一种网隙裂粉韧革菌培养基及其培养方法
阅读说明：本技术 一种网隙裂粉韧革菌培养基及其培养方法 (Megapes cracking powder phlobacterium culture medium and culture method thereof ) 是由 王丽霞 任利利 骆有庆 王明 詹钟易 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种网隙裂粉韧革菌培养基及其培养方法。所述培养基包括健康松树木粉、麦芽浸膏和酵母膏。本发明提供的网隙裂粉韧革菌培养基的成分和配比科学合理,培养网隙裂粉韧革菌的生长速度更快,部分能长出子实体,且不容易被污染,为松树蜂共生菌的进一步研究甚至是松树蜂的防治奠定了基础。(The invention provides a culture medium for netowrk crack powder phloem and a culture method thereof. The culture medium comprises healthy pine wood powder, malt extract and yeast extract. The culture medium for the phloem with the crack powder in the net gaps is scientific and reasonable in components and proportion, the phloem with the crack powder in the net gaps is cultured at a higher growth speed, sporophores can grow out partially, the phloem is not easy to pollute, and a foundation is laid for further research on symbiotic bacteria of pine bees and even prevention and treatment of the pine bees.)
技术领域
本发明涉及微生物
技术领域
，尤其涉及一种网隙裂粉韧革菌培养基及其培养方法。背景技术
松树蜂Sirex noctilio Fabricius属膜翅目(Hymenoptera)树蜂科(Siricidae)树蜂属(Sirex)，为毁灭性的国际林业检疫害虫，在我国，目前该虫已知寄主树种为樟子松(Pinus sylvestris var.mongolica Litv.)。松树蜂除直接钻蛀树木外，还能通过产卵行为将自身分泌的毒素和体内的共生真菌一起注入寄主树木体内，“虫-毒素-菌”三个致害因子相互协调，共同危害寄主树木，造成寄主树木树势衰弱甚至死亡。
松树蜂的共生菌主要是一种白腐真菌，种名为网隙裂粉韧革菌(Amylostereumareolatum)，属担子菌门(Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes)，红菇目(Russulales)，韧革菌科(Stereaceae)，淀粉韧革菌属(Amylostereum)。所谓白腐真菌是指一类具有相同腐朽方式的木材腐朽真菌。木材腐朽真菌主要有两种不同的腐朽方式，即褐腐和白腐。褐腐真菌能通过自身分泌的一系列水解酶去除木材的纤维素，但很难降解其木质素，被褐腐真菌感染过的木材呈现褐色块状，且柔软易碎；而白腐真菌主要降解木材的木质素，同时也能有选择性的降解部分纤维素(不同的白腐真菌降解纤维素的能力差异较大)，经其腐烛后的木材呈线状或纤维状，如同被“漂白”一般。白腐真菌主要凭借其菌丝强大的穿透能力，特别是依靠自身分泌的一系列胞外酶的降解作用而实现对寄主树木中营养的汲取。白腐菌经长期的生物进化，形成了由木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶构成的木质素降解酶系，在整个碳循环中，白腐菌是能将木质素降解成CO2和H2O的一类真菌。松树蜂共生菌作为一种白腐真菌，在和松树蜂共同危害寄主树木的过程中起着降解寄主木质纤维素等大分子物质和破坏树体内部结构的重要作用。
共生菌在松树蜂危害寄主树木时起到了不可或缺的作用，如保证卵的孵化以及为幼虫的生长创造必要的营养条件和活动空间等。共生菌随着松树蜂产卵进入寄主体内后，能够造成邻近的寄主细胞迅速失水，导致寄主细胞死亡，形成一定范围的干燥区域，为菌丝的生长创造合适的环境。有的研究结果表明松树蜂可直接食用真菌，其中肠分泌物可消化菌丝。有的研究则认为真菌在幼虫生长中的作用依其发育程度而变，低龄幼虫时期，松树蜂幼虫需取食真菌菌丝获得营养；而高龄幼虫则可以取食被真菌侵染后的木质部。也有研究指出，共生真菌可辅助树蜂在体外“消化”木质纤维物质成为淀粉和还原性糖类以供幼虫吸收。此外，研究表明，在室内试验中，松树蜂雌性成虫对于共生菌的趋性明显高于植物源的引诱剂。因此，有人猜测，共生菌对于松树蜂的寄主定位有极大的影响，对共生菌的研究显得更为重要。
