暗的斑点显示萌发的孢子，较浅的斑点显示未萌发的孢子。图像B代表已使用根据本发明优选实施方式的营养萌发剂组合物但在环境温度(23℃)下温育而萌发的孢子。图像C-D代表未使用根据本发明的营养萌发剂组合物处理的对照孢子，一个已在42℃下温育和一个在环境温度(23℃)下温育。

如从图5可以看出，“A”图像显示的萌发的孢子(暗点)比其它图像要显著更多。使用根据本发明优选实施方式的营养萌发剂组合物与根据本发明优选实施方式的萌发方法温育的孢子显示出的表观萌发效率为96.8％(实施例1，图5A)。使用根据本发明优选实施方式的营养萌发剂组合物但未使用根据本发明优选实施方式的萌发方法温育的对照孢子显示的表观萌发效率为2.3％(实施例1，图5B)。类似地，未使用根据本发明的营养萌发剂组合物温育的孢子显示的42℃和23℃的表观活化效率分别为1.2％和2.6％(实施例1，图5C和图5D)。未通过本方法优选实施方式处理的样品中的萌发孢子占FreeFlow LF-88益生菌溶液中已萌发的孢子的很小百分比。本实施例表明，当同时使用根据本发明优选实施方式的营养萌发剂组合物和温育方法时，孢子萌发显著增加。

实施例2-使用与上述实施例1所述相同的测试混合物/温育方法(使用相同的营养萌发剂组合物并且加热温育，“处理的孢子，42℃”)和对照混合物/温育方法(无营养萌发剂组合物且不加热，“未处理的孢子，23℃”)重复进行了另一组温育测试，但进行了不同的测试以比较相对于对照混合物，根据本发明优选实施方式的测试混合物的功效。此外，测试了两种其它混合物–一个测试使用实施例1的营养萌发剂组合物但未加热(“处理的孢子，23℃”)，且另一个测试未使用营养萌发剂但加热孢子(“未处理的孢子，42℃”)。简言之，在使用或不使用优选营养萌发剂组合物处理的条件下将孢子在42℃或23℃下温育1小时。温育之后，将1mL每个反应的孢子在23℃下以14K RPM粒料化3分钟，然后重悬于1mLButterfield缓冲液中。将约6x 10⁵CFU(0.02mL)加入到0.980mL具有过量D-丙氨酸的Davis基本温育基(含有3％葡萄糖作为碳源和微量元素)中。D-丙氨酸是L-氨基酸介导的萌发的有效抑制剂。

将约1.2x 10⁵CFU加入到PreSens OxoPlate的4个孔的每个孔中。PreSensOxoPlate使用光学氧气传感器用两对滤波器对(激发：540nm，发射：650nm和激发：540，发射：590nm)来荧光测量样品中的氧含量。按照制造商的描述进行对照，并在BioTek 800FLx荧光读板仪上进行测量。在持续摇晃的条件下，在37℃下每10分钟记录一次时间点，持续24小时，并使用以下公式处理数据以确定氧分压(pO₂)：

pO₂＝100*[(K₀/IR)-1(K₀/K₁₀₀)-1]

已经萌发并持续分裂并且生长为营养细胞的孢子消耗氧气作为其代谢生长的一部分。氧气消耗以pO₂的下降表示。可推测，观察到的生长是由于本发明萌发的孢子的成长和营养生长所致。图6中示出了这些测试的pO₂水平。

如图6所示，与未根据本发明优选实施方式处理或加热的对照孢子混合物相比，或与使用营养萌发剂组合物处理或加热但未同时进行的对照孢子混合物相比，使用根据本发明优选实施方式的测试混合物和方法的温育(处理孢子42℃，使用营养萌发剂组合物和加热)产生了快了4小时开始营养生长的孢子。在对照实验中观察到的生长大概占FreeFlowLF-88益生菌中存在的萌发孢子的约2％(参见实施例1)。本实施例进一步表明，当使用根据本发明优选实施方式的营养萌发剂组合物和温育方法时，孢子萌发显著增加。

实施例3-使用与上述实施例1中所述相似的测试和对照混合物以及温育方法进行了另一组温育测试。简言之，将LF-88加入到10mL蒸馏水中，最终浓度为约10⁸CFU/mL。在各种温度下温育样品，以显示与对照混合物相比，根据本发明优选实施方式的测试方法的功效。使用实施例1中所述的营养萌发剂组合物准备反应(图7中的“处理的孢子”)并且在23℃(环境温度，不加热)、32℃、42℃或60℃下温育。不使用营养萌发剂组合物在环境室温下温育对照反应。温育1小时之后，在23℃下将1mL每种反应在14K RPM下粒料化3分钟，并且重悬浮于Butterfield缓冲液中。将约6x 10⁵CFU(0.02mL)加入到0.980mL具有过量D-丙氨酸的Davis基本温育基(含有3％葡萄糖作为碳源和微量元素)中。

