一种基于透明质酸的双靶向功能因子递送体系的制备及其在炎症性肠病中的应用
阅读说明：本技术 一种基于透明质酸的双靶向功能因子递送体系的制备及其在炎症性肠病中的应用 (Preparation of double-targeting functional factor delivery system based on hyaluronic acid and application of double-targeting functional factor delivery system in inflammatory bowel disease ) 是由 谭明乾 铁珊珊 陈衍男 张雪迪 吴仕逹 李佳璇 袁龙 于 2021-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种基于透明质酸的双靶向功能因子递送体系,其制备方法包括以(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰的原花青素为活性因子,合成的两亲性透明质酸为壁材,采用双重乳液反溶剂蒸发法制备双靶向原花青素递送体系。该体系在谷胱甘肽的刺激下能实现原花青素的释放,并在炎症部位和线粒体内实现双靶向递送体系的聚集；此外,该载运体系能有效改善或缓解炎症性肠病症状；本发明所使用原料成本低廉,包埋条件温和,易于规模化生产。(The invention provides a double-target functional factor delivery system based on hyaluronic acid, which is prepared by taking (5-carboxyl amyl) triphenyl phosphine bromide modified procyanidine as an active factor, taking synthesized amphiphilic hyaluronic acid as a wall material and adopting a double emulsion anti-solvent evaporation method. The system can realize the release of procyanidine under the stimulation of glutathione, and realize the aggregation of a double-targeting delivery system in an inflammation part and mitochondria; in addition, the carrier system is effective in ameliorating or alleviating symptoms of inflammatory bowel disease; the raw materials used in the invention have low cost and mild embedding condition, and are easy for large-scale production.)
技术领域
本发明涉及纳米
技术领域
，更具体地说，涉及一种基于透明质酸的双靶向功能因子递送体系的制备及其在炎症性肠病中的应用。背景技术
慢性结肠炎是一种较难治愈，患者需要长期服用药物的慢性疾病。为了减少口服药物引起的不良反应，研发利用食品功能性组分，通过口服结肠递送体系运送到结肠部位，来缓解炎性症状，是一种更为安全和有效的结肠炎处理策略。
原花青素作为一种活性因子，具有抗氧化、抗炎等生物活性，对结肠炎症具有潜在的预防和治疗作用。但原花青素对外界环境中的pH值、光、热和氧气等条件敏感，经口服进入消化道后也易受到体内pH值、酶、黏液等因素的影响，导致其稳定性和生物利用度降低。
透明质酸作为海洋生物资源中的主要活性成分，可用于口服结肠靶向递送体系壁材，以保护原花青素在上消化道的稳定性，并将其递送至结肠部位。由于透明质酸可与CD44受体特异性结合，以透明质酸作为壁材料制备纳米颗粒，可通过CD44受体介导的内吞作用促进巨噬细胞对递送体系的主动摄取。一旦进入细胞，就面临着被细胞质高黏度液体和大量酶分解的威胁。线粒体在维持肠上皮稳态中也很重要，线粒体自由基的产生和氧化应激损伤也参与了慢性结肠炎的发生，因此它可能是慢性结肠炎治疗的新的靶向细胞器。(5-羧基戊基)三苯基溴化膦作为一种离域亲脂阳离子，通常修饰在纳米颗粒表面或与活性成分共价连接实现线粒体靶向。因此，在巨噬细胞和线粒体中有效富集的双靶点纳米颗粒可能是治疗慢性结肠炎的有效策略。
