阅读说明：本技术 信使rna的干粉制剂 (Dry powder formulations of messenger RNA ) 是由 S·卡夫 F·德罗莎 M·哈特莱因 Z·帕特尔 A·萨罗德 于 2019-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了用于治疗用途的稳定的干粉信使RNA制剂,以及它们的制备和使用方法。(The present invention provides stable dry powder messenger RNA formulations for therapeutic use, as well as methods for their preparation and use.)

信使RNA的干粉制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年7月23日提交的美国临时专利申请号62/702,193的优先权；该临时专利申请以引用的方式整体并入本文。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式以电子方式提交并且据此以引用的方式整体并入的序列表。2019年7月19日创建的所述ASCII副本被命名为MRT_2008WO_SeqListing.txt，大小为1137字节。

背景技术

信使RNA疗法(MRT)正在成为治疗多种疾病的越来越重要的方法。脂质包封的mRNA制剂，诸如脂质纳米颗粒(LNP)组合物显示出高度的细胞摄取和蛋白质表达。然而，目前这些制剂通常为液体形式，并且需要通常以注射形式或经由雾化器施用。与一些侵入性较小的途径(例如，定量吸入器)相比，这些施用方式是患者不太期望的。冻干制剂有时在干燥状态下不提供可靠的颗粒均匀性，或者难以处理和分配。冻干粉末在分配给患者之前必须溶解于适当的溶剂中，并且可以在几个小时内降解。mRNA制备物的重复冷冻解冻是不推荐的，因为这可能导致mRNA和/或LNP不稳定。

发明内容

本发明特别提供了用于更有效的mRNA递送和更有效的mRNA疗法的基于脂质的纳米颗粒包封的mRNA的干粉(即，喷雾干燥)制剂。在本发明之前，喷雾干燥脂质纳米颗粒包封的mRNA的挑战之一来自以下事实：mRNA和脂质纳米颗粒组分二者在适当的喷雾干燥所需的高温和/或压力下在结构上是不稳定的。例如，喷雾干燥器的入口温度的范围在80℃至98℃之间。在喷嘴处或附近，脂质倾向于在高入口温度下熔化和/或聚集。这阻碍了制剂通过喷嘴进入干燥室的流动，破坏了喷雾的均匀分散，并且产生了不期望的颗粒特性和较差的收率。本发明通过将聚合物添加至mRNA和脂质纳米颗粒混合物，然后使混合物进行喷雾干燥过程，已经出乎意料地解决了该问题。如本文所述，本发明人观察到，将聚合物添加至mRNA和脂质混合物可有效地防止脂质纳米颗粒的聚集，并且有助于含有适用于吸入的负载mRNA的脂质纳米颗粒的细颗粒的干粉形成。

更出乎意料的是，虽然mRNA的性质极其不稳定，但是根据本发明制备的干粉制剂，即使在与喷雾干燥相关的高温和/或高压下也是稳定的，并且即使在各种温度下长期储存后也能够维持高度的mRNA完整性。此外，根据本发明制备的干粉制剂还具有mRNA的高LNP包封效率的特征，从而产生mRNA的高细胞递送率。因此，本发明满足了在mRNA疗法领域中对稳定的干粉形式的mRNA治疗剂的长期需要，所述mRNA治疗剂可以是易于储存、转移和分配的。此外，根据本发明的mRNA的干粉制剂可以以干粉形式(例如以计量剂量)施用于患者或称出以及以单次使用量复原，而无需冷冻单次使用的液体等分试样。

在一个方面，本发明提供了用于递送信使RNA(mRNA)的干粉制剂，所述干粉制剂含有多个喷雾干燥的颗粒，所述颗粒包含编码蛋白质或肽的mRNA、一种或多种脂质以及一种或多种聚合物。

在另一个方面，本发明提供了用于递送信使RNA(mRNA)的干粉制剂，所述干粉制剂含有多个喷雾干燥的颗粒，所述颗粒包含一种或多种包封编码肽或多肽的mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)以及一种或多种聚合物。

在又一个方面，本发明提供了用于递送信使RNA(mRNA)的干粉制剂，所述干粉制剂含有多个喷雾干燥的颗粒，所述颗粒包含一种或多种包封编码肽或多肽的mRNA的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含一种或多种脂质以及一种或多种聚合物。

在又一个方面，本发明提供了用于递送囊性纤维化传导调节因子(CFTR)信使RNA(mRNA)的干粉制剂，所述干粉制剂含有多个喷雾干燥的颗粒，所述颗粒包含编码CFTR蛋白的mRNA、一种或多种脂质以及一种或多种聚合物。在一些实施方案中，一种或多种脂质形成一种或多种包封编码CFTR蛋白的mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施方案中，一种或多种脂质和一种或多种聚合物形成一种或多种包封编码CFTR蛋白的mRNA的纳米颗粒。

如本申请中所用，脂质纳米颗粒(LNP)涵盖由脂质形成的纳米颗粒，以及由脂质和聚合物二者形成的纳米颗粒。在一些实施方案中，由脂质和聚合物二者形成的纳米颗粒被称为脂质-聚合物纳米颗粒。

在一些实施方案中，mRNA(例如，CFTR mRNA)具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或者99％或更高的完整性。在一些实施方案中，mRNA(例如，CFTR mRNA)具有90％或更高的完整性。在一些实施方案中，mRNA(例如，CFTR mRNA)具有95％或更高的完整性。在一些实施方案中，mRNA(例如，CFTR mRNA)具有98％或更高的完整性。

在一些实施方案中，在室温或低于室温储存6个月或更长时间后，mRNA维持90％或更高的完整性。在一些实施方案中，在室温或低于室温储存6个月或更长时间后，mRNA维持95％或更高的完整性。在一些实施方案中，在室温或低于室温储存6个月或更长时间后，mRNA维持98％或更高的完整性。

在一些实施方案中，在喷雾干燥和在室温或低于室温储存三个月或更长时间后，mRNA维持或大于90％的完整性。在一些实施方案中，在喷雾干燥和在室温或低于室温储存六个月或更长时间后，mRNA维持或大于90％的完整性。在一些实施方案中，在喷雾干燥和在室温或低于室温储存九个月或更长时间后，mRNA维持或大于90％的完整性。在一些实施方案中，在喷雾干燥和在室温或低于室温储存十二个月或更长时间后，mRNA维持或大于90％的完整性。在一些实施方案中，在喷雾干燥和在4℃或以下储存三个月或更长时间后，mRNA维持或大于90％的完整性。在一些实施方案中，在喷雾干燥和在4℃或以下储存六个月或更长时间后，mRNA维持或大于90％的完整性。在一些实施方案中，在喷雾干燥和在4℃或以下储存九个月或更长时间后，mRNA维持或大于90％的完整性。在一些实施方案中，在喷雾干燥和在4℃或以下储存十二个月或更长时间后，mRNA维持或大于90％的完整性。在一些实施方案中，在室温或低于室温储存3个月或更长时间、6个月或更长时间、9个月或更长时间或者12个月或更长时间后，mRNA维持或大于95％的完整性。在一些实施方案中，在4℃或以下储存3个月或更长时间、6个月或更长时间、9个月或更长时间或者12个月或更长时间后，mRNA维持或大于95％的完整性。

在一些实施方案中，多个喷雾干燥的颗粒中的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％是细颗粒的一部分。在一些实施方案中，多个喷雾干燥的颗粒中的至少20％是细颗粒的一部分。

在一些实施方案中，细颗粒具有的体积中值直径为5微米或更小。在一些实施方案中，细颗粒具有的体积中值直径为4微米或更小。在一些实施方案中，细颗粒具有的体积中值直径为3微米或更小。在一些实施方案中，细颗粒具有的体积中值直径为2微米或更小。在一些实施方案中，细颗粒具有的体积中值直径为1微米或更小。

在一些实施方案中，多个喷雾干燥的颗粒具有的平均球形度大于0.6、大于0.7、大于0.8或大于0.9。在一些实施方案中，多个喷雾干燥的颗粒具有的Z-平均粒径小于3,000nm、2,500nm、2,000nm、1,500nm、1,000nm或500nm。

在一些实施方案中，多个喷雾干燥的颗粒包含的残留水分含量小于20％、小于18％、小于16％、小于14％、小于12％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％。

在一些实施方案中，干粉制剂是可吸入的。在一些实施方案中，干粉制剂作为定量吸入器中的干粉吸入。在一些实施方案中，干粉制剂用稀释剂复原并且通过雾化施用。

在一些实施方案中，一种或多种聚合物占脂质和聚合物的组合重量的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占脂质和聚合物的组合重量的约10％-90％、10％-80％、10％-70％、10％-60％、10％-50％、10％-40％、10％-30％、10％-20％、15％-20％、15％-25％、15％-30％、15％-35％、15％-40％、15％-45％、15％-50％、15％-55％、15％-60％、15％-65％、15％-70％、15％-75％、15％-80％或15％-90％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占脂质和聚合物的组合重量的不超过90％、80％、70％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％。

在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少50％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少40％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少30％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少20％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少15％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少12％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少10％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少9％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少8％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少7％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少6％。在一些实施方案中，一种或多种聚合物占干粉的总重量的至少5％。

在一些实施方案中，一种或多种聚合物选自由以下项组成的组：壳聚糖、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚(q-己内酯)(PCL)、聚酰胺-胺、聚酯、聚碳酸酯、聚(羟基烷基L-天冬酰胺)、聚(羟基烷基L-谷氨酰胺)、聚(2-烷基噁唑啉)丙烯酸酯、改性丙烯酸酯和基于聚甲基丙烯酸酯的聚合物、聚-N-(2-羟基-丙基)甲基丙烯酰胺、聚-2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱、聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱)和聚(甲基丙烯酸二甲基氨基乙基酯)(pDMAEMA)。

在一些实施方案中，一种或多种聚合物包括基于聚甲基丙烯酸酯的聚合物。在一些实施方案中，一种或多种聚合物包括Eudragit EPO。

在一些实施方案中，一种或多种包封mRNA的LNP(也称为负载mRNA的LNP)具有的脂质:mRNA(N/P)比在1-20、1-15、1-10、2-8、2-6或2-4的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在1至20的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在1至18的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在1至16的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在1至14的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在1至12的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在1至10的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在1至8的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在1至6的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在2至20的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在2至16的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在2至12的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在2至8的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在2至6的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在2至4的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在4至20的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在4至16的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在4至14的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在4至12的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的脂质:mRNA(N/P)比在4至10的范围内。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的LNP具有的脂质:mRNA(N/P)比为2或4。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的LNP具有的脂质:mRNA(N/P)比为2。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的LNP具有的脂质:mRNA(N/P)比为4。

在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的包封效率为70％或更高。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的包封效率为75％或更高。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的包封效率为80％或更高。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的包封效率为85％或更高。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的包封效率为90％或更高。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的包封效率为92％或更高。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的包封效率为94％或更高。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的包封效率为95％或更高。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的包封效率为96％或更高。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的包封效率为97％或更高。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的包封效率为98％或更高。

在一些实施方案中，一种或多种脂质包括阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质选自由以下项组成的组：C12-200、DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷)、DODAP(1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷)、DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA、DLin-KC2-DMA、HGT4003、cKK-E12、ICE以及它们的组合。

在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括可电离的阳离子脂质。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质C12-200。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质DODAP(1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质DLinDMA。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质DLin-KC2-DMA。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质HGT-5000。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质HGT-5001。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质HGT-5002。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质cKK-E12。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质OF-02。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质靶标23。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质化合物1。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质化合物2。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质化合物3。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质HGT4001。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质HGT4002。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质HGT4003。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质HGT4004。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质HGT4005。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质18:1碳尾核糖脂质。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括阳离子脂质ICE。