将约1.2x 10⁵CFU加入到PreSens OxoPlate的4个孔的每一个中。按照制造商的描述进行对照，并且在BioTek 800FLx荧光读板仪上使用两对滤波器对(激发：540nm，发射：650nm和激发：540，发射：590nm)进行测量。在持续摇晃的条件下，在37℃下每10分钟记录一次时间点，持续24小时，并且处理数据以确定氧分压(pO₂)。图7示出了这些测试的pO₂水平。

如图7所示，使用根据本发明优选实施方式的营养萌发剂组合物和加热的温育产生比对照早数小时开始营养生长的孢子。使用营养萌发剂组合物处理但未加热的孢子与对照混合物相当。在低于根据本发明一个实施方式优选范围35-55℃的温度下温育的使用营养萌发剂组合物处理的孢子(由“处理的孢子32℃”曲线表示)比对照实验更快速地开始营养生长，但不如在根据本发明优选范围内的高温下处理的孢子快。使用营养萌发剂组合物并且在根据本发明实施方式的最优选范围41℃至44℃的温度下温育的孢子显示了最佳结果，其首先开始营养生长并且比对照快了4小时开始生长。如在先前实施例中所看到的，在未处理对照实验中看到的生长大概占FreeFlow LF-88益生菌中存在的萌发孢子的约2％(参见实施例1)。本实施例进一步表明，当使用根据本发明优选实施方式的营养萌发剂组合物和温育方法时，孢子萌发显著增加。

根据其它优选实施方式，一种向水产养殖、农业、废水或环境修复应用中使用的水中添加细菌的方法，包括：(1)提供一定体积的营养萌发剂组合物和一定体积的包含孢子形式的至少一个物种的细菌，它们可以预混合在一起作为营养物孢子组合物或是分开的；(2)如果分开，任选地将一部分营养萌发剂组合物和一部分细菌混合以形成营养物孢子组合物；(3)在无焰加热器中引发放热化学反应；(4)利用放热反应产生的热量，在水产养殖应用场所或附近，将营养物孢子组合物的至少一部分加热至约35℃至60℃范围内的温度；(5)将温度在所述范围内保持约2分钟至约6小时的温育期，以形成一批温育的细菌溶液；和(6)将温育的细菌溶液排放到水产养殖、农业、废水或环境修复应用。最优选地，通过向与水、空气或第二化学品放热反应的第一化学品中添加水、空气或第二化学品来引发步骤(3)中的放热反应，并且第一化学品是镁5原子重量百分比的铁超腐蚀合金(magnesium 5atomicweight percent iron supercorroding alloy)并且放热反应是通过添加水引发的。最优选地，营养萌发剂组合物在第一密封包中且孢子组合物在第二密封包中或者营养萌发剂组合物和孢子组合物预混合在一起作为营养物孢子组合物在第三密封包中，并且所述方法进一步包括：(7)如果营养萌发剂组合物和孢子组合物没有预混，提供密封型混合容器；(8)提供经构造用于容纳无焰加热器和混合容器或第三密封包的温育容器；(9)如果营养萌发剂组合物和孢子组合物没有预混，将第一密封包和第二密封包的内容物排空(emptying，倒出)到混合容器中，并且密封混合容器；(10)在放热反应之前或期间，将(a)第三包放入温育容器，如果其尚未处于温育容器内，或(b)将混合容器放入温育容器内；并且其中，排放步骤包含取出第三密封包或密封的混合容器，打开第三包或混合容器，并且手动将温育的细菌溶液应用于水产养殖、农业、废水或环境修复应用。

优选地，这些实施方式中使用的细菌包含以下属中的一种或多种：芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、巨球形菌属、假单胞菌属和丙酸杆菌属。更优选地，细菌是地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中的一个或多个物种，或者其中细菌是选自由以下组成的组的益生细菌：嗜淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、栖瘤胃拟杆菌、栖瘤胃拟杆菌、猪拟杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两岐双岐杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、乳脂肠球菌、双醋酸乳酸肠球菌、屎肠球菌、中间肠球菌、乳酸肠球菌、嗜热肠球菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、香肠乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、肠膜明串珠菌、埃氏巨型球菌、乳酸片球菌、啤酒片球菌、戊糖片球菌、产丙酸丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌和谢氏丙酸杆菌。

