痛风汤散抗高尿酸血症与痛风疾病的活性提取物制备与应用
阅读说明：本技术 痛风汤散抗高尿酸血症与痛风疾病的活性提取物制备与应用 (Preparation and application of active extract of gout decoction powder for resisting hyperuricemia and gout diseases ) 是由 陈海芳 张武岗 冯育林 杨世林 杨武亮 郎一帆 安琼 李国峰 于 2021-02-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了痛风汤散抗高尿酸血症与痛风疾病活性提取物的制备方法,痛风汤散经乙醇回流提取、大孔树脂吸附解析获得本发明的痛风汤散活性提取物。本发明获得的活性提取物包含多酚类、黄酮类和生物碱类物质,其中,总多酚的UV含量大于50%、总黄酮的UV含量大于4%、总生物碱的UV含量大于0.4%。并且,活性提取物具有显著抑制黄嘌呤氧化酶活性、降低血清尿酸、尿素氮、肌酐、IL-6和IL-1β的水平、抑制痛风性关节炎的关节肿胀,其可单独或与其它药物配合开发成治疗高尿酸血症与痛风疾病的新型药物。(The invention provides a preparation method of an active extract of gout decoction powder for resisting hyperuricemia and gout diseases. The active extract obtained by the invention contains polyphenols, flavonoids and alkaloids substances, wherein the UV content of total polyphenols is more than 50%, the UV content of total flavonoids is more than 4%, and the UV content of total alkaloids is more than 0.4%. In addition, the active extract has the functions of obviously inhibiting the activity of xanthine oxidase, reducing the levels of serum uric acid, urea nitrogen, creatinine, IL-6 and IL-1 beta and inhibiting the joint swelling of gouty arthritis, and can be developed into a novel medicine for treating hyperuricemia and gout diseases independently or in combination with other medicines.)
技术领域
本发明属于中药领域，涉及痛风汤散抗高尿酸血症与痛风疾病的活性提取物制备及其应用。
背景技术
体内嘌呤代谢紊乱可使尿酸生成量增多，导致体内尿酸水平异常增高，引发高尿酸血症（HUA）。长期的HUA可使尿酸盐结晶(MSU)沉积在关节或皮下等组织引起的炎性疾病，最终发展成痛风。临床以红、肿、热、痛反复发作及关节活动受限为特点，后期可致患者的关节活动产生障碍以及骨骼畸形。
据统计，全球痛风的发病率普遍为1～4％，西方一些国家已达到10％左右，我国为1～3％，且呈逐年上升的趋势。同时，自古以来称之为“富贵病”的痛风是糖尿病、慢性肾病、肥胖、高血压、肾结石、心梗、心衰和脑卒中等多种疾病的危险因素；美国国家健康与营养调查(NHANES)数据显示：在痛风患者中，69.1%患有高血压、62.9%患有肥胖症、33.1%患有2型糖尿病、53.7%患有高血脂症、47.4患有高胆固醇症、24%患有3期慢性肾病、7.4%患有心房颤动。在一大批痛风患者常年的随访中发现，血尿酸水平长期高于360μmol/L引发高血压、糖尿病、心血管疾病和尿路结石并发症的风险均显著增加；在由痛风导致死亡的患者中，50%以上带有心血管疾病，而且因心血管引发的死亡率与痛风严重程度成正相关。