在一些实施方案中，以摩尔浓度计，阳离子脂质占LNP中的总脂质的约25％-50％。

在一些实施方案中，一种或多种脂质包括PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒包含一种或多种PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，一种或多种PEG修饰的脂质包含长度为最多5kDa的聚(乙二醇)链，所述聚(乙二醇)链共价连接至包含长度为C6-C20的一个或多个烷基链的脂质。在一些实施方案中，一种或多种PEG修饰的脂质占LNP中的总脂质的最多20％、15％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(以摩尔浓度计)。在一些实施方案中，以摩尔浓度计，PEG修饰的脂质占LNP中的总脂质的约1％-15％。在一些实施方案中，以摩尔浓度计，PEG修饰的脂质占LNP中的总脂质的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、8％、10％或12％。

在一些实施方案中，根据本发明的合适的LNP是双脂质组分LNP。

在一些实施方案中，一种或多种脂质不包括中性脂质或基于胆固醇的脂质。

在一些实施方案中，一种或多种脂质还包括中性脂质和/或基于胆固醇的脂质。在一些实施方案中，一种或多种脂质还包括中性脂质。

在一些实施方案中，根据本发明的合适的LNP是三脂质组分LNP。

在一些实施方案中，根据本发明的干粉制剂还包含至少一种糖。在一些实施方案中，糖选自由以下项组成的组：单糖、二糖、多糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、葡聚糖、麦芽糖糊精、环糊精、菊粉、木糖醇、山梨糖醇、乳糖醇、甘露糖醇以及它们的组合。在一些实施方案中，糖是甘露糖醇。在一些实施方案中，糖占总重量的小于30％、25％、20％、15％、10％或5％。

在一些实施方案中，根据本发明的干粉制剂还包含由以下项组成的组的药学上可接受的赋形剂：酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、磷腈、氨基酸、胶原蛋白、壳聚糖、多糖、白蛋白、表面活性剂、缓冲剂、盐以及它们的组合。

在一些实施方案中，合适的表面活性剂选自由以下项组成的组：CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)、磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、八乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十二烷基醚、Triton X-100、椰油酰胺单乙醇胺、椰油酰胺二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单月桂酸脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸脱水山梨糖醇酯、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、烷基聚葡萄糖苷和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆407)。在一些实施方案中，合适的表面活性剂是泊洛沙姆。

在一些实施方案中，根据本发明的干粉制剂还含有药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂选自由以下项组成的组：酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、磷腈、氨基酸、胶原蛋白、壳聚糖、多糖、白蛋白、表面活性剂、缓冲剂、盐以及它们的组合。

在一些实施方案中，根据本发明的干粉制剂含有表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂选自由以下项组成的组：CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)、磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、八乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十二烷基醚、Triton X-100、椰油酰胺单乙醇胺、椰油酰胺二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单月桂酸脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸脱水山梨糖醇酯、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、烷基聚葡萄糖苷和共聚物。在一些实施方案中，表面活性剂是泊洛沙姆。在一些实施方案中，表面活性剂是泊洛沙姆三嵌段共聚物，所述三嵌段共聚物由两个亲水性聚乙二醇(PEG)嵌段侧接的中心疏水性聚丙二醇嵌段组成。在一些实施方案中，表面活性剂是泊洛沙姆407。

在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的最多10％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的最多9％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的最多8％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的最多7％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的最多6％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的最多5％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的最多4％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的最多3％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的最多2％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的1％-10％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的1％-6％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的1％-5％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的1％-4％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的1％-3％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的2％-10％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的2％-9％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的2％-8％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的2％-7％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的2％-6％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的2％-5％。在一些实施方案中，mRNA是未经修饰的。在一些实施方案中，mRNA含有一种或多种经修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，mRNA编码肽。在一些实施方案中，mRNA编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是CFTR。

在一些实施方案中，CFTR mRNA占喷雾干燥的颗粒的总重量的约1％-20％、1％-15％、1％-10％、1％-8％、1％-6％、1％-5％、5％-15％或5％-10％。在一些实施方案中，CFTR mRNA占喷雾干燥的颗粒的总重量的约1％、2％、3％、4％、5％、7.5％、10％、12.5％或15％。

在另一个方面，本发明提供了一种递送用于体内表达的囊性纤维化传导调节因子(CFTR)信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括将本文所述的干粉制剂施用于有需要的受试者的步骤。在一些实施方案中，本文所述的干粉制剂通过肺部递送来施用。在一些实施方案中，干粉制剂通过吸入来施用。

在另一个方面，本发明提供了一种递送用于体内表达的囊性纤维化传导调节因子(CFTR)信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括以下步骤：将本文所述的干粉制剂复原为液体溶液；以及将复原的液体溶液施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，复原的液体溶液通过雾化来施用。在一些实施方案中，受试者患有囊性纤维化。

在另一个方面，本发明提供了一种用于制造干粉制剂的方法，所述方法包括提供包含mRNA、一种或多种脂质和聚合物的混合物；以及将混合物喷雾干燥以形成多个颗粒。

在一些实施方案中，在添加聚合物前，首先将一种或多种脂质与mRNA混合以形成负载mRNA的脂质纳米颗粒。

在一些实施方案中，根据本发明的方法还包括在喷雾干燥前将一种或多种赋形剂添加至混合物。

在一些实施方案中，多个喷雾干燥的颗粒的特征在于以下中的一者或多者：a)水分含量小于10％；b)一部分细颗粒的体积中值直径小于5微米；c)Z-平均粒径的范围为10-3000nm；d)N/P比的范围为1至20；e)mRNA包封效率大于80％；以及f)mRNA完整性大于95％。

在又一个方面，本发明提供了一种体内递送mRNA的方法，所述方法包括将本文所述的干粉制剂施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，干粉制剂经由口服、鼻腔、气管、肺部或直肠途径施用。在一些实施方案中，干粉制剂通过吸入来施用。在一些实施方案中，干粉制剂通过鼻内喷雾来施用。在一些实施方案中，制剂通过定量吸入器来施用。在一些实施方案中，制剂通过雾化器来施用。

在另一个方面，本发明提供了一种递送用于体内表达的囊性纤维化传导调节因子(CFTR)信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括将本文所述的干粉制剂施用于有需要的受试者的步骤。

在又一个方面，本发明提供了一种通过将有效剂量的本文所述的干粉制剂中的mRNA施用于患者来治疗患者的疾病或障碍的方法。在一些实施方案中，所述疾病或障碍选自囊性纤维化；哮喘；COPD；气肿；原发性纤毛运动障碍(CILD1)伴或不伴内脏逆位、或卡塔格纳(Kartagener)综合征；肺纤维化；比尔特-霍格-杜布(Birt-Hogg-Dube)综合征；遗传性出血性毛细血管扩张；α-1抗胰蛋白酶缺乏；细胞色素b阳性肉芽肿病(CGD，X连锁)；常染色体隐性细胞色素b阳性肉芽肿病；表面活性物质缺乏症、肺表面活性物质代谢功能障碍1、肺表面活性物质代谢功能障碍2、肺表面活性物质代谢功能障碍3；早产儿呼吸窘迫综合征；结核病、肺病毒病，包括流感、呼吸道合胞病毒(RSV)。

本发明另外的目的和优点将会在接下来的描述中部分阐明，部分将会从描述中显而易见，或可通过本发明的实践而了解。凭借所附权利要求书中特别指出的要素和组合，将会实现并获得本发明的目的和优点。

应当理解，上文的一般性描述和下文的

具体实施方式

都只是示例性和说明性的，并不是对权利要求保护的本发明进行限制。

并入本说明书中并占本说明书的一部分的附图展示了本发明的若干实施方案，并与描述一起用来解释本发明的原理。

附图说明

附图仅用于说明性目的，而不是限制。

图1显示了mRNA制剂的喷雾干燥技术的示例性图解说明。

图2显示了在制剂中不具有和具有聚合物的情况下，在喷雾干燥后LNP包封的mRNA材料的回收百分比。

图3描绘了用于完整性评估的mRNA参考的分光光度分析。

图4描绘了示例性数据，这些数据展示了在从脂质纳米颗粒提取后mRNA的完整性。

图5描绘了示例性数据，这些数据展示了在喷雾干燥和在4℃下储存后两周，在具有聚合物的制剂中，包封于LNP中的mRNA的完整性。

图6描绘了示例性数据，这些数据展示了在喷雾干燥和在-20℃下储存后两周，在具有聚合物的制剂中，包封于LNP中的mRNA的完整性。

图7描绘了示例性数据，这些数据显示了在具有聚合物的制剂中，储存温度对包封于LNP中的mRNA的完整性无影响，并且在喷雾干燥后储存两周。

图8描绘了示例性数据，这些数据展示了在喷雾干燥和在4℃下储存后四周，在具有聚合物的制剂中，包封于LNP中的mRNA的完整性。

图9描绘了示例性数据，这些数据展示了在喷雾干燥和在-20℃下储存后四周，在具有聚合物的制剂中，包封于LNP中的mRNA的完整性。

图10描绘了示例性数据，这些数据展示了在喷雾干燥、4℃下储存后三周，在具有聚合物(不具有LNP)的制剂中mRNA的完整性。

图11描绘了示例性数据，这些数据展示了在喷雾干燥、-20℃下储存后三周，在具有聚合物(不具有LNP)的制剂中mRNA的完整性。

图12描绘了示例性数据，这些数据展示了储存温度对使用聚合物(不具有LNP)配制的mRNA的完整性无影响，并且在喷雾干燥后储存三周。

图13描绘了示例性数据，这些数据展示了在喷雾干燥、4℃下储存后五周，在具有聚合物(不具有LNP)的制剂中mRNA的完整性。

图14描绘了示例性数据，这些数据展示了在喷雾干燥、-20℃下储存后五周，在具有聚合物(不具有LNP)的制剂中mRNA的完整性。

图15A和图15B显示了在小鼠中施用mRNA喷雾干燥制备物后，通过生物发光测量的示例性体内mRNA表达。使用1mg施用萤光素酶mRNA。对于图15A，mRNA以干粉形式施用。对于图15B，在干粉溶解于水中后，mRNA以液体形式施用。

图16A1-A6描绘了示例性毛细管电泳色谱图，该色谱图展示了在喷雾干燥后CFTRmRNA的完整性。图16A1-A3描绘了既未喷雾干燥也未包封的对照CFTR mRNA，而图16A4-A6描绘了从喷雾干燥制剂中提取的CFTR mRNA。

定义

为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。以下术语和其他术语的其他定义阐述在整个说明书中。

动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆物。

大约或约：如本文所用，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”指落入所述值任一方向(大于或小于)中的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的100％)。

递送：如本文所用，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送。例如，mRNA的递送涵盖其中将mRNA递送至靶组织并且编码的蛋白质在靶组织内表达且保留的情况(也称为“局部分布”或“局部递送”)，以及其中将mRNA递送至靶组织并且编码的蛋白质表达且分泌到患者的循环系统(例如血清)内，并且全身分布且被其他组织吸收的情况(也称为“全身分布”或“全身递送”)。

包封：如本文所用，术语“包封”或语法等同形式是指将单独的mRNA分子限制在纳米颗粒内的过程。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指mRNA翻译成多肽，将多个多肽组装成完整蛋白质(例如酶)和/或多肽或完全组装的蛋白质(例如酶)的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”以及语法上的等同术语可互换使用。

改进、增加或减少：如本文所用，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等同项表示相对于基线测量值，诸如在本文所述治疗开始之前同一个体的测量值，或在没有本文所述治疗的情况下对照受试者(或多个对照受试者)的测量值的值。“对照受试者”是患有与所治受试者相同形式的疾病，其年龄与所治受试者大约相同的受试者。

体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。

体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体诸如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，该术语可用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。

局部分布或递送：如本文使用的，术语“局部分布”、“局部递送”或语法等价物指组织特异性递送或分布。通常，局部分布或递送需要由mRNA编码的蛋白质(例如酶)在细胞内或伴随有限分泌被翻译且表达，其避免进入患者的循环系统。

