一种烟叶处理复合生物制剂及鲜烟叶的处理方法
阅读说明：本技术 一种烟叶处理复合生物制剂及鲜烟叶的处理方法 (Composite biological preparation for tobacco leaf treatment and fresh tobacco leaf treatment method ) 是由 冯颖杰 杨宗灿 杨永锋 张婷婷 张展 刘文召 彭玉富 刘向真 赵森森 牛洋洋 于 2021-06-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种烟叶处理复合生物制剂及鲜烟叶的处理方法,烟叶处理复合生物制剂包括保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌ZY02和保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌ZT-01。本公开的烟叶处理复合生物制剂可使得鲜烟叶在高温烘烤条件下产生香味成分,有效提高了鲜烟叶的品质。(The invention discloses a tobacco leaf treatment composite biological agent and a fresh tobacco leaf treatment method, wherein the tobacco leaf treatment composite biological agent comprises micrococcus ZY02 with the preservation number of CGMCC NO.21313 and acetobacter gluconicum ZT-01 with the preservation number of CGMCC NO. 21544. The tobacco leaf treatment composite biological agent disclosed by the invention can enable fresh tobacco leaves to generate fragrant components under a high-temperature baking condition, and effectively improves the quality of the fresh tobacco leaves.)
技术领域
本发明涉及烟叶处理领域，更具体地，涉及一种烟叶处理复合生物制剂及鲜烟叶的处理方法。
背景技术
烟叶从采摘到卷烟加工需要经历初烤、复烤、醇化等过程。刚采摘下来的烟叶称为鲜烟叶，水分含量高，化学成分不协调，大分子含量高，香味成分少。
通过初烤、复烤和醇化等过程，烟叶的水分降低至12％左右，大分子物质逐渐降解，香味成分累积。但一些鲜烟叶本身质量较差，无法通过初烤、复烤和醇化等过程使其内在化学成分完全转为协调，大分子物质难以完全降解，需要借助微生物和生物酶的协助完成大分子转变。
因此，如何提供一种可处理鲜烟叶的生物制剂成为本领域亟需解决的技术难题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种可处理鲜烟叶的烟叶处理复合生物制剂的新技术方案。
根据本发明的第一方面，提供了一种烟叶处理复合生物制剂。
该烟叶处理复合生物制剂包括保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02和保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)ZT-01。
根据本发明的第二方面，提供了一种本发明所述的烟叶处理复合生物制剂在鲜烟叶处理领域的应用。
根据本发明的第三方面，提供了一种鲜烟叶的处理方法。
该鲜烟叶的处理方法包括如下步骤：
步骤(1)：将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02的菌落接种至液体培养基中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，得到微球菌种子液，将微球菌种子液在4000r/min，4℃条件下低温离心，去除上清液，加入无菌水复溶，调节OD600为2.0，得到微球菌种子；
步骤(2)：配制含有葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和一水合柠檬酸的水溶液，调节pH并灭菌后，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)ZT-01，恒温震荡培养一段时间，制得葡糖酸醋杆菌种子液；
步骤(3)：将烟末与去离子水按照质量比1:(2-20)混合，在30℃-100℃下提取0.5h-5h，过滤后取滤液加入可溶性淀粉和可溶性蛋白，混匀并灭菌，得到烟草发酵诱导培养基；