现有研究结果表明，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养松树蜂共生菌的效果一般，主要表现为共生菌生长速度慢，长不出子实体等。此外，考虑到松树蜂共生菌主要是随松树蜂的产卵试探和扩散在松属植物中找到合适寄主并定殖，因此，研究一种以松属植物为主要营养源的网隙裂粉韧革菌培养基，对进一步了解真菌在自然界中性质和影响以及松树蜂的综合防控都显得很有必要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种网隙裂粉韧革菌培养基及其培养方法，该培养基可有效提升网隙裂粉韧革菌的繁殖速率，同时促进子实体的形成，且不容易被污染。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
一种网隙裂粉韧革菌培养基，所述培养基包括健康松树木粉、麦芽浸膏和酵母膏。
发明人经大量研究发现，健康松树木粉作为网隙裂粉韧革菌生长主要的碳源；麦芽浸膏含有丰富的麦芽糖、果糖、葡萄糖、蛋白质、小分子肽、还有氨基酸和多种维生素、矿物质；酵母膏含有丰富的维生素和氨基酸，以上三种组分模拟松树蜂共生菌的野外生长环境和营养来源，可有效提升网隙裂粉韧革菌的繁殖速率，同时促进子实体的形成，且不容易被污染。
本发明中，所述健康松树木粉、麦芽浸膏和酵母膏的质量比为(150-200)：(2-4)：(0.2-0.4)，优选为(170-180)：(2.8-3.2)：(0.25-0.35)。本发明发现，当健康松树木粉、麦芽浸膏和酵母膏以特定质量比组合后，可进一步提升网隙裂粉韧革菌的培养效果。
进一步地，所述健康松树木粉的浓度为(150-200)g/L，优选(170-180)g/L；
和/或，所述麦芽浸膏的浓度为(2-4)g/L，优选(2.8-3.2)g/L；
和/或，所述酵母膏的浓度为(0.2-0.4)g/L，优选(0.25-0.35)g/L。
本发明中，还包括(10-20)g/L的琼脂。
在本发明优选的实施例中，每升所述培养基中包括：健康松树木粉175.0g，琼脂15.0g，麦芽浸膏3.0g，酵母膏0.3g，余量为水。
本发明中，所述健康松树木粉为健康樟子松木粉或健康油松木粉；
或，所述健康松树木粉的粒径为0.1-0.5mm，优选0.2-0.3mm。
本发明还提供一种网隙裂粉韧革菌的培养方法，利用上述的培养基对网隙裂粉韧革菌进行培养。
本发明中，所述培养是在温度为25℃的条件下进行暗培养。
具体培养方法包括以下步骤：
S1、菌种的分离与活化；
S2、制备培养基；
S3、将活化后的菌种接种于所述培养基进行培养。
其中，所述步骤S1：解剖松树蜂腹部，取贮菌囊转移至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)表面，划破贮菌囊，使囊内贮藏的真菌菌丝片段接触到平板，将平板于25℃避光培养8天，检查菌落生长情况并重新接种至新的PDA培养基进行纯化。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供的网隙裂粉韧革菌培养基的成分和配比科学合理，培养网隙裂粉韧革菌的生长速度更快，部分能长出子实体，且不容易被污染，为松树蜂共生菌的进一步研究甚至是松树蜂的防治奠定了基础。
附图说明
图1为网隙裂粉韧革菌在不同培养基中的生长状态图；其中J、Y、S、T、F、D、M、W分别表示实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6的培养基，P代表PDA培养基。7、14：真菌生长7d、14d。
图2为网隙裂粉韧革菌在实施例2的培养基上长出子实体。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中所用部分材料、仪器如下：
麦芽浸膏、酵母膏均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母提取物购自Oxoid有限公司；葡萄糖购自西陇科学股份有限公司；琼脂购自北京拜尔迪生物技术有限公司。
实施例1
本实施例提供一种网隙裂粉韧革菌培养基并对网隙裂粉韧革菌进行培养。
每升网隙裂粉韧革菌培养基(PPMYA)中包括：健康樟子松木粉175.0g，琼脂15.0g，麦芽浸膏3.0g，酵母膏0.3g，余量为水。