信使RNA(mRNA)：如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文所用，mRNA涵盖经修饰的和未经修饰的RNA二者。mRNA可以含有一个或多个编码和非编码区。mRNA可以从天然来源纯化，使用重组表达系统来产生和任选地纯化，化学合成等。在适当情况下，例如在化学合成分子的情况下，mRNA可以包含核苷类似物，诸如具有经化学修饰的碱基或糖、主链修饰的类似物等。除非另有说明，否则mRNA序列的显示方向为5’至3’。在一些实施方案中，mRNA是或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟苷和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；插入的碱基；改性糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键)。

N/P比：如本文所用，术语“N/P比”是指脂质纳米颗粒中的阳离子脂质中的带正电的分子单元相对于包封于脂质纳米颗粒内的mRNA中的带负电的分子单元的摩尔比。因此，N/P比通常以脂质纳米颗粒中的阳离子脂质中的胺基团的摩尔数相对于包封于脂质纳米颗粒内的mRNA中的磷酸基团的摩尔数之比计算。

患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指可以例如出于实验目的、诊断目的、预防目的、美容目的和/或治疗目的向其施用所提供的组合物的任何生物体。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人类灵长类和/或人类)。在一些实施方案中，患者是人。人包括产前和产后。

药学上可接受的：如本文所使用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理效益/风险比相称的物质。

皮下施用：如本文所用，术语“皮下施用”或“皮下注射”是指向皮下组织进行推注，所述皮下组织是皮肤和肌肉之间的组织层。

受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，该患者是指向医疗提供者提出进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以患有疾病或病症或对疾病或病症敏感，但是可以或可以不显示出该疾病或病症的症状。

治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”是指当施用于患有疾病、病症和/或病状或对疾病、病症和/或病状敏感的受试者时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟该疾病、病症和/或病状的症状发作的量。本领域的普通技术人员将认识到，通常通过包含至少一个单位剂量的给药方案来施用治疗有效量。

治疗：如本文所用，术语“治疗”是指用于使特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征部分或完全缓解、转佳、减轻，抑制、预防、延迟其发作，降低其严重性和/或降低其发病率的任何方法。为了降低发展与疾病关联的病理的风险，可以向未表现出疾病体征和/或仅表现出疾病早期体征的受试者施用治疗。

具体实施方式

本发明提供了用于治疗用途的稳定的干粉制剂，所述干粉制剂含有负载mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)。具体而言，本发明提供了用于递送mRNA的干粉制剂，所述干粉制剂包含多个喷雾干燥的颗粒，每个喷雾干燥的颗粒包含一种或多种负载mRNA的脂质纳米颗粒和聚合物，以及它们的制备和使用方法。

在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。部分的使用并不意在限制本发明。每个部分可以适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。

喷雾干燥方法

各种喷雾干燥方法均可以用于实践本发明。通常，所述方法涉及通过使液体形式的组合物通过设备来从组合物中除去水分；图1提供了简化的示意图。简而言之，使包含所关注的组合物的液体制剂通过狭窄的入口喷雾“雾化器”嘴进入第一室，第一室为干燥室。通常，液体制剂以稳定流通过。液体制剂以微小液滴形式喷入干燥室。加热的空气或气体流也被引入干燥室以形成气流。制剂通过该加热流的流动使进入的液滴分散，将它们干燥为固体颗粒形式。该产物通过连接器或管道的流动被引入第二室。第二室是气旋粉末收集器。此处，空气循环产生气旋，粉末颗粒通过涡旋流被收集到附接至出口端的收集容器中。气旋室附接至排气扇，这有助于冷却组分。入口和出口温度可由操作者调节。适当地调节相应的入口和出口温度、室内温度、液体进料流速(抽吸器％)、压力、加热的空气流的性质以及最重要地液体进料的组成，以便进行任何颗粒物质的最佳干燥。

在一些实施方案中，入口温度可在40℃至200℃的范围内调节。在一些实施方案中，出口温度在20℃-70℃之间的范围内。泵和抽吸器的相对压力也可由操作者调节。在一些实施方案中，对于喷雾干燥mRNA-脂质纳米颗粒，入口温度在70℃和200℃之间调节。在一些实施方案中，入口温度在80℃和200℃之间调节。在一些实施方案中，入口温度在90℃和200℃之间调节。在一些实施方案中，入口温度在95℃和180℃之间调节。在一些实施方案中，入口温度在95℃和160℃之间调节。在一些实施方案中，入口温度在90℃和150℃之间调节。在一些实施方案中，入口温度在90℃和120℃之间调节。在一些实施方案中，入口温度在90℃和100℃之间调节。在一些实施方案中，入口温度为70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃。

进入干燥室的抽吸百分比通常在50％和100％之间调节。在一些实施方案中，进入干燥室的抽吸百分比在50％和100％之间调节。在一些实施方案中，进入干燥室的抽吸百分比在60％和100％之间调节。在一些实施方案中，进入干燥室的抽吸百分比在70％和100％之间调节。在一些实施方案中，进入干燥室的抽吸百分比在80％和100％之间调节。在某些实施方案中，抽吸百分比在80％和90％之间调节。在一些实施方案中，抽吸百分比等于或小于100％、或者等于或小于95％、或者等于或小于90％、或者等于或小于85％、或者等于或小于80％。

在一些实施方案中，通过入口进入干燥室的液体流由泵调节，并且被设置为在10％-50％之间的范围内。在一些实施方案中，泵被设置为在20％和40％之间的范围内。在一些实施方案中，泵被设置为在10％和30％之间的范围内。在一些实施方案中，泵被设置为在20％和30％之间的范围内。在一些实施方案中，泵被设置为在30％和50％之间的范围内。在一些实施方案中，泵被设置为25％。

在一些实施方案中，出口温度在20℃至70℃之间的范围内。在一些实施方案中，出口温度在30℃至60℃之间。在一些实施方案中，出口温度在20℃至50℃之间。在一些实施方案中，出口温度在30℃至50℃之间。在一些实施方案中，出口温度在40℃至50℃之间。在一些实施方案中，出口温度在45℃和50℃之间。

mRNA-LNP的喷雾干燥可以使用任何合适的喷雾干燥装置进行。如本领域的普通技术人员所已知，很多喷雾干燥仪器是商购获得的并且可以用于实践本发明。适用于本发明的示例性商购获得的装置包括但不限于以下装置：微型喷雾干燥器B-290；纳米喷雾干燥器B-90(由Buchi制造)；脱水MicraSpray干燥器GMP；脱水MicraSpray干燥器无菌系列(由SPXFLOW制造)；MDL-50和MDL-015(由Fujisaki Electric制造)；多功能微型喷雾干燥器GAS410(由Yamato Scientific America制造)；LSD-1500微型喷雾干燥器、MSD-8多功能实验室喷雾干燥器；PSD-12精密制药喷雾干燥器(由常州市先导干燥设备有限公司制造)；高型干燥器^TM；多级干燥器；紧凑型干燥器^TM；FILTERMAT喷雾干燥器；多功能-SD^TM；流化喷雾干燥器；移动小型^TM；SDMICRO^TM；生产小型^TM(由GEA Process Engineering制造)等等。这些制造商中的一些也可以方便地从实验室规模扩大到工业制造规模。

喷雾干燥负载mRNA的纳米颗粒

根据本发明，喷雾干燥负载mRNA的纳米颗粒涉及将聚合物添加至mRNA和脂质混合物。在一些实施方案中，在添加聚合物前，首先将脂质和mRNA混合，以预形成负载mRNA的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，将脂质、mRNA和聚合物同时混合。在一些实施方案中，根据本发明的方法还包括在喷雾干燥前将一种或多种赋形剂添加至混合物。

负载mRNA的脂质纳米颗粒

任何所需脂质可以任何适合于包封mRNA的比率混合。在一些实施方案中，合适的脂质混合物含有阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG化的脂质。在一些实施方案中，合适的脂质混合物还含有基于胆固醇的脂质。在一些实施方案中，首先通过将mRNA和脂质混合，然后与聚合物或其他赋形剂混合，并且使混合物进行喷雾干燥来形成mRNA-LNP。

在一些实施方案中，通过将mRNA溶液与脂质溶液混合来形成mRNA-LNP，其中在混合之前将mRNA溶液和/或脂质溶液加热至高于环境温度的预定温度(参见标题为“信使RNA的包封”的美国专利No.9,668,980，该专利的公开内容据此整体并入)。

在一些实施方案中，通过将预形成的脂质纳米颗粒与mRNA组合来形成mRNA-LNP(参见美国专利申请公开No.2018/0153822，该专利申请的公开内容据此以引用的方式并入)。

在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为70％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为75％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为80％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为85％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为86％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为87％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为88％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为89％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为90％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为91％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为92％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为93％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为94％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为95％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为96％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为97％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为98％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，脂质纳米颗粒对mRNA的包封效率为99％或更高。

在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为70％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为75％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为80％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为85％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为86％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为87％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为88％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为89％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为90％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为91％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为92％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为93％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为94％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为95％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为96％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为97％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为98％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之后，LNP对mRNA的包封效率为99％或更高。

在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为70％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为75％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为80％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为85％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为86％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为87％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为88％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为89％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为90％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为91％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为92％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为93％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为94％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为95％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为96％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为97％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为98％或更高。在一些实施方案中，在喷雾干燥聚合物和LNP包封的mRNA的制剂之前和之后，LNP对mRNA的包封效率为99％或更高。

在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的10％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的15％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的20％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的25％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的30％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的35％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的40％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的41％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的42％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的43％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的44％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的45％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的46％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的47％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的48％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的49％或更大。在一些实施方案中，从喷雾干燥步骤回收的聚合物和LNP包封的mRNA的制剂的质量为喷雾干燥步骤之前的制剂的质量的50％或更大。

在一些实施方案中，使用泵系统将mRNA与脂质组合，所述泵系统在整个过程中维持脂质/mRNA(N/P)比恒定，并且还易于按比例放大。在一些实施方案中，N/P比在1至20之间的范围内。在一些实施方案中，N/P比大于2、或大于3、或大于4、或大于5、或大于6、或大于7、或大于8、或大于9、或大于10、或大于11、或大于12、或大于13、或大于14、或大于15。在一些实施方案中，N/P比为17、或18、或19、或20。

合适的负载mRNA的脂质纳米颗粒可以制成各种粒度。在一些实施方案中，在喷雾干燥前负载mRNA的脂质纳米颗粒的粒度通过脂质纳米颗粒的最大直径的长度确定。在一些实施方案中，在喷雾干燥前负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的粒度不大于约250nm(例如，不大于约225nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、或50nm)。在一些实施方案中，合适的脂质体具有的大小范围为约10-250nm(例如，范围为约10–225nm、10–200nm、10–175nm、10–150nm、10-125nm、10–100nm、10–75nm或10–50nm)。在一些实施方案中，在喷雾干燥前负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的粒度在约100-250nm的范围内(例如，在约100-225nm、100-200nm、100-175nm、100-150nm的范围内)。在一些实施方案中，在喷雾干燥前负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的粒度在约10-100nm的范围内(例如，在约10-90nm、10-80nm、10-70nm、10-60nm、或10–50nm的范围内)。在一个特定实施方案中，在喷雾干燥前负载mRNA的脂质纳米颗粒具有的粒度小于约100nm。

所属领域已知的各种替代方法可用于测定脂质体群体的大小。一种这样的尺寸测定方法在美国专利第4,737,323号中描述，所述专利以引用的方式并入本文。通过浴或探针超声处理对脂质体悬浮液进行超声处理产生渐进的尺寸减小，降至直径小于约0.05微米的小ULV。均质化是依赖于剪切能将大脂质体断裂成较小脂质体的另一种方法。在典型的均质化程序中，MLV通过标准乳液均质器再循环，直到观察到选择的脂质体尺寸，通常在约0.1至0.5微米之间。脂质体的尺寸可通过准电光散射(QELS)进行测定，如以引用的方式并入本文的Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421-150(1981)中所述。平均脂质体直径可通过所形成的脂质体的超声处理来减小。间歇性超声处理循环可与QELS评价交替，以指导有效的脂质体合成。

