一种超声辅助矿物质螯合杏仁肽及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种超声辅助矿物质螯合杏仁肽及其制备方法和应用 (Ultrasonic-assisted mineral chelated almond peptide and preparation method and application thereof ) 是由 叶勇 黄传庆 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药的技术领域,公开了一种超声辅助矿物质螯合杏仁肽及其制备方法和应用。所述方法：1)在磷酸缓冲溶液中,采用蛋白酶在超声的条件下酶解杏仁蛋白,灭酶,离心,取上清液,冷冻干燥,获得杏仁多肽；2)在溶剂中,将杏仁多肽与矿物质在超声的条件下进行螯合,离心,取上清液,冷冻干燥,获得超声辅助矿物质螯合杏仁肽；矿物质为水溶性亚铁盐、水溶性钙盐和水溶性锌盐；溶剂为水和/或磷酸缓冲液。本发明通过超声辅助和不同矿物质螯合,得到含有多种矿物质螯合杏仁肽,其得率高,抗氧化性能好,同时提供多种矿物质营养。本发明的方法简单。所制备的超声辅助矿物质螯合杏仁肽用作抗氧化肽,并且用于食品、保健品和/或药品的领域。(The invention belongs to the technical field of medicines, and discloses an ultrasonic-assisted mineral substance chelated almond peptide and a preparation method and application thereof. The method comprises the following steps: 1) performing enzymolysis on almond protein in a phosphoric acid buffer solution by adopting protease under the ultrasonic condition, inactivating enzyme, centrifuging, taking supernate, and freeze-drying to obtain almond polypeptide; 2) chelating almond polypeptide and mineral substances in a solvent under the ultrasonic condition, centrifuging, taking supernatant, and freeze-drying to obtain ultrasonic-assisted mineral substance chelated almond peptide; the mineral substance is water-soluble ferrous salt, water-soluble calcium salt and water-soluble zinc salt; the solvent is water and/or phosphate buffer. The invention obtains the almond peptide containing various mineral substances through ultrasonic assistance and chelation of different mineral substances, has high yield and good oxidation resistance, and simultaneously provides various mineral substance nutrition. The method of the invention is simple. The prepared ultrasonic-assisted mineral chelated almond peptide is used as an antioxidant peptide and is used in the fields of food, health care products and/or medicines.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种超声辅助矿物质螯合杏仁肽及其制备方法与作为抗氧化肽的应用。