步骤(4)：将微球菌种子和烟草发酵诱导培养基按照体积比1:(50-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min搅拌发酵1-5d，发酵后的烟草发酵诱导培养基离心后在冰水浴中超声破碎，然后低温离心，取上清液，得到ZY02生物制剂；
步骤(5)：将葡糖酸醋杆菌种子液和烟草发酵诱导培养基按照体积比1:(10-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min下先搅拌发酵12-48h再静置12-72h，发酵后的烟草发酵诱导培养基离心后在冰水浴中超声破碎，然后低温离心，取上清液，得到ZT-01生物制剂；
步骤(6)：将ZY02生物制剂和ZT-01生物制剂根据体积比(1-10):(1-10)混合，得到复合生物制剂；
步骤(7)：在鲜烟叶烘烤前，根据复合生物制剂与鲜烟叶的体积质量比为1:(50-10000)将复合生物制剂以喷雾的方式添加至鲜烟叶中。
可选的，所述步骤(1)具体如下：
将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02的菌落接种至液体培养基中，于30℃，150r/min的摇床中培养12h，得到微球菌种子液，将微球菌种子液在4000r/min，4℃条件下低温离心20min，去除上清液，加入无菌水复溶，调节OD600为2.0，得到微球菌种子。
可选的，所述步骤(2)具体如下：
配制含有20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、1g/L一水合柠檬酸的水溶液，调节pH至4.8-5，于121℃灭菌15min，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌ZT-01后于25-40℃，100-200r/min的条件下恒温震荡培养24-48h，制得葡糖酸醋杆菌种子液。
可选的，所述步骤(3)具体如下：
将烟末过筛，过筛后的烟末与去离子水按照质量比1:(2-20)混合，在30℃-100℃下提取0.5h-5h，过滤后取滤液按照10g/L的可溶性淀粉添加量和10g/L的可溶性蛋白添加量加入可溶性淀粉和可溶性蛋白，混匀并灭菌，得到烟草发酵诱导培养基。
可选的，所述步骤(4)具体如下：
步骤(4-1)：将微球菌种子与烟草发酵诱导培养基按照体积比1:(50-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min的条件下搅拌发酵1-5d；
步骤(4-2)：发酵后的烟草发酵诱导培养基离心后在冰水浴中超声破碎2-30min，功率为50-300W，超声后低温离心，取上清液，得到ZY02生物制剂。
可选的，所述步骤(5)具体如下：
步骤(5-1)：将葡糖酸醋杆菌种子液和烟草发酵诱导培养基按照体积比1:(10-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min下先搅拌发酵12-48h再静置12-72h；
步骤(5-2)：发酵后的烟草发酵诱导培养基离心后在冰水浴中超声破碎2-30min，功率为50-300W，超声后低温离心，取上清液，得到ZT-01生物制剂。
可选的，所述步骤(6)具体如下：
将ZY02生物制剂和ZT-01生物制剂根据体积比2:1混合，得到复合生物制剂。
可选的，所述步骤(7)具体如下：
在鲜烟叶烘烤前，根据复合生物制剂与鲜烟叶的体积质量比为1:(50-10000)将复合生物制剂以喷雾的方式添加至鲜烟叶中，在温度40℃下进行第一段烘烤，在温度70℃下进行第二段烘烤。
本公开的烟叶处理复合生物制剂可使得鲜烟叶在高温烘烤条件下产生香味成分，有效提高了鲜烟叶的品质。
通过以下参照附图对本发明的示例性实施例的详细描述，本发明的其它特征及其优点将会变得清楚。
附图说明
被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。
图1为本公开初烤后烟叶的香味成分统计图。
具体实施方式
现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
在这里示出和讨论的所有例子中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它例子可以具有不同的值。
本公开提供了一种烟叶处理复合生物制剂，包括保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02和保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)ZT-01。