目前，国内外临床对高尿酸血症与痛风疾病的治疗中均采用“降低血清尿酸、消炎止痛”的方案，药物以别嘌呤、苯溴马隆、非布司他及秋水仙碱等为主。这些药物虽然可以有效缓解患者的临床症状，但慢性痛风患者长期服用会产生严重过敏、肝损伤及免疫原性等副作用。
痛风类疾病为青藏高原的一种典型病种，藏医在对该类疾病的长期治疗过程中形成了一些经典方剂。其中，痛风汤散收载于《藏药标准》，由诃子、勒哲和渣浔膏3味原药材的粗粉混合组成，具有消炎止痛、干黄水的功效，用于痛风、下肢关节红肿疼痛等疾病。但是，至今对痛风汤散的抗高尿酸血症和痛风性疾病的活性成分及其制备均未见报道。
《藏药标准》中记载痛风汤散以药材原粉直接口服，这种服用方式降低了其活性成分的生物利用度，增大了其日服剂量，而且至今药效成分不明确，这些情况均在一定程度上限制了痛风汤散临床应用。
发明内容
针对目前痛风汤散以原粉入药、药效成分不明确、日服剂量大等问题，本发明采用药理活性跟踪的方法，对痛风汤散的不同提取物进行抗高尿酸血症与痛风疾病的药效评价，明确其抗高尿酸血症与痛风的活性提取物，并对活性提取物进行成分分析，明确了其化学成分组成。最终建立了一种化学成分明确、质量可控、药效作用有保障的痛风汤散抗高尿酸血症与痛风的活性提取物制备方法。
本发明的活性提取物以多酚类、生物碱和黄酮类物质为主，并且，其中总多酚的UV含量大于50%、总黄酮的UV含量大于4%、总生物碱的UV含量大于0.4%。
本发明的活性提取物通过以下步骤制备得到：
a）按5:4:2的质量比取诃子、勒哲和渣浔膏混合药材，用5~20倍（质量/体积）的60~90%的乙醇水加热回流提取2~4次，每次1-3小时，过滤，合并得提取液A；
b）提取液A经40~60℃减压浓缩至相对密度为1.01~1.07（60-70℃），真空干燥，即得痛风汤散醇提物B；
c）再将醇提物B用6-12倍（g/mL）水溶解，经10-20倍（g/mL）大孔树脂吸附，再依次用不同体积浓度的乙醇水溶液梯度洗脱，收集50 ~ 70%的乙醇水洗脱液，合并，真空干燥，即得痛风汤散活性提取物。
进一步地所述的大孔吸附树脂选自AB-8、HPD-400、D101、NKA-9、HPD-826。
本发明还涉及一种药物组合物，包含本发明的痛风汤散活性提取物和药学上可接受的辅料。
进一步地，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、丸剂、浸膏剂、口服液或糖浆剂。
本发明还涉及痛风汤散的活性提取物在制备抗高尿酸血症、抗痛风药物中的应用。特别是在制备抗痛风的药物中的应用。
针对痛风汤散的原粉入药、成分复杂，主要药效成分不明确、日服剂量大等问题，本发明的痛风汤散活性提取物制备工艺采用活性引导分级分离方法，避免了目标成分的流失，同时使药效成分的含量得到明显提高，所得提取物具备主要药效成分更明确、提取率高的优势。具体表现在：本发明痛风汤散活性提取物主要包含多酚类、黄酮、生物碱类成分，经紫外分光光度计检测活性提取物中总多酚含量大于50%、总黄酮的含量大于4%、总生物碱的含量大于0.4%。
本发明所得的痛风汤散活性提取物具有抗高尿酸血症、抗痛风药效作用。具体表现在其可以显著抑制黄嘌呤氧化酶活性、降低血清尿酸、尿素氮、肌酐、IL-6和IL-1β的水平、并且对痛风性关节炎的关节肿胀具有显著的抑制作用。
因而，本发明所得的痛风汤散活性提取物在药材利用率、明确主要药效成分，减小日服剂量，提高疗效等方面具有明显的优势。将其进一步开发成抗高尿酸血症、抗痛风药物，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为总多酚的波长扫描图；
图2为总多酚含量测定的标准曲线；
图3为总黄酮的波长扫描图；
图4为总黄酮含量测定的标准曲线；
图5为总生物碱的波长扫描图；
图6为总生物碱含量测定的标准曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
、活性提取物中化学成分种类鉴别
水溶性成分：取活性提取物10g，加入蒸馏水50ml于50－60℃水浴中温浸2小时，过滤，滤液备用。
醇溶性成分：取活性提取物10g，加乙醇100ml，沸水浴上回流提取1小时，过滤。滤液回收乙醇浓缩至无醇味。结果见表1。
由表1结果可知，痛风汤散的活性提取物中主要包含多酚类（酚类、鞣质）、黄酮、生物碱及糖类成分。
、活性提取物中主要化学成分含量测定方法