合适的负载mRNA的脂质纳米颗粒含有阳离子脂质、PRG化的脂质、非阳离子脂质和基于胆固醇的脂质中的一者或多者。

阳离子脂质

如本文所用，术语“阳离子脂质”是指在选定pH(诸如生理pH)下具有净正电荷的许多脂质和类脂质物类中的任一者。在文献中已描述了几种阳离子脂质，其中许多是商购可得的。

用于本发明的组合物和方法的合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO 2010/144740中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2013/149140中所述的可电离阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式之一的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中R₁和R₂各自独立地选自由以下项组成的组：氢、任选地取代的不同饱和或不饱和的C₁-C₂₀烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的C₆-C₂₀酰基；其中L₁和L₂各自独立地选自由以下项组成的组：氢、任选地取代的C₁-C₃₀烷基、任选地取代的不同不饱和的C₁-C₃₀烯基和任选地取代的C₁-C₃₀炔基；其中m和o各自独立地选自由以下项组成的组：零和任何正整数(例如，其中m为三)；并且其中n为零或任何正整数(例如，其中n为一)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(“HGT5000”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-1-胺(“HGT5001”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(“HGT5002”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括在国际专利公开WO2010/053572中描述为氨基醇类脂质的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/118725中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/118724中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括具有通式14,25-二-十三烷基15,18,21,24-四氮杂-三十八烷的阳离子脂质及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2013/063468和WO 2016/205691中所述的阳离子脂质，这些专利公开中的每个以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中R^L的每个实例独立地是任选地取代的C₆-C₄₀烯基。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2015/184256中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中每个X独立地是O或S；每个Y独立地是O或S；每个m独立地为0至20；每个n独立为1至6；每个R_A独立地是氢、任选地取代的C1-50烷基、任选地取代的C2-50烯基、任选地取代的C2-50炔基、任选地取代的C3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的C6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个R_B独立地是氢、任选地取代的C1-50烷基、任选地取代的C2-50烯基、任选地取代的C2-50炔基、任选地取代的C3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的C6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“靶标23”：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/004202中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如美国临时专利申请序列号62/758,179中所述的阳离子脂质，该临时专利申请以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中每个R¹和R²独立地是H或C₁-C₆脂族；每个m独立地为具有1至4的值的整数；每个A独立地是共价键或亚芳基；每个L¹独立地是酯、硫酯、二硫键或酸酐基团；每个L²独立地是C₂-C₁₀脂族；每个X¹独立地是H或OH；以及每个R³独立地是C₆-C₂₀脂族。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如J.McClellan,M.C.King,Cell 2010,141,210-217和Whitehead等人.,Nature Communications(2014)5:4277中所述的阳离子脂质，这些文献以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2015/199952中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/004143中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/075531中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中L¹或L²中的一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-；并且L¹或L²中的另一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-或直接键；G¹和G²各自独立地是未取代的C₁-C₁₂亚烷基或C₁-C₁₂亚烯基；G³是C₁-C₂₄亚烷基、C₁-C₂₄亚烯基、C₃-C₈亚环烷基、C₃-C₈亚环烯基；R^a是H或C₁-C₁₂烷基；R¹和R²各自独立地是C₆-C₂₄烷基或C₆-C₂₄烯基；R³是H、OR⁵、CN、-C(＝O)OR⁴、-OC(＝O)R⁴或-NR⁵C(＝O)R⁴；R⁴是C₁-C₁₂烷基；R⁵是H或C₁-C₆烷基；并且x为0、1或2。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/117528中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/049245中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有下式之一的化合物：

及其药学上可接受的盐。对于这四个通式中的任一者，R₄独立地选自-(CH₂)_nQ和-(CH₂)_nCHQR；Q选自由以下项组成的组-OR、-OH、-O(CH₂)_nN(R)₂、-OC(O)R、-CX₃、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(H)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环；并且n为1、2或3。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/173054和WO 2015/095340中所述的阳离子脂质，这些专利公开中的每个以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括基于胆固醇的阳离子脂质。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的咪唑胆固醇酯或“ICE”：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2012/170889中所述的可切割阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

其中R₁选自由以下项组成的组：咪唑、胍、氨基、亚胺、烯胺、任选地取代的烷基氨基(例如，烷基氨基，诸如二甲基氨基)和吡啶基；其中R₂选自由以下两个通式之一组成的组：

并且其中R₃和R₄各自独立地选自由以下项组成的组：任选地取代的不同饱和或不饱和的C₆-C₂₀烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的C₆-C₂₀酰基；并且其中n为零或任何正整数(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更多)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4001”：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4002”：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4003”：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4004”：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4005”：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括可切割的阳离子脂质，如2018年5月16日提交的美国临时申请No.62/672,194中所述，该临时申请以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，所述阳离子脂质为美国临时申请No.62/672,194中所述的通式中的任一者或者结构(1a)-(21a)和(1b)-(21b)和(22)-(237)在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有根据式(I')的结构的阳离子脂质，

其中：

RX独立地为-H、-L1-R1或–L5A-L5B-B’；

L1、L2和L3中的每个独立地为共价键、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-或-C(O)NRL-；

每个L4A和L5A独立地为-C(O)-、-C(O)O-或-C(O)NRL-；

每个L4B和L5B独立地为C1-C20亚烷基、C2-C20亚烯基或C2-C20亚炔基；

每个B和B’是NR4R5或5至10元含氮杂芳基；

每个R1、R2和R3独立地为C6-C30烷基、C6-C30烯基或C6-C30炔基；

每个R4和R5独立地是氢、C1-C10烷基；C2-C10烯基；或C2-C10炔基；以及

每个RL独立地为氢、C1-C20烷基、C2-C20烯基或C2-C20炔基。

在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，所述阳离子脂质为62/672,194的化合物(139)，所述化合物具有以下化合物结构：

(“18:1碳尾核糖脂质”)。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)。(Feigner等人.Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355，该专利以引用的方式并入本文)。适用于本发明的组合物和方法的其他阳离子脂质包括例如5-羧基精胺基甘氨酸二-十八烷基酰胺(“DOGS”)；2,3-二油烯基氧基-N-[2-(精胺-羧胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵(“DOSPA”)(Behr等人.Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)，美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(“DODAP”)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(“DOTAP”)。

适用于本发明的组合物和方法的另外的示例性阳离子脂质还包括：1,2-二硬脂酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DSDMA”)；1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DODMA”)；1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLinDMA”)；1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLenDMA”)；N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)；3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(“CLinDMA”)；2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9',12'-十八碳二烯氧基)丙烷(“CpLinDMA”)；N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(“DMOBA”)；1,2-N,N'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DOcarbDAP”)；2,3-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基丙基胺(“DLinDAP”)；1,2-N,N'-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLincarbDAP”)；1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLinCDAP”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(“DLin-K-DMA”)；2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA”)；(2R)-2-((8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA(2R)”)；(2S)-2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,fsl-二甲基3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA(2S)”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(“DLin-K-XTC2-DMA”)；和2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,l2-二烯-1-基)-l,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二甲基乙胺(“DLin-KC2-DMA”)(参见，WO 2010/042877，该专利以引用的方式并入本文；Semple等人.,NatureBiotech.28:172-176(2010))。(Heyes,J.,等人.,J Controlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.,等人.,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；国际专利公开WO 2005/121348)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一种。

在一些实施方案中，适用于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(“XTC”)；(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(“ALNY-100”)和/或4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-二-十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺(“NC98-5”)。

在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以摩尔％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或80％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30-70％(例如，约30-65％、约30-60％、约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以摩尔％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30-70％(例如，约30-65％、约30-60％、约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。

在一些实施方案中，作为本文所述的阳离子脂质的代替或除本文所述的阳离子脂质之外，可以使用基于甾醇的阳离子脂质。合适的基于甾醇的阳离子脂质是含二烷基氨基、咪唑和胍的基于甾醇的阳离子脂质。例如，某些实施方案涉及包含一种或多种包含咪唑的基于甾醇的阳离子脂质的组合物，所述阳离子脂质例如咪唑胆固醇酯或“ICE”脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，如以下结构(I)所表示。在某些实施方案中，用于递送编码功能蛋白的RNA(例如，mRNA)的脂质纳米颗粒可以包含一种或多种基于咪唑的阳离子脂质，例如咪唑胆固醇酯或“ICE”脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，如以下结构所表示：

在一些实施方案中，脂质体中阳离子脂质的百分比可大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％。在一些实施方案中，阳离子脂质构成按重量计约30-50％(例如，约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％、或约35-40％的脂质体。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，ICE脂质)以摩尔比计占脂质体的约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％或约80％。

PEG化的脂质

在一些实施方案中，合适的脂质溶液包含一种或多种PEG化的脂质。例如，本发明还设想了聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生化的脂质(例如衍生化的神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺))的使用。设想的PEG修饰的脂质包括但不限于长度为最多5kDa的聚乙二醇链，所述聚乙二醇链共价连接至具有一条或多条C₆-C₂₀长度的烷基链的脂质。在一些实施方案中，PEG修饰的或PEG化的脂质是PEG化的胆固醇或PEG-2K。在一些实施方案中，特别有用的可交换脂质是具有较短的酰基链(例如，C₁₄或C₁₈)的PEG-神经酰胺。

PEG修饰的磷脂和衍生化的脂质可以占脂质体中的总脂质的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％或至少20％。

非阳离子/辅助脂质

如本文使用的，短语“非阳离子脂质”指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文所用，短语“阴离子脂质”是指在选定pH诸如生理pH下携带净负电荷的多种脂质物质中的任何一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-羧酸二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)或它们的混合物。

在一些实施方案中，非阳离子脂质以重量或摩尔计可以占合适的脂质溶液中的总脂质的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，一种或多种非阳离子脂质以重量或摩尔计占合适的脂质溶液中的总脂质的约20％-50％(例如，约20％-45％、约20％-40％、约25％-50％、约25％-45％或约25％-40％)。

基于胆固醇的脂质

在一些实施方案中，合适的脂质溶液包含一种或多种基于胆固醇的脂质。例如，合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括例如DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺胆固醇)、1,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao,等人.Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人.BioTechniques23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或ICE。在一些实施方案中，一种或多种基于胆固醇的脂质以重量或摩尔计占合适的脂质溶液中的总脂质的至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些实施方案中，一种或多种基于胆固醇的脂质以重量或摩尔计占合适的脂质溶液中的总脂质的约20％-50％(例如，约20％-45％、约20％-40％、约25％-50％、约25％-45％或约25％-40％)。

实施例部分描述了阳离子脂质、非阳离子脂质、基于胆固醇的脂质和PEG修饰的脂质的示例性组合。例如，合适的脂质溶液可以含有cKK-E12、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；C12-200、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；HGT5000、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；HGT5001、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；cKK-E12、DPPC、胆固醇和DMG-PEG2K；C12-200、DPPC、胆固醇和DMG-PEG2K；HGT5000、DPPC、胆固醇和DMG-PEG2K；或者HGT5001、DPPC、胆固醇和DMG-PEG2K。包含脂质混合物的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG修饰的脂质的选择以及此类脂质彼此的相对摩尔比基于一种或多种所选的脂质的特征和待包封的mRNA的特征性质。其他考虑因素包括例如，烷基链的饱和度以及所选脂质的大小、电荷、pH、pKa、融合性和毒性。因此，可以相应地调节摩尔比。

通常，负载mRNA的脂质纳米颗粒占喷雾干燥混合物总固体含量的0.1％至30％。在一些实施方案中，待喷雾干燥的负载mRNA的纳米颗粒组合物的总固体含量在0.5％-20％之间。在一些实施方案中，待喷雾干燥的负载mRNA的纳米颗粒组合物的总固体含量在2％-20％之间。在一些实施方案中，待喷雾干燥的负载mRNA的纳米颗粒组合物的总固体含量在2％-15％之间。在一些实施方案中，待喷雾干燥的负载mRNA的纳米颗粒组合物的总固体含量在2％-10％之间。