发明内容
本发明的采用双重乳液反溶剂蒸发法提供一种基于透明质酸的双靶向功能因子递送体系的制备方法及其在炎症性肠病中的应用，以解决原花青素对外界环境中的pH值、光、热和氧气等条件敏感，经口服进入消化道后也易受到体内pH值、酶、黏液等因素的影响，导致其稳定性和生物利用度降低的问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种基于透明质酸的双靶向功能因子递送体系，包括以(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰的原花青素为活性因子，以两亲性透明质酸为壁材构建的双靶向原花青素递送体系。
一种基于透明质酸的双靶向功能因子递送体系的制备方法，包括如下步骤：
S1、将(5-羧基戊基)三苯基溴化膦溶解在二甲基亚砜中，配制成浓度为20mg/mL的溶液，然后加入N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，室温下搅拌至激活(5-羧基戊基)三苯基溴化膦上的羧基；加入原花青素在室温黑暗中搅拌12～24h；结束后在二甲基亚砜中透析12～24h，在蒸馏水中透析24～48h，收集透析袋内溶液，冷冻干燥得到(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素聚合物；
S2、将透明质酸溶解于蒸馏水中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌1～2h，激活透明质酸上的羧基；再加入胱胺二盐酸盐搅拌12～24h；然后在蒸馏水中透析24～48h，收集透析袋内溶液，冷冻干燥后得到透明质酸-胱胺二盐酸盐；
S3、将硬脂酸溶解在乙醇溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，冰水浴条件下搅拌1～2h；再加入10mg/mL透明质酸-胱胺二盐酸盐溶液，在80℃下搅拌4～8h，然后冷却到室温继续磁力搅拌12～24h；再在蒸馏水中透析24～48h，收集透析袋内溶液，冷冻干燥后得到透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物；
S4、将步骤S1制备的所述(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素聚合物分散在乙醇中，作为有机相；以4～6mL/h的流速滴入到处于搅拌状态的25mg/mL透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸水溶液中；再以4～6mL/h的流速将溶液滴入到处于搅拌状态的乙醇中，然后温度为40～55℃条件下除去乙醇获得双靶向纳米颗粒。
优选的，步骤S1中所述(5-羧基戊基)三苯基溴化膦与原花青素的质量比为1:10～3:10；所述(5-羧基戊基)三苯基溴化膦与N,N’-二环己基碳二亚胺质量比为2:1，N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为4:1～4:3。
优选的，所述冷冻干燥条件包括：真空度为1Pa，温度为-70～-50℃，冷冻干燥48～96h。
优选的，步骤S2中所述透明质酸与胱胺二盐酸盐的质量比为200:1～200:3；所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为5:1～5:3。
优选的，步骤S3中所述硬脂酸与所述透明质酸-胱胺二盐酸盐的质量比为71:45～71:55；所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为197:115～197:113。
优选的，所述搅拌转速为800～1200rpm。
优选的，所述透析使用透析分子量500～1000Da的透析袋。
本发明用于pH和谷胱甘肽刺激下的控释，进一步，用于缓解结肠炎症症状。
本发明的有益效果是：
本发明采用双重乳液反溶剂蒸发法提供一种基于透明质酸的双靶向功能因子递送体系的制备方法及其在炎症性肠病中的应用。本发明以(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰的原花青素为活性因子，合成的两亲性透明质酸为壁材，采用双重乳液反溶剂蒸发法制备双靶向原花青素递送体系。该体系在pH和谷胱甘肽的刺激下能实现原花青素的释放，并在炎症部位和线粒体内实现双靶向递送体系的聚集。