2.1总多酚含量测定
对照品溶液的配制：称取适量没食子酸对照品，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，摇匀，稀释至100μg/ml即得对照品溶液，置于4℃冰箱保存备用。
样品溶液的配制：称取痛风汤散60%乙醇水洗脱物2.04mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，摇匀即得样品溶液，置于4℃冰箱保存备用。
波长选择：分别精确吸取对照品溶液和供试品溶液各1mL，分别置于25ml容量瓶中，加入福林酚试剂1mL，避光反应3min，加1.5ml 15% Na2CO3溶液，用水定容至刻度，50℃水浴60min，用相应的溶液作参比溶液。于400～900nm进行全波长光谱扫描，结果在755nm处有最大吸收（见图1）。
标准曲线的制备: 取对照品溶液0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75mL于试管中，加入福林酚试剂1mL，避光反应3min，加2ml15% Na2CO3溶液，用水定容至刻度，50℃水浴60min。在755nm波长处测定吸光度(A值)，以对照品浓度C(μg/mL)为横坐标，吸光度(A值)为纵坐标，得标准回归方程y = 0.0493x + 0.0722（R2=0.9991）,表明没食子酸在1~7ug /mL范围内与吸光度呈良好线性关系（见图2）。
总黄酮含量测定
对照品溶液的配制：精密称取芦丁对照品25.0mg，置于50mL棕色容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容至刻度线，即得500 ug/mL的芦丁对照品溶液，置于4℃冰箱保存备用。
样品溶液的配制：称取痛风汤散60%乙醇水洗脱物10 mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，摇匀即得样品溶液，置于4℃冰箱保存备用。
波长选择：分别精确吸取对照品溶液和供试品溶液各1mL，分别置于具塞9试管中，加入5%NaNO2溶液0.3mL，摇匀，静置6min，加入10%Al(NO3)3溶液0.3mL，摇匀，静置6min，加入4%NaOH溶液5mL，混匀，用60%乙醇定容至10mL后静置20min，以相应试剂为空白，于400～800nm进行全波长光谱扫描，结果在510nm处有最大吸收，故选择测定波长510nm（见图3）。
标准曲线的制备: 分别移取上述配制的溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0于10 mL具塞比色管中，加入5% NaNO2溶液0.3mL，摇匀，静置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3mL，摇匀，静置6min，加入4% NaOH溶液5mL，混匀，用60%乙醇定容至10mL后静置20min，在510nm波长处测定吸光度(A值)，以芦丁浓度C(ug/mL)为横坐标，吸光度(A值)为纵坐标，得标准回归方程y=0.0057x-0.0015（R2=0.9992），表明芦丁在5～50ug/ml范围内与吸光度呈良好线性关系（见图4）。
总生物碱含量测定
对照品溶液的配制：称取盐酸小檗碱对照品1.69mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，摇匀即得对照品溶液，置于4℃冰箱保存备用。
样品溶液的配制：称取痛风汤散60%乙醇水洗脱物100 mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，摇匀即得样品溶液，置于4℃冰箱保存备用。
波长选择：分别精确吸取对照品溶液和供试品溶液各1mL，分别置于具塞锥形瓶中，挥干溶剂，加入酸性染料溶液6mL和氯仿6mL，摇匀，后置于分液漏斗中静止2h，分取氯仿层溶液，以相应试剂为空白，于400～800nm进行全波长光谱扫描，结果在415nm处有最大吸收，故选择测定波长415nm（见图5）。