聚合物

在根据本发明的喷雾干燥mRNA-LNP中可以使用各种聚合物。通常，合适的聚合物具有低毒性并且在宽范围的浓度下具有良好的耐受性。在一些实施方案中，合适的聚合物带正电。示例性聚合物包括但不限于壳聚糖、聚酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚(q-己内酯)(PCL)、聚酰胺-胺、聚(羟基烷基L-天冬酰胺)、聚(羟基烷基L-谷氨酰胺)、聚(2-烷基噁唑啉)丙烯酸酯、改性丙烯酸酯和基于甲基丙烯酸酯的聚合物、聚-N-(2-羟基-丙基)甲基丙烯酰胺、聚-2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱、聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱)和聚(甲基丙烯酸二甲基氨基乙基酯)(pDMAEMA)。

在一些实施方案中，合适的聚合物是聚甲基丙烯酸酯衍生物，所述聚甲基丙烯酸酯衍生物包含以下结构的单体的重复单元，

其中，R¹独立地是C₁-C₆烷基，L¹独立地是C₂-C₆亚烷基，R^1A和R^1B各自独立地是C₁-C₆烷基，并且a为1-500的整数；R²独立地是C₁-C₆烷基，R^2A独立地是C₁-C₆烷基，b为1-500的整数；R³独立地是C₁-C₆烷基，R^3A独立地是C₁-C₆烷基，c为1-500的整数。

在一些实施方案中，重复单元可以以下式表示，

其中每个R⁴独立地是R²或R³；每个R^4A独立地是R^2A或R^3A；并且d为1-500的整数。在上述结构中，L¹可以是-CH₂CH₂，并且每个R^1A和R^1B是甲基；和/或每个R¹、R²和R³是甲基；和/或R^2A是丁基，R^3A是甲基。

在一些实施方案中，聚合物的示例性成员以下式表示：

该组的示例性成员称为商品名Eudragit。在本发明的一些实施方案中，包含在喷雾干燥的mRNA-LNP制剂中的聚合物是Eudragit聚合物。Eudragit形成一类无定形聚合物或共聚物，它们衍生自丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，它们的性质由官能团决定。单个Eudragit等级的比例与中性、碱性或酸性基团不同，因此在物理化学性质方面也不同。一些可用的形式是阴离子的，一些是阳离子的，一些是中性的。在一些实施方案中，与mRNA-LNP复合物一起用于喷雾干燥的这种类型的聚合物具有带正电的叔胺基团和甲基丙烯酸主链。它们可以与mRNA形成复合物并且包封mRNA。它们具有较高的Tg和极好的热塑性性质，这有助于喷雾干燥。这些聚合物在较高的pH下是不溶的，因此在表面活性剂中可以有助于保护mRNA免受降解。Eudragit聚合物已获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于口服，并且已经在商业口服产品中使用了数十年。这些聚合物具有低毒性并且在宽范围的浓度下具有良好的耐受性。

在一些实施方案中，所用的聚合物包括在pH5及以上的不溶性Eudragit类别。在一些实施方案中，聚合物的这种性质用于活性mRNA成分的口服递送，以使得mRNA不在唾液中释放。这些聚合物的一个优点是它们能够有效掩盖活性成分和其他赋形剂的味道和气味，因为功能性聚合物在口腔中是不溶的。

因此，在一些实施方案中，上文所述的这些甲基丙烯酸衍生物聚合物被用于制备用于稳定的喷雾干燥的mRNA-LNP干粉的制剂。在一些实施方案中，这些甲基丙烯酸衍生物聚合物被用于mRNA的持续释放。在一些实施方案中，在pH≥5下不溶的甲基丙烯酸衍生物聚合物被用于将合适的mRNA递送至胃肠道(GI)。在一些实施方案中，甲基丙烯酸衍生物聚合物被用于将合适的mRNA递送至结肠。

在一些实施方案中，聚合物占干粉的总重量的小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、9％、8％、7％、6％或5％。在一些实施方案中，聚合物占干粉的总重量的1％至60％。在一些实施方案中，聚合物占干粉的总重量的约1％-90％、10％-90％、20％-90％、10％-50％、1％-20％、2％-15％、3％-12％、1％-10％、2％-9％、3％-8％、1％-7％、2％-6％或3％-5％。

其他赋形剂

在一些实施方案中，在喷雾干燥前，将糖和其他赋形剂添加至负载mRNA的纳米颗粒和聚合物混合物。

糖

在喷雾干燥前，可以将各种糖添加至混合物中。预期糖在脱水过程中提供稳定作用。适用于制剂的示例性糖是单糖、二糖和多糖，它们选自由以下项组成的组：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、葡聚糖、麦芽糖糊精、环糊精、菊粉、木糖醇、山梨糖醇、乳糖醇和甘露糖醇。

在一些实施方案中，合适的糖是乳糖和/或甘露糖醇。在一些实施方案中，合适的糖是甘露糖醇。在一些实施方案中，甘露糖醇以约1％-10％的浓度添加。在一些实施方案中，甘露糖醇以约2％-10％的浓度添加。在一些实施方案中，甘露糖醇以约3％-10％的浓度添加。在一些实施方案中，甘露糖醇以约4％-10％的浓度添加。在一些实施方案中，甘露糖醇以约5％-10％的浓度添加。

在一些实施方案中，合适的糖是海藻糖。在一些实施方案中，添加甘露糖醇和海藻糖二者。

表面活性剂

在一些实施方案中，表面活性剂被用作赋形剂。表面活性剂增加组合物的表面张力。在一些实施方案中，用于喷雾干燥mRNA脂质组合物的表面活性剂选自由以下项组成的组：CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)、磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、八乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十二烷基醚、Triton X-100、椰油酰胺单乙醇胺、椰油酰胺二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单月桂酸脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸脱水山梨糖醇酯、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、烷基聚葡萄糖苷和泊洛沙姆。在一些实施方案中，所用的表面活性剂是泊洛沙姆。

各种其他赋形剂可以包含于喷雾干燥制剂中。这些赋形剂包括但不限于各种聚酯、聚氨酯、聚(酯酰胺)、聚(原酸酯)、聚酸酐、聚(酸酐-亚胺)共聚物、聚磷酸酯、聚磷腈、氨基酸、胶原蛋白、壳聚糖、环糊精、多糖、麦芽糖糊精、白蛋白、各种糖、表面活性剂、缓冲剂和盐。

干粉

根据本发明制备的干粉含有多个喷雾干燥的颗粒。残留的含水量、气溶胶性能和物理化学稳定性是喷雾干燥的药品的重要参数。它由加热和干燥后的样品重量损失来确定，公式如下：

含水量％＝[(SW_b-SW_a)/SW_b]×100％，

其中，SW_b是加热前的样品重量，SW_a是加热后的样品重量。Perkin Elmer TGA 7(Perkin Elmer)是具有相关软件的商用仪器的实例，它被用于测量纳米颗粒中的残留水分。

通常，对于制剂的活性药物成分的剂量均一性，使粒度分布维持在允许范围内。尤其是对于肺部递送，干粉制剂的颗粒影响呼吸系统内的气溶胶的分布和沉积。在很多情况下，对于治疗组分的有效吸收和分布，将颗粒沉积于大型导气管中是优选的。极细颗粒的气溶胶，例如直径小于1微米的颗粒可以在周围沉积，以被肺的特定细胞有效吸收，诸如作为支气管扩张剂的活性药物成分被平滑肌吸收。

喷雾干燥的颗粒的一次粒度分布通过动态光散射来测量，以Z-平均粒径表示。Z-平均粒径是从粒径的强度加权分布计算的平均值，也称为累积量粒径，并且由公式D_z＝∑S_i/∑(S_i/D_i)给出，其中S_i是颗粒“i”的散射强度，并且D_i是颗粒的直径。除这些参数之外，还定义了细颗粒和粗颗粒级分。

在另一个方面，多分散性指数(PDI)是给定颗粒样品的分子质量分布的度量。

ζ电势是颗粒之间的静电或电荷排斥/吸引的大小的量度，并且是已知影响稳定性的基本参数之一。它的测量可以深入了解分散、聚集或絮凝的原因，并且可以被用于改善分散体、乳液和悬浮液的制剂。ZP表示分散体中接近和带相似电荷的颗粒之间的排斥程度。高ZP表示带电较高的颗粒。通常，高ZP(负值或正值)可防止由于电排斥而导致的颗粒聚集，并且使纳米颗粒分散体电稳定。在另一个方面，在低ZP的情况下，吸引力超过排斥力，分散体凝结或絮凝。可以使用可用的设备系统(例如，Zetasizer Nano(Malvern Instruments))通过光子相关光谱法来测量ζ电势。

纳米颗粒的球形度是颗粒再组装为球体的紧密程度的度量。它可以用沃德尔(Waddell)方程来测量，以Ψ表示，方程如下：

具有相同体积的给定颗粒的球体的表面积

颗粒的表面积

喷雾干燥的mRNA-脂质制剂的粒度分布以及形状或球形度可以通过扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜或通过库尔特(Coulter)粒度仪通过流体中的颗粒施加的电阻变化来测量。

最后，通过HPLC或Northern印迹分析来评估mRNA的含量和/或完整性。在一些实施方案中，进行质谱法和其他相关的分光光化学分析，以进行mRNA-纳米颗粒制剂的稳定性、完整性和质量评估。

本发明的喷雾干燥的mRNA脂质纳米颗粒含有少于10％的水分(w/w)。在一些实施方案中，本发明的喷雾干燥的mRNA脂质纳米颗粒可以保持少于约9％的水分。在一些实施方案中，本发明的喷雾干燥的mRNA脂质纳米颗粒可以保持少于约8％的水分。在一些实施方案中，本发明的喷雾干燥的mRNA脂质纳米颗粒可以保持少于约7％的水分。在一些实施方案中，本发明的喷雾干燥的mRNA脂质纳米颗粒可以保持少于约6％的水分。在一些实施方案中，本发明的喷雾干燥的mRNA脂质纳米颗粒可以保持少于约5％的水分。在一些实施方案中，本发明的喷雾干燥的mRNA脂质纳米颗粒可以保持少于约4％的水分。在一些实施方案中，本发明的喷雾干燥的mRNA脂质纳米颗粒可以保持少于约3％的水分。在一些实施方案中，本发明的喷雾干燥的mRNA脂质纳米颗粒可以保持少于约2％的水分。在一些实施方案中，本发明的喷雾干燥的mRNA脂质纳米颗粒可以保持少于约1％的水分。在一些实施方案中，喷雾干燥的mRNA-LNP制剂的水分含量小于5％。

本文提供了喷雾干燥的mRNA LNP制剂，其中mRNA脂质纳米颗粒粒度是不均一的，细颗粒分数(fnfr)小于10μm。在一些实施方案中，本发明的mRNA-LNP干粉颗粒的fnfr在1-10μm之间的范围内。mRNA-LNP喷雾干燥的样品的最佳Z-平均粒径可以≤10μm。在一些实施方案中，mRNA-LNP喷雾干燥的样品的Z-平均粒径≤8μm。在一些实施方案中，mRNA-LNP喷雾干燥的样品的Z-平均粒径≤5μm。在一些实施方案中，mRNA-LNP喷雾干燥的样品的Z-平均粒径应在0.01-10μm的范围内。在一些实施方案中，mRNA-LNP喷雾干燥的样品的Z-平均粒径应在0.1-10μm的范围内。在一些实施方案中，mRNA-LNP喷雾干燥的样品的Z-平均粒径应在0.1-5μm的范围内。在一些实施方案中，mRNA-LNP喷雾干燥的样品的Z-平均粒径应在0.1-3μm的范围内。在一些实施方案中，mRNA-LNP喷雾干燥的样品的Z-平均粒径应在0.1-5μm的范围内。

在一些实施方案中，在喷雾干燥前，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于200nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于180nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于150nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于120nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于100nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥前，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于50nm的Z-平均粒径。

在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于5000nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于4000nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于3000nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于2000nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于1000nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于500nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于500nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于300nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于200nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于100nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于50nm的Z-平均粒径。在一些实施方案中，在喷雾干燥后，mRNA-脂质纳米颗粒包含小于10nm的Z-平均粒径。