本发明方法制备食品级细胞膜/线粒体双靶向递送体系，制备方法简单温和，所制备的双靶向递送体系为球形，具有粒径小、表面带负电荷、包封率高等优点，可实现原花青素在谷胱甘肽刺激下的控释。胞内共定位和体内成像实验揭示了原花青素递送体系在小鼠结肠中的分布，确保了透明质酸的靶向能力并能有效富集在线粒体处。此外，原花青素递送体系能改善炎症性肠病小鼠的结肠长度等。本发明所使用原料成本低廉，包埋条件温和，易于规模化生产；本发明制备的双靶向递送体系可用于保健品及功能性食品领域。
本发明以双亲性透明质酸为壁材，制备的双靶向递送体系具有刺激释放，靶向递送和有效缓解炎症症状等功能特性。
附图说明
图1是本发明对比例1制备的功能因子载运体系的透射电镜图；
图2是本发明实施例1制备的功能因子载运体系的透射电镜图；
图3是本发明对比例1制备的功能因子载运体系在谷胱甘肽和pH条件下体外释放情况图；
图4是本发明实施例1制备的功能因子载运体系在谷胱甘肽和pH条件下体外释放情况图；
图5是本发明对比例2中采用红色荧光探针标记RAW264.7巨噬细胞内线粒体情况图；
图6是本发明对比例2荧光标记的递送体系在RAW264.7巨噬细胞内线粒体的分布图；
图7是本发明对比例2红色荧光探针标记的线粒体与递送体系在RAW264.7巨噬细胞内分布叠加图；
图8是本发明实施例2中采用红色荧光探针标记RAW264.7巨噬细胞内线粒体情况图；
图9是本发明实施例2荧光标记的递送体系在RAW264.7巨噬细胞内线粒体的分布图；
图10是本发明实施例2红色荧光探针标记的线粒体与递送体系在RAW264.7巨噬细胞内分布叠加图；
图11是本发明实施例2在健康小鼠主要器官的分布情况图；
图12是本发明实施例2在4％葡聚糖硫酸钠盐诱导的结肠炎小鼠内主要器官的分布情况图；
图13是本发明对比例1和实施例1制备的功能因子递送体系预处理对4％葡聚糖硫酸钠盐诱导的结肠炎小鼠的结肠长度的影响情况图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明采用食品级的海洋多糖制备功能因子递送体系，采用线粒体靶向的(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素，利用双重乳液旋转蒸发法将其装载在双亲性透明质酸内，形成细胞膜和线粒体双靶向的原花青素纳米颗粒，并评价其在炎症性肠病中的应用。
一种基于透明质酸的双靶向功能因子递送体系的制备方法，包括如下步骤：
S1、合成线粒体靶向的(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素聚合物：将(5-羧基戊基)三苯基溴化膦溶解在二甲基亚砜中，配制成浓度为20mg/mL的溶液，然后加入N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶室温下以800～1200rpm搅拌1～2h，激活(5-羧基戊基)三苯基溴化膦上的羧基。随后，加入原花青素在室温黑暗中搅拌12～24h。上述混合溶液在二甲基亚砜中透析12～24h，在蒸馏水中透析24～48h，收集透析袋(透析分子量500Da)内溶液，冷冻干燥得到(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素聚合物。
S2、合成透明质酸-胱胺二盐酸盐：将透明质酸溶解于蒸馏水中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌1～2h，激活透明质酸上的羧基。随后加入胱胺二盐酸盐搅拌12～24h。将上述混合溶液在蒸馏水中透析24～48h，收集透析袋(透析分子量500～1000Da)内溶液，冷冻干燥后得到透明质酸-胱胺二盐酸盐。
S3、合成细胞膜靶向的透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物：将硬脂酸溶解在乙醇溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，800～1200rpm冰水浴条件下搅拌1～2h。随后，将透明质酸-胱胺二盐酸盐的水溶液添加到上述混合物中，在80℃下以800～1200rpm搅拌4～8h，然后冷却到室温继续磁力搅拌12～24h。最后，将上述混合溶液在蒸馏水中透析24～48h，收集透析袋(透析分子量500～1000Da)内溶液，冷冻干燥后得到透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物。