标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL于锥形瓶中，挥干溶剂，加入酸性染料溶液6mL和氯仿6mL，混匀，后置于分液漏斗中静止2h，分取氯仿层溶液，在波长415nm波长处测定吸光度(A值)，以对照品浓度C(ug/mL)为横坐标，吸光度(A值)为纵坐标，得标准回归方程y = 0.0733x + 0.0169（R2=0.9994），表明盐酸小檗碱在1.41～14.1ug /mL 范围内与吸光度呈良好线性关系（见图6）。
实施例1
本实施案例提供了一种痛风汤散抗高尿酸血症与痛风疾病的活性提取物的制备方法，按5:4:2的质量比取诃子、勒哲和渣浔膏混合药材1000g，用10倍的80%乙醇溶液，75℃加热回流提取2次，每次1小时，过滤，合并得提取液A，60℃减压浓缩至相对密度为1.07（60-70℃），减压干燥，即得到痛风汤散醇提物B 137g。将醇提物B用10倍量水溶解，再经已处理好的15倍量大孔吸附树脂AB-8吸附，依次分别用2个柱体积的水、30%乙醇水溶液、60%乙醇水溶液、90%乙醇水溶液进行洗脱，收集各洗脱液，减压干燥，即得水洗脱物7.7g、30%乙醇水洗脱物39.6 g、60%乙醇水洗脱物30.1g、 90%乙醇水洗脱物2.6g。经紫外分光光度计检测60%乙醇水洗脱物中总多酚的含量52.16%、总黄酮的含量4.61%、总生物碱的含量0.43%。
实施例2
按5:4:2的质量比取诃子、勒哲和渣浔膏混合药材1000g，用5倍的90%乙醇溶液，90℃加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并得提取液A，40℃减压浓缩至相对密度为1.04（60-70℃），即得到痛风汤散醇提物B 131g。将醇提物B用6倍量水溶解，再经已处理好的10倍量大孔吸附树脂HPD-400吸附，分别依次用2个柱体积的水、30%乙醇水溶液、60%乙醇水溶液、90%乙醇水溶液进行洗脱，收集各洗脱液，减压干燥，即得水洗脱物7.9g、30%乙醇水洗脱物35.4g、60%乙醇水洗脱物32.8 g、90%乙醇水洗脱物3.1g。经紫外分光光度计检测60%乙醇水洗脱物中总多酚的含量为56.6%、总黄酮的含量4.14%、总生物碱的含量0.51%。
实施例3
按5:4:2的质量比取诃子、勒哲和渣浔膏混合药材1000g，用20倍的60%乙醇溶液，60℃加热回流提取4次，每次3小时，过滤，合并得提取液A，50℃减压浓缩至相对密度为1.01（60-70℃），即得到痛风汤散醇提物B 145g。将醇提物B用12倍量水溶解，再经已处理好的20倍量大孔吸附树脂HPD-826吸附，依次分别用2个柱体积的水、30%乙醇水溶液、60%乙醇水溶液、90%乙醇水溶液进行洗脱，收集各洗脱液，减压干燥，即得水洗脱物8.6g、30%乙醇水洗脱物43.5g、60%乙醇水洗脱物31.9 g、90%乙醇水洗脱物2.5g。经紫外分光光度计检测60%乙醇水洗脱物中总多酚的含量53.74%、总黄酮的含量4.22%、总生物碱的含量0.46%。
实施例4：痛风汤散不同提取物对黄嘌呤氧化酶抑制的实验方法
4.1供试品溶液的制备
称取各样品适量，置于10mL容量瓶中，加适量DMSO促溶，然后加入PBS缓冲液定容至刻度线，再将各样品稀释成5个不同浓度（见表2）。
4.2 各样品的黄嘌呤氧化酶抑制活性测试
取以上各样品备用，反应体系总体积为200µL，反应时先依次向96 孔板加入缓冲液100µL、不同浓度样品50µL，酶液50µL (0.1U/mL)，在酶标仪内37℃孵育3min后，加入底物黄嘌呤50µL (0.48mmol/L)启动反应，立即在295 nm 处记录吸收度值(每隔10 s 一次) ，共计5 min。每个浓度重复3孔。以各自样品在反应体系中终浓度计算其对黄嘌呤氧化酶的抑制率IC50。结果见表3
抑制率( %) 用下列公式计算:
抑制率( %) = (ΔA酶－ΔA样品) /(ΔA酶－ΔA空白) × 100%
其中ΔA 指一定时间内吸光度的差值。
如表3显示，痛风汤散醇提物（CF）经大孔树脂吸附解析后得到的30%乙醇水洗脱物（30X）和60%乙醇水洗脱物（60X）对黄嘌呤氧化酶呈现出显著的抑制作用。但60X对黄嘌呤氧化酶的IC50为30.9 μg/mL，明显优于CF(87.57ug/ml）。由此可见，痛风汤散醇提物抑制黄嘌呤氧化酶活性的物质主要集中在60%乙醇水洗脱物中。
实施例5：痛风汤散不同提取物对高尿酸模型大鼠的各生化指标的抑制实验