本公开的葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)ZT-01，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.21544，菌种名称为葡糖酸醋杆菌，菌株编号为ZT-01，分类命名为葡糖酸醋杆菌,Gluconacetobacter sp.，保藏时间为2020年12月23日。
本公开的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.21313，菌种名称为微球菌，菌株编号为ZY02，分类命名为微球菌,Micrococcaceae Pribram，保藏时间为2020年12月07日。
本公开还提供了烟叶处理复合生物制剂在鲜烟叶处理领域的应用。
本公开提供的鲜烟叶的处理方法包括如下步骤：
步骤(1)：将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02的菌落接种至液体培养基中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，得到微球菌种子液，将微球菌种子液在4000r/min，4℃条件下低温离心，去除上清液，加入无菌水复溶，调节OD600为2.0，得到微球菌种子。
步骤(1)可具体如下：
将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02的菌落接种至液体培养基中，于30℃，150r/min的摇床中培养12h，得到微球菌种子液，将微球菌种子液在4000r/min，4℃条件下低温离心20min，去除上清液，加入无菌水复溶，调节OD600为2.0，得到微球菌种子。
步骤(2)：配制含有葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和一水合柠檬酸的水溶液，调节pH并灭菌后，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)ZT-01，恒温震荡培养一段时间，制得葡糖酸醋杆菌种子液。
步骤(2)可具体如下：
配制含有20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、1g/L一水合柠檬酸的水溶液，调节pH至4.8-5，于121℃灭菌15min，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌ZT-01后于25-40℃，100-200r/min的条件下恒温震荡培养12-48h，制得葡糖酸醋杆菌种子液。
步骤(3)：将烟末与去离子水按照质量比1:(2-20)混合，在30℃-100℃下提取0.5h-5h，过滤后取滤液加入可溶性淀粉和可溶性蛋白，混匀并灭菌，得到烟草发酵诱导培养基。上述烟末可为优质烟叶的烟末。
步骤(3)可具体如下：
将烟末过筛，过筛后的烟末与去离子水按照质量比1:(2-20)混合，在30℃-100℃下提取0.5h-5h，过滤后取滤液按照10g/L的可溶性淀粉添加量和10g/L的可溶性蛋白添加量加入可溶性淀粉和可溶性蛋白，混匀并灭菌，得到烟草发酵诱导培养基。
步骤(4)：将微球菌种子和烟草发酵诱导培养基按照体积比1:(50-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min搅拌发酵1-5d，发酵后的烟草发酵诱导培养基离心后在冰水浴中超声破碎，然后低温离心，取上清液，得到ZY02生物制剂。
步骤(4)可具体如下：
步骤(4-1)：将微球菌种子与烟草发酵诱导培养基按照体积比1:(50-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min的条件下搅拌发酵1-5d。
步骤(4-2)：发酵后的烟草发酵诱导培养基离心后在冰水浴中超声破碎2-30min，功率为50-300W，超声后低温离心，取上清液，得到ZY02生物制剂。
步骤(5)：将葡糖酸醋杆菌种子液和烟草发酵诱导培养基按照体积比1:(10-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min下先搅拌发酵12-48h再静置12-72h，发酵后的烟草发酵诱导培养基离心后在冰水浴中超声破碎，然后低温离心，取上清液，得到ZT-01生物制剂。
步骤(5)可具体如下：
步骤(5-1)：将葡糖酸醋杆菌种子液和烟草发酵诱导培养基按照体积比1:(10-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min下先搅拌发酵12-48h再静置12-72h。
步骤(5-2)：发酵后的烟草发酵诱导培养基离心后在冰水浴中超声破碎2-30min，功率为50-300W，超声后低温离心，取上清液，得到ZT-01生物制剂。
步骤(6)：将ZY02生物制剂和ZT-01生物制剂根据体积比(1-10):(1-10)混合，得到复合生物制剂。
步骤(6)可具体如下：