S4、制备纳米颗粒：将步骤S1所述(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素聚合物分散在乙醇中，装入5mL注射器内，作为有机相。以4～6mL/h的流速均匀滴入到处于800～1200rpm磁力搅拌状态的25mg/mL透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸水溶液中。将得到的上述混合溶液重新装入注射器内，以4～6mL/h的流速将溶液均匀滴入到处于800～1200rpm磁力搅拌状态的乙醇中，然后温度为40～55℃条件下旋蒸除去乙醇获得双靶向纳米颗粒。
步骤S1所述(5-羧基戊基)三苯基溴化膦与原花青素的质量比为1:10～3:10；所述(5-羧基戊基)三苯基溴化膦与N,N’-二环己基碳二亚胺质量比为2:1，所述N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为4:1～4:3；所述冷冻干燥具体条件为：真空度为1Pa，温度为-70～-50℃冷冻干燥48～96h。
步骤S2所述透明质酸与胱胺二盐酸盐的质量比为200:1～200:3；所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为5:1～5:3。
步骤S3所述硬脂酸与透明质酸-胱胺二盐酸盐的质量比为71:45～71:55；所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为197:115～197:113。
本研究以原花青素为活性因子，双亲性透明质酸为壁材，利用双重乳液旋转蒸发法制备细胞膜和线粒体双靶向的原花青素纳米颗粒，分析原花青素在不同条件下的释放情况及其在细胞或结肠炎小鼠中的分布，确定其是否存在刺激响应和双靶向功能，以及缓解炎症的效应。这可以为开发多功能载运体系提供新思路，在推进活性因子载运体系在炎症性肠病和食品领域中的实际应用具有重要作用。
下述各例中，所述原花青素的生产厂家为天津尖峰天然产物研究开发有限公司，Item#:002。
实施例1：
S1、合成线粒体靶向的(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素聚合物：
将(5-羧基戊基)三苯基溴化膦溶解在二甲基亚砜中，配制成浓度为20mg/mL的溶液，然后加入N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶室温下搅拌1h，激活(5-羧基戊基)三苯基溴化膦上的羧基。随后，加入原花青素在室温黑暗中搅拌24h。将上述混合溶液在二甲基亚砜中透析24h，在蒸馏水中透析48h，收集透析袋(透析分子量500Da)内溶液，在真空度为1Pa，温度为-50℃条件下冷冻干燥48h得到(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素聚合物。其中，所述(5-羧基戊基)三苯基溴化膦与原花青素的质量比为2:10，所述N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为4:2；
S2、合成透明质酸-胱胺二盐酸盐：
将透明质酸溶解于蒸馏水中，配制成浓度为50mg/mL的溶液，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌2h，激活透明质酸上的羧基。随后加入胱胺二盐酸盐搅拌24h。将上述混合溶液在蒸馏水中透析48h，收集透析袋(透析分子量500Da)内溶液，冷冻干燥后得到透明质酸-胱胺二盐酸盐。其中，所述透明质酸与胱胺二盐酸盐的质量比为200:2，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为5:2；
S3、合成细胞膜靶向的透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物：
将硬脂酸溶解在乙醇溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，冰水浴条件下以1200rpm搅拌1h。随后，透明质酸-胱胺二盐酸盐水溶液中添加到上述混合物中，在80℃ 800～1200rpm搅拌4～8h，然后冷却到室温继续1200rpm磁力搅拌24h。最后，将上述混合溶液在蒸馏水中透析48h，收集透析袋(透析分子量500Da)内溶液，冷冻干燥后得到透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物。其中，所述硬脂酸与透明质酸-胱胺二盐酸盐的质量比为71:50，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为197:115；
S4、制备纳米颗粒：