90只雄性SD大鼠，自由供给水和普通饲料，适应性喂养5天后，随机分为9组，分别为：空白组(KB)、模型组(MX)、别嘌醇组(BPC，阳性对照组)、十五味乳鹏丸组(YX2，阳性对照组)、痛风汤散醇提物组(CF)、水洗脱物组(SX)、30%乙醇水洗脱物组(30X)、60%乙醇水洗脱物组(60X)、90%乙醇水洗脱物组(90X)，每组10只。其中除空白组外，均予以腹腔注射氧嗪酸钾联合灌胃次黄嘌呤构建高尿酸血症大鼠模型，造模1h后，空白组和模型组给予0.5% CMC-Na，其余各组给予相应药物，连续7天。末次造模前禁食12h，可自由饮水，给药1h后，大鼠眼眶静脉丛取血，室温静置1h后，4000r/min低温离心10min，取上层血清，分装后于-30℃保存，取肝脏和肾脏置于-30℃冰箱保存，用于后续各指标检测。按照南京建成尿酸试剂盒说明书检测血清尿酸(SUA)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、黄嘌呤氧化酶（XOD）、白介素6(IL-6)和白介素1β(IL-1β)水平。结果见表4、表5。
由表4和表5中可以看出，模型组中各项生化指标在血清中水平明显高于空白组，别嘌醇和十五味乳鹏丸的阳性对照组中各项指标在血清中水平明显低于模型组，提示该试验的高尿酸血症模型造模成功。
与模型组相比，痛风汤散醇提组及其不同醇水洗脱组的各项生化指标在血清中水平均低于模型组，尤其是60%乙醇水洗脱物组对各项生化指标的作用最为显著，并且优于痛风汤散醇提组。由此可以得出60%乙醇水洗脱物为痛风汤散抗高尿酸血症的活性提取物。
实施例6：痛风汤散不同提取物对痛风性关节炎模型大鼠关节肿胀抑制实验
90只雄性SD大鼠，自由供给水和普通饲料，适应性喂养5天后，随机分为10组，分别为：空白组(KB)、模型组(MX)、秋水仙碱组(QSX，阳性对照组)、十五味乳鹏丸组(YX2，阳性对照组)、痛风汤散醇提物组(CF)、水洗脱物组(SX)、30%乙醇水洗脱物组(30X)、60%乙醇水洗脱物组(60X)、90%乙醇水洗脱物组(90X)，每组10只。空白组、模型组和阳性药一组给予0.5%CMC-Na，其余各组给予相应药物，连续6天。第7天各组均给予相应药物，1h后开始造模，空白组大鼠右踝关节腔注入200μl生理盐水，其余各组大鼠右踝关节腔注入200 μl 40mg/mLMSU溶液。造模前用足趾肿胀测量仪测量大鼠右足容积，并记录。并且，分别于造模后2、4、6、8h、12h、24h测量各组大鼠右足容积，计算足趾肿胀度(见表6)。
肿胀指数定义：关节肿胀度=(测定时点关节周径-初始周径)/初始周径*100%。
由表6可以看出，与正常组比较，模型组大鼠造模后6h 关节明显肿胀，8h 到12h达高峰， 24h 自发减轻。与模型组比较，痛风汤散各组与秋水仙碱、十五味乳鹏丸在6h ～24h 大鼠关节肿胀率均有所降低，尤其是秋水仙碱组（QSX）和60%乙醇水洗脱物组（60X）在12h对大鼠关节肿胀具有显著性抑制作用，而且60X组在24h对大鼠关节肿胀抑制作用优于QSX组。由此可以得出60%乙醇水洗脱物为痛风汤散抑制痛风性关节炎肿胀的活性提取物。
实施例7：痛风汤散活性提取物不同剂型的制备
a）丸剂: 取痛风汤散活性提取物、淀粉、交联羧甲基纤维素钠分别粉碎过100目筛，混合均匀，用水泛丸，干燥，每丸含痛风汤散活性提取物0.1-100mg，检验合格，包装即得。
b）口服液: 取痛风汤散活性提取物，加水溶解，加矫味剂适量，加活性炭5g，加热30分钟，滤过，加水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，每ml含痛风汤散活性提取物0.1-100mg，检验合格，包装即得。
c）糖浆: 取痛风汤散活性提取物，加水溶解，加蔗糖500g及防腐剂适量，煮沸使溶解，滤过，加水至1000ml，滤过，灌封，灭菌，每ml含痛风汤散活性提取物0.1-100mg，检验合格，包装即得。
d）散剂、片剂、胶囊、颗粒剂、浸膏剂: 均按常规工艺制备，每片或每颗胶囊中含痛风汤散活性提取物0.1-100mg；散剂或颗粒剂每小袋为1g含痛风汤散活性提取物0.1-100mg，经检验合格后，包装即得。
最后应说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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