背景技术
矿物质对人体健康发挥着各种各样的生物功能，例如，钙作为体内最丰富的无机元素，被认为是人体必需的营养矿物质之一，对细胞内代谢、骨骼生长、凝血、神经传导、肌肉收缩和心脏功能等都有重要的生理作用。钙摄取不足会导致代谢性骨病，如儿童的佝偻病和老年人的骨质疏松症。锌作为一系列酶的催化成分，在许多蛋白质、肽、激素、细胞因子、转录因子和生长因子中起着结构和生物学作用。铁是血红蛋白中氧气转运的必要物质，也是血红蛋白生产的重要原料，充足的铁储存对于达到和维持足够的血红蛋白水平是必要的。由于饮食中矿物质的缺乏或矿物质生物利用度有限而引起的矿物质缺乏，可能会导致机体重要器官的功能紊乱，从而导致各种疾病。因此，摄入适量的矿物质元素是非常重要的。
金属盐和多种矿物质补充剂已被用于食品工业，以克服矿物质缺乏，但它们在体内肠道碱性环境中易形成磷酸钙沉淀。矿物质螯合肽具有与金属离子结合或增强胃肠道对矿物质吸收的能力，是提高膳食矿物质生物利用度的有效功能成分，广泛应用于燕麦、饼干、奶粉等食品中。矿物质-螯合肽作为矿物质元素的食物的添加剂已经引起人们的广泛关注。中国专利CN104232719B公开了一种由胶原蛋白制备的钙螯合肽，CN107936113A公开了一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽，CN103626847A公开了一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽，表明矿物质螯合多肽被用来作为营养补充品是可行而且具有很广的应用潜力。但是上述专利只是单一多肽与金属的结合，不能实现与多种金属的同时结合，导致补充的矿物质单一，易导致矿物质不均衡而不利于人体健康。
超声波处理主要利用功率和空化来改变或加速物质的物理、化学和生物特性或状态；此外，因为它的空化-塌缩效应，产生有效的空化能量和显著的混合效应，加速催化反应。超声波处理作为一种辅助处理，可以增加衬底表面积和催化剂的作用频率，从而减少传质的限制。但是超声波技术较多应用于有效成分的提取和化学反应的催化，未见应用于矿物质螯合肽的制备。
杏仁具有祛痰止咳、平喘、润肠等功效，其中含有大量的杏仁蛋白，其氨基酸组成接近国际参考模式，是一种良好的植物蛋白，经降解生成的多肽更能促进吸收，发挥补充营养、美容、抗衰老等功效。但目前未有矿物质螯合杏仁肽的产品和工艺，也未见超声波处理制备杏仁多肽的报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供了一种超声辅助矿物质螯合杏仁肽及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供了上述超声辅助矿物质螯合杏仁肽的应用。所述超声辅助矿物质螯合杏仁肽用作抗氧化肽。本发明的超声辅助矿物质螯合杏仁肽用于食品、保健品和/或药品的领域。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种超声辅助矿物质螯合杏仁肽的制备方法，包括如下步骤：
1)在磷酸缓冲溶液中，采用蛋白酶在超声的条件下酶解杏仁蛋白，灭酶，离心，取上清液，冷冻干燥，获得杏仁多肽；所述杏仁多肽的平均分子量为300～600Da；
2)在溶剂中，将杏仁多肽与矿物质在超声的条件下进行螯合，离心，取上清液，冷冻干燥，获得超声辅助矿物质螯合杏仁肽；所述矿物质为水溶性亚铁盐、水溶性钙盐和水溶性锌盐；所述溶剂为水和/或磷酸缓冲液。