将步骤S1所述(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素聚合物分散在乙醇中，装入5mL注射器内，作为有机相。以5mL/h的流速将溶液均匀滴入到处于1200rpm磁力搅拌状态的25mg/mL透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸水溶液中。将得到的上述混合溶液重新装入注射器内，以5mL/h的流速将溶液均匀滴入到处于1200rpm磁力搅拌状态的乙醇中，然后温度为45℃条件下旋蒸除去乙醇获得双靶向纳米颗粒。
实施例2：
本实施例使用尼罗蓝对制备的功能因子递送体系进行荧光标记，目的是确认功能因子递送体系在细胞或动物器官中的分布情况，证明所制备的纳米颗粒是否具有靶向性；
S1、合成线粒体靶向的(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素聚合物：
将(5-羧基戊基)三苯基溴化膦溶解在二甲基亚砜中，配制成浓度为20mg/mL的溶液，然后加入N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶室温下搅拌1h，激活(5-羧基戊基)三苯基溴化膦上的羧基。随后，加入原花青素在室温黑暗中搅拌24h。将上述混合溶液在二甲基亚砜中透析24h，在蒸馏水中透析48h，收集透析袋(透析分子量500Da)内溶液，在真空度为1Pa，温度为-70℃条件下冷冻干燥96h得到(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素聚合物。其中，所述(5-羧基戊基)三苯基溴化膦与原花青素的质量比为2:10，所述N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为4:2；
S2、合成透明质酸-胱胺二盐酸盐：
将透明质酸溶解于蒸馏水中，配制成浓度为50mg/mL的溶液，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌2h，激活透明质酸上的羧基。随后加入胱胺二盐酸盐搅拌24h。将上述混合溶液在蒸馏水中透析48h，收集透析袋(透析分子量500Da)内溶液，冷冻干燥后得到透明质酸-胱胺二盐酸盐。其中，所述透明质酸与胱胺二盐酸盐的质量比为200:2，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为5:2；
S3、合成细胞膜靶向的透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物：
将硬脂酸溶解在乙醇溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，冰水浴条件下以800rpm搅拌1h。随后，透明质酸-胱胺二盐酸盐水溶液中添加到上述混合物中，在80℃下以800rpm搅拌4～8h，然后冷却到室温继续磁力搅拌24h。最后，将上述混合溶液在蒸馏水中透析48h，收集透析袋(透析分子量500Da)内溶液，冷冻干燥后得到透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物。其中，所述硬脂酸与透明质酸-胱胺二盐酸盐的质量比为71:50，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为197:115；
S4、制备纳米颗粒：
将步骤S1所述(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰原花青素聚合物分散在乙醇中，装入5mL注射器内，作为有机相。以5mL/h的流速将溶液均匀滴入到处于800rpm磁力搅拌状态的25mg/mL透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸水溶液中。将得到的上述混合溶液重新装入注射器内，以5mL/h的流速将溶液均匀滴入到处于800rpm磁力搅拌状态的乙醇中，然后温度为45℃条件下旋蒸除去乙醇获得双靶向纳米颗粒。
S5、制备荧光标记的纳米颗粒：
将步骤S4所述的双靶向纳米颗粒以原花青素浓度25mg/mL分散在水溶液中，加入2mg的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1mg的N-羟基琥珀酰亚胺，以800rpm条件磁力搅拌2h。随后，将1mg的尼罗蓝加入上述混合溶液内磁力搅拌4h，经透析和冷冻干燥得到荧光标记的纳米颗粒。
对比例1：
S1、合成透明质酸-胱胺二盐酸盐：