优选地，这些实施方式中的营养萌发剂组合物或预混营养物孢子组合物包含：L-氨基酸；包含磷酸盐缓冲剂、HEPES、Tris碱或它们的组合的一种或多种缓冲剂；工业防腐剂；任选的D-葡萄糖，或任选的D-果糖，或任选的D-葡萄糖和D-果糖；和任选的钾离子源。更优选地，营养萌发剂组合物或预混营养物孢子组合物包含总计约17.8g/L至89g/L的L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、大豆蛋白的水解产物或它们的组合中的一种或多种。此外，这些实施方式中的预混营养物孢子组合物进一步包含芽孢杆菌属物种的孢子以及包含氯化钠、D-丙氨酸或它们的组合的萌发抑制剂或防腐剂。优选地，这些实施方式中使用的营养萌发剂组合物或(如果预混)营养物孢子组合物是浓缩液，包含：约8.9-133.5g/L的一种或多种L-氨基酸；总计约0.8-3.3g/L的一种或多种工业防腐剂；总计约40-126的一种或多种磷酸盐缓冲剂，约15-61g/L Tris碱，或约32.5-97.5g/L HEPES，或它们的组合；任选的约18-54g/L的D-葡萄糖、D-果糖或它们的组合；任选的约7.4-22.2g/L的KCl；和任选的孢子形式的一种或多种细菌物种。优选地，这些实施方式中使用的孢子组合物包含：孢子形式的一种或多种芽孢杆菌属物种；按重量计约0.002至5.0％增稠剂；按重量计总计约0.01至2.0％的一种或多种酸或酸的盐；和任选的按重量计约0.00005至3.0％的表面活性剂，其中百分比以孢子组合物的重量计。更优选地，孢子组合物的pH为约4.5至约5.5和/或酸或酸的盐是乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸、丙酸钠、丙酸钙、甲酸、甲酸钠、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾或山梨酸钙中的一种或多种。还更优选地，孢子组合物包含：按重量计约0.002至5.0％的增稠剂；按重量计总计约0.01至2.0％的一种或多种酸或酸的盐；和任选的按重量计约0.00005至3.0％的表面活性剂。

根据其它优选的实施方式，一种用于产生在水产养殖、农业、废水或环境修复应用中使用的温育的细菌溶液的系统，包含：(1)具有一定体积营养萌发剂组合物的第一容器和具有一定体积孢子组合物的第二容器和用于混合至少一部分来自第一容器的营养萌发剂组合物与至少一部分来自第二容器的孢子组合物的第三容器，或(2)具有预混的营养物孢子组合物的第四容器；和设置在第三容器或第四容器附近的无焰加热器，该无焰加热器包含与第二化学品、水或空气放热反应的第一化学品，该放热反应将第三容器或第四容器的内容物加热至约35℃至90℃范围内的温度一定温育期，以产生温育的孢子溶液。优选地，系统进一步包含经构造用于容纳无焰加热器和第三容器或第四容器的第五容器；并且其中(1)第一和第二容器是密封包并且第三容器是密封型的，或者(2)第四容器是密封包。最优选地，第五容器包含指示向第五容器加水的填充线的标记和/或分隔器(divider，分隔物，隔板)和/或由透明材料制成，分隔器形成用于容纳无焰加热器的第一部分和用于容纳密封的第三容器或第四包的第二部分，以使无焰加热器不直接接触密封的第三容器或第四包。优选地，第三容器或第四包由绝缘材料制成和/或第五容器的分隔器由绝缘材料制成。优选地，温育期为约2分钟至6小时。优选地，这些实施方式中的无焰加热器进一步包含含有第一化学品的透水透气袋或者具有第一和第二部分的分隔袋或者包含在第二袋内的第一袋；其中第一部分或第一袋含有第一化学品并且第二部分或第二袋含有第二化学品。优选地，这些实施方式中的第五容器用真空密封件(seal，密封圈)密封或者填充有非反应性气体，并且当打开第五容器时，第一化学品与空气反应。

本文优选实施方式的任何成分、特征或步骤可以与其它实施方式的任何其它成分、特征或步骤一起使用，即使没有对所述实施方式进行具体描述也是如此。本文表示为范围的成分的所有量或成分的比率包括所述范围内的各个单个量或比率以及所述范围内的任何和所有子集组合，包括从一个优选范围重叠至更优选范围的子集，即使所述范围的具体子集在本文中未进行具体描述也是如此。本文任何特定优选实施方式中描述为包括或排除的任何成分或成分的量可以类似地被本文任何其它优选实施方式包括或排除，即使未进行此类实施方式的具体描述也是如此。在阅读本说明书和本文优选实施方式的描述后，本领域普通技术人员还将理解，可以在本发明的范围内对所述方法以及营养萌发剂和孢子组合物进行修改和变更，并且意图是本文公开的本发明的范围仅受发明人依法享有的所附权利要求的最宽泛解释的限制。