培养基的制备方法如下：
将没有害虫危害且无明显真菌侵染的樟子松木、油松木劈成1.5×0.7×0.3cm的小木块，90℃烘干并磨碎成木粉，然后用60目的筛子过筛，并在117℃条件下灭菌20分钟，分别得到健康樟子松木粉和健康油松木粉。
24h之后，称量15.0g琼脂、175.0g健康樟子松木粉，平均分装于5个锥形瓶中。用烧杯量取3.0g麦芽浸膏、0.3g酵母膏，各加入50ml蒸馏水，用酒精灯加热至麦芽浸膏和酵母膏完全融化，然后分装于5个锥形瓶中，最后，将剩余的900ml蒸馏水分装于5个锥形瓶中，用去离子水冲洗过的玻璃棒充分搅拌，自然pH，使用封口膜和报纸双重封口之后再在117℃条件下灭菌20分钟备用。
网隙裂粉韧革菌的培养方法包括以下步骤：
1、菌种的分离和活化
所用菌株由北京林业大学林业有害生物防治北京市重点实验室提供，解剖松树蜂腹部之后，取其贮菌囊转移至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)表面，用接种针头部锋利的边缘划破贮菌囊，使囊内贮藏的真菌菌丝片段(分节孢子)接触到平板，将平板于25℃避光培养8天，检查菌落生长情况并重新接种至新的PDA平板进行纯化。根据前人关于松树蜂共生菌的菌落形态特征描述以及分子生物学方法进行真菌种类鉴定，松树蜂共生菌为网隙裂粉韧革菌Amylosereum areolatum。
2、接种
在无菌条件下，将活化之后的网隙裂粉韧革菌菌饼接种至上述培养基平板并在25℃黑暗条件下培养。
实施例2
本实施例提供的网隙裂粉韧革菌培养基与实施例1的区别仅在于，将健康樟子松木粉替换成等量的健康油松木粉。
本实施例提供的网隙裂粉韧革菌的培养方法同实施例1。
对比例1
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌培养基与实施例1的区别仅在于，将健康樟子松木粉替换成等量的受害樟子松木粉，该受害樟子松木粉由松树蜂蛀道旁的樟子松木磨碎成粉制成。
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌的培养方法同实施例1。
对比例2
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌培养基与实施例1的区别仅在于，将麦芽浸膏替换成等量的葡萄糖。
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌的培养方法同实施例1。
对比例3
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌培养基与实施例1的区别仅在于，将酵母膏替换成等量的酵母提取物。
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌的培养方法同实施例1。
对比例4
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌培养基与实施例1的区别仅在于，每升网隙裂粉韧革菌培养基(PPMYA)中包括：松树木粉150.0g，琼脂15.0g，麦芽浸膏2.0g，酵母膏0.2g，余量为水。
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌的培养方法同实施例1。
对比例5
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌培养基与实施例1的区别在于未添加麦芽浸膏和酵母膏。
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌的培养方法同实施例1。
对比例6
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌培养基与实施例1的区别仅在于未添加松树木粉。
本对比例提供的网隙裂粉韧革菌的培养方法同实施例1。
测试例1
配置实施例1-2、对比例1-6的培养基和PDA培养基并接种网隙裂粉韧革菌，每组6个重复，将平板放置在25℃的恒温培养箱中进行真菌培养，每隔7天进行一次菌丝长度测定，并分别在第7天和第14天拍照观察真菌生长状态，实验记录结果见表1。
表1不同培养基培养条件下A.areolatum生长距离(mm)
注：J、Y、S、T、F、D、M、W分别表示实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6的培养基，P代表PDA培养基。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。