将透明质酸溶解于蒸馏水中，配制成浓度为50mg/mL的溶液，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌2h，激活透明质酸上的羧基。随后加入胱胺二盐酸盐搅拌24h。将上述混合溶液在蒸馏水中透析48h，收集透析袋(透析分子量500Da)内溶液，在真空度为1Pa，温度为-50℃条件下冷冻干燥48h得到透明质酸-胱胺二盐酸盐。其中，所述透明质酸与胱胺二盐酸盐的质量比为200:2，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为5:2；
S2、合成细胞膜靶向的透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物：
将硬脂酸溶解在乙醇溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，冰水浴条件下以1200rpm搅拌1h。随后，透明质酸-胱胺二盐酸盐水溶液中添加到上述混合物中，在80℃下以1200rpm搅拌4～8h，然后冷却到室温继续磁力搅拌24h。最后，将上述混合溶液在蒸馏水中透析48h，收集透析袋(透析分子量500Da)内溶液，冷冻干燥后得到透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物。其中，所述硬脂酸与透明质酸-胱胺二盐酸盐的质量比为71:50，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为197:115；
S3、制备双靶向纳米颗粒：
将原花青素分散在乙醇中，装入5mL注射器内，作为有机相。以5mL/h的流速将溶液均匀滴入到处于1200rpm磁力搅拌状态的25mg/mL透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸水溶液中。将得到的上述混合溶液重新装入注射器内，以5mL/h的流速将溶液均匀滴入到处于1200rpm磁力搅拌状态的乙醇中，然后温度为45℃条件下旋蒸除去乙醇获得双靶向纳米颗粒。
对比例2：
本实施例使用尼罗蓝对制备的功能因子递送体系进行荧光标记，目的是确认功能因子递送体系在细胞或动物器官中的分布情况，证明所制备的纳米颗粒是否具有靶向性；
S1、合成透明质酸-胱胺二盐酸盐：
将透明质酸溶解于蒸馏水中，配制成浓度为50mg/mL的溶液，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌2h，激活透明质酸上的羧基。随后加入胱胺二盐酸盐搅拌24h。将上述混合溶液在蒸馏水中透析48h，收集透析袋(透析分子量500Da)内溶液，在真空度为1Pa，温度为-70℃条件下冷冻干燥96h得到透明质酸-胱胺二盐酸盐。其中，所述透明质酸与胱胺二盐酸盐的质量比为200:2，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为5:2；
S2、合成细胞膜靶向的透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物：
将硬脂酸溶解在乙醇溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，冰水浴条件下以800rpm搅拌1h。随后，透明质酸-胱胺二盐酸盐水溶液中添加到上述混合物中，在80℃下以800rpm搅拌4～8h，然后冷却到室温继续磁力搅拌24h。最后，将上述混合溶液在蒸馏水中透析48h，收集透析袋(透析分子量500Da)内溶液，冷冻干燥后得到透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物。其中，所述硬脂酸与透明质酸-胱胺二盐酸盐的质量比为71:50，所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为197:115；
S3、制备双靶向纳米颗粒：
将原花青素分散在乙醇中，装入5mL注射器内，作为有机相。以5mL/h的流速将溶液均匀滴入到处于800rpm磁力搅拌状态的25mg/mL透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸水溶液中。将得到的上述混合溶液重新装入注射器内，以5mL/h的流速将溶液均匀滴入到处于800rpm磁力搅拌状态的乙醇中，然后温度为45℃条件下旋蒸除去乙醇获得双靶向纳米颗粒。
S4、制备荧光标记的纳米颗粒：
将步骤S3所述的双靶向纳米颗粒以原花青素浓度25mg/mL分散在水溶液中，加入2mg的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1mg的N-羟基琥珀酰亚胺，磁力搅拌2h。随后，将1mg的尼罗蓝加入上述混合溶液内磁力搅拌4h，经透析和冷冻干燥得到荧光标记的纳米颗粒。