本文提供了mRNA-LNP的干粉制剂，其中mRNA-LNP颗粒的平均球形度在0.7至1的范围内。在一些实施方案中，mRNA脂质纳米颗粒的平均球形度大于0.7、或大于0.8、或大于0.9。

在一些实施方案中，用于本申请的纳米颗粒的ζ电势值在+30mV和-30mV之间。在一些实施方案中，纳米颗粒的ζ电势值在+20mV和-30mV之间。在一些实施方案中，纳米颗粒的ζ电势值在+10mV和-30mV之间。在一些实施方案中，纳米颗粒的ζ电势值在0mV和-30mV之间。在一些实施方案中，纳米颗粒的ζ电势值在-10mV和-30mV之间。在一些实施方案中，纳米颗粒的ζ电势值在-20mV和-30mV之间。在一些实施方案中，纳米颗粒的ζ电势值在+20mV和-30mV之间。在一些实施方案中，纳米颗粒的ζ电势值在-20mV和-30mV之间。在一些实施方案中，纳米颗粒的ζ电势值为约-30mV，并且多分散性指数小于约0.3。

在一些实施方案中，所提供的mRNA-LNP的干粉制剂含有干粉的总重量的最多30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％。在一些实施方案中，mRNA占干粉的总重量的1％-6％、1％-5％、1％-4％、1％-3％、2％-10％、2％-9％、2％-8％、2％-7％、2％-6％、2％-5％、2％-10％、2％-15％、2％-20％、2％-30％。

稳定性

提供了在各种条件下储存时稳定的喷雾干燥的mRNA-LNP制剂。如本文所用，术语“稳定的”是指在储存后mRNA保持大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的完整性。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于一年时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于11个月时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于10个月时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于9个月时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于8个月时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于7个月时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于6个月时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于5个月时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于4个月时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于3个月时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于2个月时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于1个月时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。

在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于8周时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于7周时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于6周时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于5周时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。在一些实施方案中，当在冷冻条件(-20℃)下、在4℃下或在室温下储存大于4周时，本文提供的mRNA-LNP干粉制剂是稳定的。

信使RNA

本发明可用于配制任何mRNA。如本文所用，mRNA是将信息从DNA携带到核糖体以翻译编码的蛋白质的RNA类型。可以根据多种已知方法中的任一种来合成mRNA。例如，可以经由体外转录(IVT)来合成根据本发明的mRNA。简而言之，IVT通常使用线性或环状DNA模板进行，该模板包含启动子，三磷酸核糖核苷酸库，可能包含DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)，DNAse I，焦磷酸酶和/或RNAse抑制剂。确切条件将根据特定应用而变化。

本发明可以用于调配各种长度的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于递送长度等于或大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于递送长度在约1-20kb、约1-15kb、约1-10kb、约5-20kb、约5-15kb、约5-12kb、约5-10kb、约8-20kb或约8-15kb范围内的体外合成的mRNA。

本发明可以用于调配未经修饰的mRNA或者含有通常增强稳定性的一个或多个修饰的mRNA。在一些实施方案中，修饰选自经修饰的核苷酸、经修饰的糖磷酸主链以及5’和/或3’非翻译区(UTR)。

在一些实施方案中，mRNA的修饰可以包括RNA的核苷酸的修饰。根据本发明的经修饰的mRNA可以包括例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，mRNA可以从天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)合成，所述天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))以及嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物，例如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧羟甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、Q核苷、β-D-甘露糖基-Q核苷、怀丁苷和氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。此类类似物的制备是本领域的技术人员已知的，例如来自美国专利号4,373,071、美国专利No.4,401,796、美国专利No.4,415,732、美国专利No.4,458,066、美国专利No.4,500,707、美国专利No.4,668,777、美国专利No.4,973,679、美国专利No.5,047,524、美国专利No.5,132,418、美国专利No.5,153,319、美国专利号5,262,530和5,700,642，这些专利的全部公开内容以引用的方式包括于本文中。

在一些实施方案中，mRNA可以含有RNA主链修饰。通常，骨架修饰是其中RNA中所含核苷酸骨架的磷酸酯被化学修饰的修饰。示例性的骨架修饰通常包括但不限于选自由以下项组成的组的修饰：甲基膦酸酯、甲基膦酰胺、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(例如胞苷5'-O-(1-硫代磷酸酯))、硼酸磷酸酯、带正电荷的胍鎓基团等，这意味着用其他阴离子、阳离子或中性基团代替磷酸二酯键。

在一些实施方案中，mRNA可以含有糖修饰。典型的糖修饰是其包含的核苷酸的糖的化学修饰，包括但不限于选自以下的糖修饰：2'-脱氧-2'-氟-寡核糖核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氟-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-脱氧-2'-脱胺-寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-O-烷基寡核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-C-烷基寡核糖核苷酸(2'-O-甲基胞苷5'-三磷酸、2'-甲基尿苷5'-三磷酸)、2'-C-烷基寡核糖核苷酸及其异构体(2'-阿糖胞苷5'-三磷酸、2'-阿糖尿苷5'-三磷酸)或叠氮三磷酸(2'-叠氮基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-叠氮基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)。

在一些实施方案中，mRNA可以含有核苷酸碱基的修饰(碱基修饰)。包含碱基修饰的修饰核苷酸也称为碱基修饰的核苷酸。此类碱基修饰的核苷酸的例子包括但不限于2-氨基-6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、2-氨基腺苷5'-三磷酸、2-硫代胞苷5'-三磷酸、2-硫代尿苷5'-三磷酸、4-硫代尿苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷5'-三磷酸、5-溴胞苷5'-三磷酸、5-溴尿苷5'-三磷酸、5-碘胞苷5'-三磷酸、5-碘尿苷5'-三磷酸、5-甲基胞苷5'-三磷酸、5-甲基尿苷5'-三磷酸、6-氮杂胞苷5'-三磷酸、6-氮杂尿苷5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、7-脱氮腺苷5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷5'-三磷酸、8-氮杂腺苷5'-三磷酸、8-叠氮基腺苷5'-三磷酸、苯并咪唑核苷5'-三磷酸、N1-甲基腺苷5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷5'-三磷酸、N6-甲基腺苷5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷5'-三磷酸、假尿苷5'-三磷酸、嘌呤霉素5'-三磷酸或黄苷5'-三磷酸。

通常，mRNA合成包括在5'末端上添加“帽”和在3'末端上添加“尾”。帽的存在对于提供针对大部分真核细胞中发现的核酸酶的抗性是重要的。“尾巴”的存在用于保护mRNA免受核酸外切酶降解。

因此，在一些实施方案中，mRNA包含5'帽结构。5'帽通常按以下方式添加：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸除去一个末端磷酸基团，留下两个末端磷酸；然后经由鸟苷酸转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)添加至末端磷酸，产生5'-5'反向三磷酸键；然后通过甲基转移酶对鸟嘌呤的7-氮进行甲基化。2’-O-甲基化也可以出现在7-甲基鸟苷三磷酸残基之后的第一碱基和/或第二碱基处。帽结构的实例包括但不限于m7GpppNp-RNA、m7GpppNmp-RNA和m7GpppNmpNmp-RNA(其中m表示2’-O-甲基残基)。

在一些实施方案中，mRNA包括3'尾结构。通常，尾结构包括poly(A)和/或poly(C)尾。mRNA的3'末端的多聚-A或多聚-C尾通常包含分别地至少50个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少250个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少350个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少450个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少650个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少700个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少750个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少800个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少850个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少900个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少950个腺苷或胞嘧啶核苷酸、或至少1kb腺苷或胞嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，多聚-A或多聚-C尾可分别为约10至800个腺苷或胞嘧啶核苷酸(例如约10至200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约50至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约100至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约150至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约200至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约250至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约300至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约350至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约400至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约450至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约500至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至100个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约20至70个腺苷或胞嘧啶核苷酸或约20至60个腺苷或胞嘧啶核苷酸)。在一些实施方案中，尾结构包括具有本文所述的各种长度的多聚(A)和多聚(C)尾的组合。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的腺苷核苷酸。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的胞嘧啶核苷酸。

在一些实施方案中，mRNA包括5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，5’非翻译区包括一个或多个影响mRNA的稳定性或翻译的元件，例如铁应答元件。

在一些实施方案中，3’非翻译区包括一个或多个聚腺苷酸化信号，影响mRNA在细胞中定位稳定性的蛋白质结合位点，或一个或多个miRNA结合位点。

示例性的5’和/或3’UTR序列可以衍生自稳定的mRNA分子(例如，球蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)以增加有义mRNA分子的稳定性。例如，5’UTR序列可以包括CMV立即早期1(IE1)基因的部分序列或其片段，以提高核酸酶抗性和/或提高多核苷酸的半衰期。还考虑了在多核苷酸(例如，mRNA)的3’末端或非翻译区包含编码人生长激素(hGH)或其片段的序列，以进一步稳定该多核苷酸。通常，这些修饰相对于其未修饰的对应物改善了多核苷酸的稳定性和/或药代动力学性质(例如半衰期)，并且包括例如为改善此类多核苷酸对体内核酸酶消化的抗性而进行的修饰。

mRNA构建体设计可以称为X-编码序列-Y。示例性的X和Y核苷酸序列如下：

X(5′UTR序列)＝

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG(SEQID NO:1)

Y(3′UTR序列)＝

CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU(SEQ ID NO:2)

或

GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU(SEQ ID NO:3)

虽然在一些实施方案中体外转录反应所提供的mRNA是所期望的，但是在本发明的范围内设想了mRNA的其他来源，包括从细菌、真菌、植物和/或动物产生的mRNA。

在一些实施方案中，合适的mRNA序列是编码人囊性纤维化跨膜受体、囊性纤维化跨膜传导调节因子CFTR(hCFTR)蛋白的mRNA序列。在一些实施方案中，针对有效表达人细胞的合适的mRNA序列进行密码子优化。在2018年5月16日提交的美国专利申请序列号15/981,757描述了体现用于治疗性递送的CFTR mRNA的制备和优化的详细描述，该专利申请的公开内容据此整体并入。

药物制剂和治疗用途

本发明的干粉制剂的药物组合物可以用于各种治疗应用。为了促进体内递送，可以将如本文所述的干粉制剂与一种或多种另外的药物载剂、靶向配体或稳定剂组合。在一些实施方案中，可以在喷雾干燥之前将一种或多种另外的药物载剂添加到制剂中。在一些实施方案中，可以使用进入干粉制剂的后插入技术将一种或多种另外的药物载剂添加到制剂中(即，在喷雾干燥之后)。用于配制和施用药物的技术可见于“Remington’sPharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，最新版。

本文所述的干粉制剂可以以粉末形式体内施用，或者在复原后施用。用于本文所述的制剂的合适的施用途径包括口服、直肠、阴道、透粘膜、肺，包括气管内或吸入，或肠内施用；肠胃外递送，包括真皮内、透皮(局部)、肌肉内、皮下、髓内注射；以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内或鼻内。在特定的实施方案中，肌内施用是对选自由骨骼肌、平滑肌和心肌组成的组的肌肉。在一些实施方案中，施用导致核酸递送至肌肉细胞。在一些实施方案中，施用导致核酸递送至肝细胞(即，肝脏细胞)。

本发明的药物制剂可以以局部而非全身的方式施用，例如，通过优选地以缓释制剂的形式，将药物制剂直接注射到靶向组织中。根据待靶向组织，可以各种方式影响局部递送。递送的mRNA可在其中递送和/或表达的示例性组织包括但不限于肺、肝、肾、心脏、脾、血清、脑、骨骼肌、淋巴结、皮肤和/或脑脊髓液。在实施方案中，待靶向组织在肝中。例如，含有本发明组合物的气溶胶可以被吸入(针对鼻腔、气管或支气管递送)。在一些实施方案中，本发明的组合物可以使用定量吸入器递送。在一些实施方案中，本发明的组合物可以被复原和雾化以用于递送。在一些实施方案中，本发明的组合物可以被注射到损伤、疾病表现或疼痛的部位。在一些实施方案中，本发明的组合物可以以锭剂形式提供以用于口服、气管或食道施用。在一些实施方案中，本发明的组合物可以以液体、片剂或胶囊剂形式提供以施用于胃或肠。在一些实施方案中，本发明的组合物可以以栓剂形式提供以用于直肠或阴道施用。在一些实施方案中，本发明的组合物可以通过使用霜剂、滴剂或甚至注射剂递送到眼睛。