步骤1)中所述磷酸缓冲溶液为pH＝7～8的磷酸缓冲液；
所述蛋白酶的用量为杏仁蛋白质量1％～10％。
所述超声的条件为频率30～80KHz，功率50～500W；超声的时间为10～30min；超声的时间即为酶解的时间。
所述杏仁蛋白与磷酸缓冲溶液的质量体积比为1g：10～20mL。
所述灭酶为高温灭酶，即煮沸15～20min；灭酶后冷却。
所述离心的条件为5000～10000rpm离心10～30min。
步骤2)中所述矿物质中水溶性亚铁盐、水溶性钙盐和水溶性锌盐的摩尔比为(1～10)：(50～500)：(1～10)；
杏仁多肽与矿物质中水溶性亚铁盐的质量摩尔比为10g：(0.001～1)mmol。
步骤2)中所述超声的条件为频率20～40KHz，功率50～100W；超声的时间为0.5～3h，超声的时间即为螯合的时间。
所述离心的条件为5000～10000rpm离心10～30min。
步骤2)的具体步骤为
S1、采用水将杏仁多肽配成溶液，获得杏仁多肽溶液；S2、将矿物质分别采用磷酸缓冲液配成溶液，获得亚铁盐溶液，钙盐溶液和锌盐溶液；将亚铁盐溶液，钙盐溶液和锌盐溶液混合，获得矿物质溶液；S3、将杏仁多肽溶液与矿物质溶液在超声的条件下进行螯合，离心，取上清液，冷冻干燥，获得超声辅助矿物质螯合杏仁肽。
步骤S1中所述杏仁多肽与水的质量体积比为1g：(10～20)mL；
步骤S2所述亚铁盐溶液，钙盐溶液和锌盐溶液各自的浓度为10～20mM。
混合时，亚铁盐溶液，钙盐溶液和锌盐溶液的体积比为(1～5):(50～250):(1～5)。
所述磷酸缓冲液为pH＝7～8的磷酸缓冲液。
所述杏仁多肽溶液与矿物质溶液的体积比为1：(1～5)。
所述水溶性亚铁盐为氯化亚铁、硫酸亚铁或硝酸亚铁；所述水溶性钙盐为氯化钙或硝酸钙；所述水溶性锌盐为氯化锌、硫酸锌等。
步骤1)中所述蛋白酶为碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的一种以上。
通过上述方法制备得到的矿物质螯合杏仁肽粒径50～100nm，用作抗氧化肽，具有良好的抗氧化能力。
本发明的原理：在杏仁蛋白被蛋白酶分解成杏仁蛋白多肽的过程中，超声波处理，减小寡聚物的尺寸，同时增加衬底表面积和催化剂的作用频率，从而减少传质的限制；另一方面因超声的空化-塌缩效应，产生有效的空化能量和显著的混合效应，加速催化反应，得到结构尺寸较小且均一的杏仁多肽。在金属-螯合肽合成过程中，超声波处理可以加速金属离子和杏仁多肽的运动速率，增加金属离子与杏仁多肽的活性位点碰撞的概率，从而提高合成矿物质螯合杏仁肽的产率。通过不同矿物质组合，得到含有多种矿物质螯合杏仁肽，可以同时提供多种矿物质营养，并改善产品的抗氧化性能。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明对杏仁蛋白和蛋白酶超声波辅助处理后，在溶剂中溶解度和反应性能提高，并可得到结构尺寸较小且均一的杏仁多肽。
(2)本发明对金属和杏仁蛋白多肽超声波辅助处理后，提高了金属螯合率，缩短了反应时间，节约能源，制备工艺简单，便于工业化生产。
附图说明
图1为实施例1制备的矿物质螯合杏仁肽对羟基自由基的清除率的曲线图；
图2为实施例1制备的矿物质螯合杏仁肽对超氧阴离子自由基的清除率的曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的杏仁蛋白通过以下方法得到：去除杏仁粉中脂溶性杂质，然后与水混合，调节pH至碱性，离心，取上清液，调节上清液的pH为4.5～6.5，离心，将沉淀进行冷冻干燥，获得杏仁蛋白。所述pH至碱性是指pH为8～12。所述去除脂溶性杂质是指将杏仁粉与脂溶性溶剂混合，20～50℃处理1～2h。所述脂溶性溶剂为正己烷或石油醚中一种以上。所述杏仁粉与脂溶性溶剂的质量体积比为1g:(5～10)mL；去除脂溶性杂质的滤渣与水的质量体积比1:(10～20)(g/mL)。所述调节pH至碱性是指采用1～3mol/L的NaOH水溶液调节pH。所述离心(调节pH至碱性后的离心)的条件为3000～6000rpm离心10～30min；调节上清液的pH是指用1～3mol/L的HCl调节；调节上清液的pH为4.5～6.5后，离心的条件为5000～10000rpm离心10～30min。