对上述各例制备的功能因子载运体系的微观结构、包埋率、刺激释放、细胞和动物器官中的分布、结肠长度等进行分析。
图1为对比例1制备的功能因子载运体系透射电镜图，从图中可以看出制备的功能因子载运体系为发散状的球形结构；图2为实施例1制备的功能因子载运体系透射电镜图，该载运体系为球形结构，尺寸高于对比例2制备的递送体系。
表1、对比例1和实施例1制备的功能因子载运体系的基本指标
表1为对比例1和实施例1制备的功能因子载运体系的基本指标表征。以原花青素在280nm处特征吸收峰值为测量值，测定浓度范围为0.01～0.04mg/mL的原花青素浓度，获得原花青素的标准曲线为y＝17.107x-0.1053(x表示原花青素的浓度，y吸光值)，R2＝0.9978；通过测定对比例1样品上清液在280nm特征吸收峰值，结合所述标准曲线计算上清液中原花青素的浓度，原花青素的包埋率＝1-上清液原花青素浓度/总原花青素浓度。实施例测定的计算得出对比例1制备的活性因子载运体系中原花青素的包埋率为75.63％。实施例1(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰的原花青素的标准曲线为y＝14.171x-0.1211，R2＝0.9981；计算得出实施例1制备的活性因子载运体系中原花青素的包埋率为88.64％。接着采用激光粒度仪测定对比例1和实施例1中功能因子载运体系的水力学直径和电位，与对比例1相比，实施例1制备的活性因子载运体系由于修饰(5-羧基戊基)三苯基溴化膦粒径相对较大，为527nm；对比例1制备的功能因子载运体系带负电荷，为-44.00±3.82mV，实施例1制备的活性因子载运体系zeta电位为-46.55±1.20mV。
图3为对比例1制备的功能因子载运体系在谷胱甘肽和pH条件下体外释放情况。在pH为7.4条件下，载运体系中原花青素的释放率随时间的延长而增加，7天后约有43.71％的原花青素释放。在谷胱甘肽浓度为10mM(pH 7.4)条件下，孵育7天后，原花青素的释放率可达到53.96％。图4为实施例1制备的功能因子载运体系在谷胱甘肽和pH条件下体外释放情况，(5-羧基戊基)三苯基溴化膦修饰的原花青素的释放趋势与对比例1类似，且释放率高于对比例1。
图5为本发明对比例2中采用红色荧光探针标记RAW264.7巨噬细胞内线粒体；图6为本发明对比例2荧光标记的递送体系在RAW264.7巨噬细胞内线粒体的分布；图7为本发明对比例2红色荧光探针标记的线粒体与递送体系在RAW264.7巨噬细胞内分布叠加图。对比例2制备的荧光标记的功能因子载运体系在线粒体内绿色荧光强度相对较弱，但能与线粒体红色荧光探针标记的线粒体荧光重叠，表明递送体系可以在线粒体内聚集。
图8为本发明实施例2中采用红色荧光探针标记RAW264.7巨噬细胞内线粒体；图9为本发明实施例2荧光标记的递送体系在RAW264.7巨噬细胞内线粒体的分布；图10为本发明实施例2红色荧光探针标记的线粒体与递送体系在RAW 264.7巨噬细胞内分布叠加图。实施例2制备的荧光标记的功能因子载运体系在线粒体内绿色荧光强度高于对比例2，与线粒体红色荧光探针标记的线粒体荧光重叠，表明具有(5-羧基戊基)三苯基溴化膦靶向部分的递送体系在线粒体中具有较好的积累作用。
为了追踪递送体系在小鼠体内的生物分布和靶向能力，采用实施例2制备的荧光递送体系为样本，小鼠口服给药6h后，记录健康组和DSS组主要脏器(1～7：心、肝、脾、肺、肾、睾丸、结肠)的荧光图像。图11表明在健康小鼠结肠中观察到较弱的荧光，表明递送体系在结肠组织中积累较少。而图12表明经葡聚糖硫酸钠盐诱导5天后的结肠炎小鼠结肠长度变短，结肠荧光强度明显增加，肝脏和睾丸内荧光信号增加。这些结果可能与炎症部位过表达CD44受体有关，而递送体系由于透明质酸的引入而在炎症部位表现出增强的聚集效应，透明质酸与炎症部位表达的CD44相互作用。
图13为本发明合成的壁材透明质酸-胱胺二盐酸盐-硬脂酸聚合物，对比例1和实施例1制备的功能因子递送体系预处理对4％葡聚糖硫酸钠盐诱导的结肠炎小鼠的结肠长度的影响。结果表明，与健康组小鼠结肠长度相比，葡聚糖磷酸钠盐(DSS)诱导的小鼠结肠长度显著变短，而经对比例1和实施例1干预后，能显著改善结肠长度的缩短。与对比例1相比，实施例1的干预效果更为明显。说明载运体系对结肠炎小鼠的结肠长度具有改善作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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