在一些实施方案中，本发明的干粉制剂被复原为液体溶液并且喷雾以进行递送。雾化可以通过本领域已知的任何雾化器来实现。雾化器将液体转化为细雾，以便可以更容易地吸入肺中。雾化器对婴儿、儿童和成人均有效。雾化器能够雾化大剂量的吸入药物。通常，与本发明一起使用的雾化器包括可拆卸的烟嘴。

在一些实施方案中，如本文所述的干粉制剂可以用于递送治疗有效量的mRNA，以用于治疗各种疾病或障碍。例如，根据本发明通过喷雾干燥制备的干粉制剂可以通过口服、鼻腔、气管或肺部途径施用，以用于治疗肺相关疾病，诸如囊性纤维化。在一些实施方案中，干粉制剂通过吸入来施用。在一些实施方案中，制剂通过定量吸入器来施用。在一些实施方案中，干粉制剂通过鼻内喷雾来施用。在一些实施方案中，将干粉制剂再水化并且以静脉内输注、注射、口服滴剂、滴鼻剂和本领域的普通技术人员容易想到的任何其他应用形式施用。

本发明可用于治疗各种其他肺相关疾病、障碍和病症。在一些实施方案中，本发明的稳定干粉制剂可用于治疗以下中的一者或多者：哮喘；COPD；气肿；原发性纤毛运动障碍(CILD1)伴或不伴内脏逆位、或卡塔格纳综合征；肺纤维化；比尔特-霍格-杜布综合征；遗传性出血性毛细血管扩张；α-1抗胰蛋白酶缺乏；细胞色素b阳性肉芽肿病(CGD，X连锁)；常染色体隐性细胞色素b阳性肉芽肿病；表面活性物质缺乏症、肺表面活性物质代谢功能障碍1、肺表面活性物质代谢功能障碍2、肺表面活性物质代谢功能障碍3；早产儿呼吸窘迫综合征；结核病、肺病毒病，包括流感、呼吸道合胞病毒(RSV)。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述干粉组合物用于递送至或治疗受试者的肺或肺细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码ATP结合盒亚家族A成员3蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码动力蛋白轴突中间链1蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码动力蛋白轴突重链5(DNAH5)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码α-1-抗胰蛋白酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码叉头盒P3(FOXP3)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码一种或多种表面活性蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述表面活性蛋白例如表面活性A蛋白、表面活性B蛋白、表面活性C蛋白和表面活性D蛋白中的一种或多种。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述干粉组合物用于递送至或治疗受试者的肝脏或肝细胞。此类肽和多肽可包括与尿素循环紊乱相关的、与溶酶体贮积紊乱相关的、与糖原贮积紊乱相关的、与氨基酸代谢紊乱相关的、与脂质代谢或纤维化紊乱相关的、与甲基丙二酸血症相关或与任何其他代谢紊乱相关的那些，对于所述代谢紊乱，以富集的全长mRNA递送至或治疗肝脏或肝细胞提供干粉有益效果。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与尿素循环障碍相关的蛋白质的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码精氨琥珀酸合成酶1蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码氨基甲酰磷酸合成酶I蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码精氨琥珀酸裂合酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码精氨酸酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与溶酶体贮积症相关的蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码α半乳糖苷酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码葡萄糖脑苷脂酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码异氰酸酯-2-硫酸酯酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码艾杜糖苷酸酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码N-乙酰基-α-D-葡糖胺苷酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码乙酰肝素N-硫酸酯酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码半乳糖胺-6硫酸酯酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码β-半乳糖苷酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码溶酶体脂肪酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码芳基硫酸酯酶B(N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码转录因子EB(TFEB)的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与糖原贮积症相关的蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码酸性α-葡糖苷酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肝糖原磷酸化酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肌肉磷酸甘油酸突变酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码糖原解支化酶的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与氨基酸代谢相关的蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码苯丙氨酸羟化酶的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码戊二酰-CoA脱氢酶的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码丙酰基-CoA羧化酶的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码草酸酶丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与脂质代谢或纤维化疾病相关的蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码mTOR抑制剂的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码ATP酶磷脂转运8B1(ATP8B1)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码一种或多种NF-κB抑制剂的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述抑制剂诸如I-κBα、干扰素相关的发育调节剂1(IFRD1)和沉默调节蛋白1(SIRT1)中的一种或多种。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码PPAR-γ蛋白或活性变体的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码与甲基丙二酸血症相关的蛋白质的全长mRNA的干粉组合物的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码甲基丙二酰辅酶A突变酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码甲基丙二酰辅酶A差向异构酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的干粉组合物的方法，对于所述干粉组合物，递送至或治疗肝脏可以提供干粉有益效果。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码ATP7B蛋白(也被称为威尔逊病蛋白)的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码胆色素原脱氨酶的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码一种或多种凝结酶的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述凝结酶诸如因子VIII、因子IX、因子VII和因子X。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码人血色素沉着病(HFE)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述干粉组合物用于递送至或治疗受试者的心血管系统或心血管细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码血管内皮生长因子A蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码松弛素蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码骨形态发生蛋白9蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码骨形态发生蛋白2受体蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述干粉组合物用于递送至或治疗受试者的肌肉或肌肉细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肌营养不良蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码人源线粒体蛋白(frataxin)的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述干粉组合物用于递送至或治疗受试者的心肌或心肌细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码调节肌肉组织或肌肉细胞中钾通道和钠通道中的一者或两者的蛋白质的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码调节肌肉组织或肌肉细胞中Kv7.1通道的蛋白质的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码调节肌肉组织或肌肉细胞中Nav1.5通道的蛋白质的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述干粉组合物用于递送至或治疗受试者的神经系统或神经系统细胞。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码存活运动神经元1蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码存活运动神经元2蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码人源线粒体蛋白(frataxin)的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码CLN3蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述干粉组合物用于递送至或治疗受试者的血液或骨髓或者血细胞或骨髓细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码β球蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码布鲁顿酪氨酸激酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码一种或多种凝结酶的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述凝结酶诸如因子VIII、因子IX、因子VII和因子X。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述干粉组合物用于递送至或治疗受试者的肾脏或肾脏细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码IV型胶原α5链(COL4A5)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述干粉组合物用于递送至或治疗受试者的眼或眼细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码ATP结合盒亚家族A成员4(ABCA4)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码视黄醛壳素蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码视网膜色素上皮特异性65kDa(RPE65)蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码290kDa的中心体蛋白(CEP290)的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码肽或多肽的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述干粉组合物用于向受试者或受试者的细胞递送疫苗或用疫苗治疗。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自诸如病毒之类的传染源的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自流感病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了生产具有编码来自呼吸道合胞病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自狂犬病病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自巨细胞病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了生产具有编码来自轮状病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自肝炎病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述肝炎病毒诸如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自人乳头瘤病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自单纯疱疹病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述单纯疱疹病毒诸如单纯疱疹病毒1或单纯疱疹病毒2。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自人免疫缺陷病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述人免疫缺陷病毒诸如人免疫缺陷病毒1型或人免疫缺陷病毒2型。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自人间质肺炎病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自人副流感病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法，所述人副流感病毒诸如人副流感病毒1型、人副流感病毒2型或人副流感病毒3型。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自疟疾病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自寨卡病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码来自基孔肯雅病毒的抗原的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的干粉组合物的方法，该mRNA编码与受试者的癌症相关的抗原或从受试者的癌细胞中鉴定的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的干粉组合物的方法，该mRNA编码从受试者自身的癌细胞确定的抗原，即提供个性化的癌症疫苗。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的干粉组合物的方法，该mRNA编码从突变KRAS基因表达的抗原。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码抗体的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，抗体可以是双特异性抗体。在某些实施方案中，抗体可以是融合蛋白的一部分。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码针对OX40的抗体的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码针对VEGF的抗体的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码针对组织坏死因子α的抗体的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码针对CD3的抗体的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码针对CD19的抗体的全长mRNA的干粉组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码免疫调节剂的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码白介素12的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码白介素23的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码白介素36γ的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的干粉组合物的方法，该mRNA编码一种或多种干扰素基因(STING)蛋白刺激物的组成型活性变体。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码核酸内切酶的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有全长mRNA的干粉组合物的方法，该mRNA编码RNA指导的DNA核酸内切酶蛋白，诸如Cas 9蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码大范围核酸酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备具有编码转录激活因子样效应子核酸酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种制备具有编码锌指核酸酶蛋白的全长mRNA的干粉组合物的方法。

本发明可用于治疗需要持续释放mRNA制剂的各种其他疾病、障碍和病症。这些实例包括其中在消化道中mRNA递送有用的疾病。这些疾病包括但不限于载脂蛋白E缺乏症；炎症性肠病或克罗恩氏病；粘附G蛋白偶联受体VI缺乏症；2型血管性血友病；草酸钙CAON相关肾结石；8型青春晚期糖尿病。

本发明可用于治疗各种其他疾病、障碍或病症，其中将mRNA制剂靶向递送至组织或器官可以是有利的。这些可以通过使适合的聚合物结合或不结合特定的靶向部分来进行。

实施例

虽然已经根据某些实施方案具体描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但是以下实施例仅用于展示本发明，而不旨在对其进行限制。

实施例1.从喷雾干燥回收的mRNA-LNP干粉制剂

在该实施例中，在使用或不使用聚合物的情况下制备LNP包封的mRNA制剂，并喷雾干燥。结果表明，与不使用聚合物制备的相同的mRNA-LNP制剂相比，使用聚合物制备的LNP包封的mRNA制剂可从喷雾干燥过程中获得出乎意料的高回收率。

具体而言，分别不使用聚合物或使用聚合物制备了两种LNP包封的mRNA制剂(编码萤火虫萤光素酶(FFL)的mRNA和制剂分别称为FFL-F1和FFL-F2)，每种的各自组成如表1所述。为了制备这些用于喷雾干燥的制剂，首先使用齿轮泵将FFL mRNA与脂质纳米颗粒(LNP)混合，以将mRNA包封在LNP中。然后，对于“使用聚合物”的样品，然后使用齿轮泵将聚合物溶液与mRNA-LNP混合。然后将溶液进行喷雾干燥，如图1中的仪器的图示所示。喷雾干燥使用以下条件：入口温度为90℃，抽吸百分比为85％，泵百分比为25％以及出口温度为46-50℃。

表1.实施例1的mRNA制剂组成和特征

结果

在不使用聚合物的情况下，每种LNP-mRNA制剂的喷雾干燥步骤均不成功。在每种情况下，如表1(底部)和图2所示，材料在喷雾干燥器中聚集并堵塞了喷雾干燥器的各个腔室，因此几乎没有或没有材料回收。然而，分别用聚合物制备的相同的两种LNP-mRNA制剂均已成功喷雾干燥，并从喷雾干燥步骤中回收的材料回收率超过40％，如表1(底部)和图2所示。

在喷雾干燥步骤之前和之后，测量喷雾干燥对包封效率和纳米颗粒粒度(Z-平均粒径)的影响，值列于表1(底部)中。对于使用聚合物制备的LNP-mRNA制剂，在喷雾干燥之前和之后，包封效率在材料中没有明显变化，并且发现纳米颗粒粒度从喷雾干燥之前至之后增加。对于不使用聚合物制备的LNP-mRNA制剂，由于喷雾干燥步骤无法产生任何实质性材料，因此无法确定这些指标。