将ZY02生物制剂和ZT-01生物制剂根据体积比2:1混合，得到复合生物制剂。
步骤(7)：在鲜烟叶烘烤前，根据复合生物制剂与鲜烟叶的体积质量比为1:(50-10000)将复合生物制剂以喷雾的方式添加至鲜烟叶中。
步骤(7)可具体如下：
在鲜烟叶烘烤前，根据复合生物制剂与鲜烟叶的体积质量比为1:(50-10000)将复合生物制剂以喷雾的方式添加至鲜烟叶中，在温度40℃下进行第一段烘烤，在温度70℃下进行第二段烘烤。
微生物和生物酶的作用需要满足充足的水分和适宜温度条件。鲜烟叶中水分含量高，约为85％左右。而鲜烟叶在初烤时，一般采用三段式烘烤工艺，将第一段烘烤温度控制在40℃左右，适合于绝大部分生物酶作用的温度。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实验中使用的设备如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的设备。
实施例1
将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌ZY02的菌落用接种环接种至LB液体培养基中，于30℃，150r/min的摇床中培养12h，得到微球菌种子液，将微球菌种子液在4000r/min，4℃条件下低温离心20min，去除上清液，加入无菌水复溶，调节OD600为2.0，得到微球菌种子。
配制含有20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、1g/L一水合柠檬酸的水溶液，调节pH至4.8-5，于121℃灭菌15min，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌ZT-01后于30℃，150r/min的条件下恒温震荡培养24h，制得葡糖酸醋杆菌种子液。
将烟末过50目筛，过筛后的烟末与去离子水按照质量比1:10混合，在70℃下提取1.5h，200目筛过滤后取滤液，按照10g/L的可溶性淀粉添加量和10g/L的可溶性蛋白添加量加入可溶性淀粉和可溶性蛋白，混合均匀后，121℃灭菌10min，得到烟草发酵诱导培养基。
将微球菌种子与烟草发酵诱导培养基按照体积比1:200混合，在温度30℃、150r/min的条件下搅拌发酵2d。发酵后的烟草发酵诱导培养基离心后在冰水浴中超声破碎10min，功率为150W，工作5s间歇5s，超声后低温离心，取上清液，得到ZY02生物制剂。
将葡糖酸醋杆菌种子液和烟草发酵诱导培养基按照体积比1:250混合，在温度30℃、150r/min下先搅拌发酵36h再静置48h。发酵后的烟草发酵诱导培养基离心后在冰水浴中超声破碎10min，功率为150W，工作5s间歇5s，超声后低温离心，取上清液，得到ZT-01生物制剂。
将ZY02生物制剂和ZT-01生物制剂根据体积比2:1混合，得到复合生物制剂。
在鲜烟叶(采摘河南襄县产区中部位置的鲜烟叶作为样品)烘烤前，根据复合生物制剂与鲜烟叶的体积质量比为1:500将复合生物制剂以喷雾的方式添加至鲜烟叶中，在温度40℃下进行第一段烘烤，在温度70℃下进行第二段烘烤，得到初烤烟叶1#。复合生物制剂在第二段烘烤的高温下灭活。
对比例1
在鲜烟叶(采摘河南襄县产区中部位置的鲜烟叶作为样品)烘烤前，根据无菌水与鲜烟叶的体积质量比为1:500将无菌水以喷雾的方式添加至鲜烟叶中，在温度40℃下进行第一段烘烤，在温度70℃下进行第二段烘烤，得到初烤烟叶2#。
初烤烟叶1#和2#用流动分析法检测烟叶中常规化学成分和大分子物质。同时初烤烟叶1#和2#用二氯甲烷萃取，通过GC-MS检测香味成分。
表1.初烤烟叶常规化学成分含量分析(单位：％)
初烤烟叶的常规化学成分大分子物质见表1。由表1可知，经过复合生物制剂处理后的初烤烟叶1#的淀粉和蛋白含量明显低于初烤烟叶2#，降解的大分子一部分生成了还原糖和总糖，因此初烤烟叶1#的还原糖和总糖含量也明显升高。
初烤烟叶香味成分统计见图1和表2。从图1和表2可知，初烤烟叶1#的醇类、酮类和美拉德产物类香味成分含量明显提高，其中美拉德产物提高明显。蛋白和淀粉降解产生小分子糖和氨基酸，在高温烘烤条件下易发生美拉德反应，生成香味成分，从而提高了鲜烟叶的品质。
表2.初烤烟叶香味成分统计(单位：ug/g)
虽然已经通过例子对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上例子仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员应该理解，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对以上实施例进行修改。本发明的范围由所附权利要求来限定。
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