实施例1
(1)以80目的杏仁粉100g与正己烷1000mL混合，50℃反应1h后过滤，再将滤渣50g与去离子水500mL混合，用1mol/L的NaOH水溶液调节pH到8.0，3000rpm离心30min获得上清液；用1mol/L的HCl调节上清液的pH到4.5，5000rpm离心30min获得沉淀，冷冻干燥得到杏仁蛋白。
(2)杏仁蛋白50g加入500mL的pH＝7的磷酸缓冲液，加入0.5g的碱性蛋白酶，同时开启超声，频率30KHz，功率500W超声10min，待超声结束后煮沸15min，冷却到室温后，5000rpm离心30min获得上清液，冷冻干燥得到杏仁多肽。本实施例中杏仁多肽的平均分子量为310Da。
(3)杏仁多肽10g溶入100mL的去离子水得到杏仁多肽水溶液；将氯化亚铁、氯化钙、氯化锌分别溶于pH＝7的磷酸缓冲液中配置成浓度为10mM的缓冲液溶液，再按体积比1:50:1混合成矿物质溶液；杏仁多肽溶液与矿物质溶液以体积比1:5混合，开启超声，频率20KHz，功率100W超声0.5h，5000rpm离心30min获得上清液，冷冻干燥获得矿物质螯合杏仁肽。本实施例中矿物质螯合杏仁肽的得率为87％。
实施例2
(1)以200目的杏仁粉100g与正己烷500mL混合，20℃反应2h后过滤，再将滤渣50g与去离子水1000mL混合，用3mol/L的NaOH水溶液调节pH到9.0，6000rpm离心10min获得上清液；用3mol/L的HCl调节上清液的pH到6.5，10000rpm离心10min获得沉淀，冷冻干燥得到杏仁蛋白。
(2)杏仁蛋白50g加入1000mL的pH＝8的磷酸缓冲液，加入0.5g的风味蛋白酶和0.5g中性蛋白酶，同时开启超声，频率80KHz，功率50W超声30min，待超声结束后煮沸20min，冷却到室温后，10000rpm离心10min获得上清液，冷冻干燥得到杏仁多肽。本实施例中杏仁多肽的平均分子量为580Da。
(3)杏仁多肽10g溶入200mL的去离子水得到杏仁多肽水溶液；将氯化亚铁、氯化钙、氯化锌分别溶于pH＝8的磷酸缓冲液中配置成浓度为20mM的缓冲液溶液，再按体积比5:50:5混合成矿物质溶液；杏仁多肽溶液与矿物质溶液以体积比1:1混合，开启超声，频率40KHz，功率50W超声3h，10000rpm离心10min获得上清液，冷冻干燥获得矿物质螯合杏仁肽。本实施例中矿物质螯合杏仁肽的得率为94％。
实施例3
(1)以100目的杏仁粉100g与正己烷800mL混合,30℃反应1.5h后过滤，再将滤渣50g与去离子水800mL混合，用2mol/L的NaOH水溶液调节pH到8.5，4000rpm离心20min获得上清液；用2mol/L的HCl调节上清液的pH到5，8000rpm离心20min获得沉淀，冷冻干燥得到杏仁蛋白。
(2)杏仁蛋白50g加入800mL的pH＝7.5的磷酸缓冲液，加入0.5g的胰蛋白酶和0.5g的木瓜蛋白酶，同时开启超声，频率50KHz，功率200W超声20min，待超声结束后煮沸18min，冷却到室温后，8000rpm离心20min获得上清液，冷冻干燥得到杏仁多肽。本实施例中杏仁多肽的平均分子量为400Da。
(3)杏仁多肽10g溶入150mL的去离子水得到杏仁多肽水溶液；将氯化亚铁、氯化钙、氯化锌分别溶于pH＝7.5的磷酸缓冲液中配置成浓度为15mM的缓冲液溶液，再按体积比1:250:2混合成矿物质溶液；杏仁多肽溶液与矿物质溶液以体积比1:3混合，开启超声，频率30KHz，功率80W超声2h，8000rpm离心20min获得上清液，冷冻干燥获得矿物质螯合杏仁肽。本实施例的矿物质螯合杏仁肽的得率为91％。
对比例1
以搅拌替代超声，搅拌速度1500rpm，其他条件同实施例1。获得的杏仁多肽分子量为2000Da，分子量较大；矿物质螯合杏仁肽得率为36％，显著低于实施例1制得的矿物质螯合杏仁肽得率。测定其抗氧化性能，结果显示其对对羟基自由基和超氧阴离子自由基的最高清除率分别为65％和40％，显著低于实施例1制得的矿物质螯合杏仁肽的抗氧化性能。
对比例2
取市售的大豆多肽螯合铁、大豆多肽螯合锌、鱼骨胶原多肽螯合钙，其铁、锌、钙含量分别为10％、8％和12％。测定其抗氧化性能，结果显示其对对羟基自由基的最高清除率分别为74％、70％和39％，对超氧阴离子自由基的最高清除率分别为58％、49％和28％，显著低于实施例1-3制得的矿物质螯合杏仁肽的抗氧化性能。
对比例3
取实施例1制备的杏仁多肽，测定其抗氧化性能，结果显示其对对羟基自由基和超氧阴离子自由基的最高清除率分别为82％和70％，显著优于市售杏仁多肽的抗氧化性能，表明本发明方法制得的杏仁多肽不仅分子量较小，抗氧化性能更优越。
性能测试：
(1)实施例1-3制得的矿物质螯合杏仁肽的粒径测定
方法：称取实施例1-3制得的矿物质螯合杏仁肽1g，加入50mL去离子水中搅拌均匀，置于马尔文粒度仪，测定其粒径分布。
结果：实施例1-3制得的矿物质螯合杏仁肽的粒径为50～100nm，分布均匀，尺寸较小，说明超声辅助处理使杏仁多肽结构变小且均一。
实施例1的螯合肽的粒径为50～85nm；实施例2的螯合肽的粒径为70～100nm；实施例3的螯合肽的粒径为60～90nm。
(2)实施例1-3制得的矿物质螯合杏仁肽的矿物质含量的测定
方法：称取0.100g实施例1-3制得的矿物质螯合杏仁肽，加入现配20mL王水(浓盐酸：浓硝酸/v:v＝3:1)，密封置于微波消解仪中200℃消解2h,自然冷却后取出，取出1mL溶液稀释到50-300ppm范围内，以标准金属离子液为基准，样品液过滤膜后在电感耦合等离子体发射光谱测定金属元素含量。
结果：实施例1-3制得的矿物质螯合杏仁肽的钙含量为3～8％(质量百分含量)，铁含量为0.1～0.5％，锌含量为0.1～0.6％。其比例符合人体对钙铁锌的需求比例，因而可以提供均衡的钙铁锌营养。
(3)实施例1制得的矿物质螯合杏仁肽的抗氧化性能测定
方法：羟基自由基清除能能力测试：将1毫升的9mmol/L FeSO4，1mL的9mmol/L水杨酸的乙醇溶液和1mL的8.8mmol/L H2O2添加到2mL样品中。在37℃下反应30min后，在510nm下测量混合物的吸光度。以市售杏仁多肽为对照。
超氧阴离子自由基清除能力测定：将4.5mL的Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH 8.2)置于水浴(25℃)中20min。然后将1mL样品和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚加入Tris-HCl缓冲液中。在水浴中反应5min后，加入8mmol/L HCl终止反应。立即在325nm处测量吸光度，并将杏仁多肽用作对照。
结果：如图1、图2所示。图1为实施例1制备的矿物质螯合杏仁肽对羟基自由基的清除率的曲线图；图2为实施例1制备的矿物质螯合杏仁肽对超氧阴离子自由基的清除率的曲线图。
实施例1制得的矿物质螯合杏仁肽具有较强的清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力，其效果优于市售杏仁多肽(分子量为1000Da)，表明本发明的产品抗氧化性能更优。
实施例1的矿物质螯合杏仁肽对羟基自由基和超氧阴离子自由基的最高清除率分别为93％和80％，而市售杏仁多肽只有73％和45％。
另外，实施例2的矿物质螯合杏仁肽对羟基自由基和超氧阴离子自由基的最高清除率分别为95％和83％。
实施例3的矿物质螯合杏仁肽对羟基自由基和超氧阴离子自由基的最高清除率分别为92％和80％。
本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
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