实施例2.mRNA干粉制剂的完整性和稳定性

在该实施例中，制备了两种编码精氨琥珀酸合成酶或ASS1 mRNA的mRNA制剂，并评估了长期稳定性。具体而言，制备了一种不包含LNP但包含聚合物的mRNA制剂(ASS1-F1)。制备了包括LNP包封的LNP加聚合物的第二mRNA制剂(ASS-F2)。每种制剂在表2中进一步描述。

对于ASS1-F1制剂，使用齿轮泵将mRNA直接与聚合物混合。对于ASS1-F2制剂，首先使用齿轮泵将mRNA与脂质纳米颗粒(LNP)混合，以将mRNA包封在LNP中，然后使用齿轮泵将聚合物溶液与mRNA-LNP混合。浓缩最终制剂，并将甘露糖醇添加到每种制剂中。然后将溶液进行喷雾干燥，如图1中的仪器的图示所示。喷雾干燥使用以下条件：入口温度为90℃，抽吸百分比为85％，泵百分比为25％以及出口温度为46-50℃。

表2.实施例2的mRNA制剂组成和特征

包封效率和纳米颗粒粒度。在干燥之前和之后测量喷雾干燥对包封效率的作用。在该实施例中，在使用聚合物的制剂中，LNP包封的mRNA的包封效率在该过程之前为75.28±1.43，而在之后为81.85±0.44，这表明喷雾干燥过程不会对包封效率产生负面影响。在喷雾干燥之前和之后的纳米颗粒的平均粒度分别为99.4±1.3和426±12。

mRNA干粉的完整性和稳定性。即使在冷藏温度(4℃)下储存或在

-20℃下冷冻不同时间期，使用聚合物的制剂中的LNP包封的mRNA在喷雾干燥后仍能提供出乎意料的mRNA的高度完整性和稳定性。通过分光光度法分析，例如毛细管电泳(CE)，以及通过凝胶电泳，例如通过Northern印迹分析，评估以下描述的mRNA完整性和稳定性。

图3和图4作为mRNA完整性分析的示例性对照。具体而言，图3显示了通过CE(左图)和凝胶电泳(右图)评估的完整mRNA。在图的左图中，完整mRNA显示为单个分光光度峰(阴影)，在图的右图中，完整mRNA显示为单个条带，对应于预期的mRNA分子大小，单峰和单条带分别表示完整mRNA和无降解产物。类似地，图4显示了喷雾干燥之前从LNP提取的mRNA(即，提取的目的是进行CE和对mRNA进行凝胶电泳分析)，以确认从LNP提取的mRNA不会产生明显的mRNA降解产物。在图4中的CE峰和凝胶条带的比较在图3中示出了，用于从LNP提取mRNA的过程不产生显著的mRNA降解产物。

将喷雾干燥的ASS1-F1制剂或喷雾干燥的ASS1-F2制剂的等分试样分别储存在4℃或-20℃下，并在不同的时间点取出样品、复原并通过CE和凝胶电泳评估mRNA完整性。具体而言，在喷雾干燥后第2周和第4周评估使用聚合物(ASS1-F2)配制的干粉ASS1 mRNA-LNP的mRNA完整性，并在4℃或-20℃下储存；在喷雾干燥并在4℃或-20℃下储存后第3周和第5周评估使用聚合物(ASS1-F1)配制的干粉ASS1 mRNA(不使用LNP)的mRNA完整性。

图5和图6显示了使用聚合物(ASS1-F2)配制的干粉ASS1 mRNA-LNP的mRNA完整性，分别在4℃或-20℃下储存两周。图5和图6分别显示了单个CE峰(左图)和单个凝胶带(右图)，这表明ASS1 mRNA在两个温度条件下均保持完整，不降解。图7进一步显示了ASS1 mRNA的两个峰的重叠(来自图5和图6)，这表明无论储存温度如何，mRNA都保持完整。这些数据表明，使用聚合物的mRNA脂质纳米颗粒的喷雾干燥制剂在一定的存储温度范围内，例如在等于或最多约-20℃或在等于或最多约4℃的温度下，可保持稳定至少两周。

图8和图9显示了使用聚合物(ASS1-F2)配制的干粉ASS1 mRNA-LNP的mRNA完整性，分别在4℃或-20℃下储存四周。图8和图9二者显示了单个CE峰(左图)和单个凝胶带(右图)，这表明ASS1 mRNA在两个温度条件下均保持完整，不降解。这些数据表明，使用聚合物的mRNA脂质纳米颗粒的喷雾干燥制剂在一定的存储温度广泛范围内，例如在等于或最多约-20℃或在等于或最多约4℃的温度下，可保持稳定至少四周。

图10和图11显示了使用聚合物(ASS1-F1)配制的干粉ASS1mRNA(不使用LNP)的mRNA完整性，分别在4℃或-20℃下储存三周。如图10和图11所示，在两个温度条件下，ASS1-F1 mRNA保持完整，不降解。图12描绘了ASS1 mRNA的CE峰的叠加(来自图10和图11)，其中CE峰的完全比对表明mRNA不降解。这表明具有聚合物的喷雾干燥的mRNA制剂(无LNP包封)在很宽的存储温度范围内(例如，在等于或最多约-20℃下或者在等于或最多约4℃下)保持稳定至少三周。

图13和图14显示了使用聚合物(ASS1-F1)配制的干粉ASS1mRNA(不使用LNP)的mRNA完整性，分别在4℃或-20℃下储存五周。如图13和图14所示，在两个温度条件下，ASS1-F1 mRNA保持完整不降解。这表明具有聚合物的喷雾干燥的mRNA制剂(无LNP包封)在很宽的存储温度范围内(例如，在等于或最多约-20℃下或者在等于或最多约4℃下)保持稳定至少五周。

出乎意料的是，对于使用聚合物配制的干粉ASS1 mRNA-LNP(ASS1-F2)和对于使用聚合物配制的干粉ASS1 mRNA(不使用LNP)(ASS1-F1)而言，在较高的储存温度下，mRNA的完整性可以保持较长的时间期，例如冷藏储存(约4℃)。

实施例3.脂质-聚合物纳米颗粒中的mRNA包封的一步法

在该实施例中，脂质、mRNA和聚合物在单个步骤中制备，以产生脂质-聚合物包封的mRNA纳米颗粒(使用聚合物的制剂ASS1-F3和使用聚合物的ASS1-F4)。这与实施例1和实施例2相反，其中首先制备了LNP包封的mRNA纳米颗粒，然后将聚合物加入制剂中。此外，参考制剂通过相同的方法制备，但是在纳米颗粒或制剂中不包括聚合物(不使用聚合物的制剂ASS1-F3和不使用聚合物的ASS1-F4)。

具体而言，将脂质和聚合物(或仅对于对照制剂来说为脂质)溶解在乙醇中，并使用齿轮泵与mRNA溶液一起混合。制备了四种不同的制剂。使用cKK-E12作为阳离子脂质，在不使用或使用聚合物的情况下，制备第一和第二制剂(不使用聚合物的ASS1-F3和使用聚合物的ASS1-F3)。使用ICE(咪唑胆固醇酯)作为阳离子脂质，在不使用或使用聚合物的情况下，制备第三和第四制剂(不使用聚合物的ASS1-F4和使用聚合物的ASS1-F4)。使用聚合物的ASS1-F3和使用聚合物的ASS1-F4包含作为聚合物的Eudragit。所有四种制剂均包括编码ASS1的mRNA作为纳米颗粒包封的mRNA。浓缩每种制剂，并加入甘露糖醇。所有制剂在表3中进一步描述。使用实施例1中所述的条件对每种制剂进行喷雾干燥。

表3.实施例3的mRNA制剂组成和特征

结果

不使用聚合物的制剂的喷雾干燥步骤(不使用聚合物的ASS1-F3和不使用聚合物的ASS-F4)是不成功的。在每种情况下，材料都在喷雾干燥器中聚集并堵塞了喷雾干燥器的各个腔室，因此对于不使用聚合物的制剂，几乎没有或没有材料回收，如表3(底部)所示，每种材料的回收率均为1±2％。然而，使用纳米颗粒中的聚合物制备的相同两种制剂(使用聚合物的ASS1-F3和使用聚合物的ASS-F4)均成功喷雾干燥，从喷雾干燥步骤中回收的材料回收率超过35％、接近40％，如表3中所述。

在喷雾干燥步骤之前和之后，针对使用纳米颗粒中的聚合物制备的制剂，测量喷雾干燥对包封效率和纳米颗粒粒度(Z-平均粒径)的影响，值列于表3(底部)中。对于每个脂质-聚合物-mRNA纳米颗粒，包封效率在喷雾干燥之前和之后没有明显变化，并且发现纳米颗粒粒度从喷雾干燥之前至之后增加。对于不使用聚合物制备的制剂，由于喷雾干燥步骤无法产生任何实质性材料，因此无法确定这些指标。

这些结果特别显示，添加到包封mRNA的脂质纳米颗粒中的聚合物可以成功地喷雾干燥mRNA包封的脂质纳米颗粒。这与不包含mRNA的相同脂质纳米颗粒相反，该脂质纳米颗粒未成功喷雾干燥。

实施例4.脂质-聚合物纳米颗粒中的mRNA包封的一步法

在该实施例中，在一个步骤中将聚合物PLGA与脂质和mRNA混合，以产生脂质-PLGA包封的mRNA纳米颗粒。

具体而言，将脂质和PLGA(或仅对于对照制剂来说为脂质)溶解于乙醇和乙腈(1:2)混合物中，并使用齿轮泵与ASS1 mRNA溶液混合。将最终制剂浓缩在5％甘露糖醇中，然后喷雾干燥。喷雾干燥使用以下条件：入口温度为90℃，抽吸百分比为85％，泵百分比为25％以及出口温度为46-50℃。制剂在表4中进一步描述。

表4.实施例4的mRNA制剂组成和特征

结果

用PLGA聚合物在纳米颗粒中制备的制剂的喷雾干燥步骤被成功地喷雾干燥，并且从喷雾干燥步骤中回收了材料。

实施例5.喷雾干燥的mRNA制剂的体内递送

在该实施例中，将喷雾干燥的制剂，使用聚合物的FFL-F1(如实施例1中所述)以干粉形式和溶解于液体的形式施用于小鼠，并且在两种方法中均检测到所施用的制剂中的mRNA表达。

具体而言，在一种方法中，使用DP-4M型干粉吹药器以1mg的剂量向小鼠施用FFL-F1与聚合物的干粉制剂。在干粉施用后24小时，用微雾化器施用FFL底物荧光素，通过生物发光法检测荧光素酶的体内表达。结果描述在图15A中。

在第二方法中，将使用聚合物的FFL-F1以20mg/ml的浓度溶解在水中，并通过微雾化器向每只小鼠施用50微升，剂量为1mg。在施用后24小时，用微雾化器施用FFL底物荧光素，通过生物发光法检测荧光素酶的体内表达。结果描述在图15B中。

这些结果表明，在喷雾干燥后，与聚合物一起配制的LNP中包封的mRNA保持活性。这些结果还表明，喷雾干燥的LNP包封的mRNA可以作为干粉直接施用以提供体内蛋白质的表达。

实施例6.CFTR mRNA脂质-聚合物纳米颗粒干粉制剂

在该实施例中，编码囊性纤维化传导调节因子蛋白(CFTR)的mRNA或CFTR mRNA被包封在脂质-聚合物纳米颗粒中，并成功喷雾干燥成稳定的干粉。

具体而言，为了制备在其中包封CFTR-mRNA的脂质-聚合物纳米颗粒，将下表5中所述的PEG修饰的脂质、阳离子脂质和聚合物溶解在150mL乙醇中，并使用齿轮泵与CFTR-mRNA(0.05g溶于600mL，pH4.5，1mM柠檬酸盐缓冲液，150mM氯化钠)混合。然后，将37.5g甘露糖醇以5％重量/体积溶解到包封在脂质-聚合物纳米颗粒中的750mL CFTR-mRNA溶液(20％乙醇)中。然后将所得混合物在Buchi喷雾干燥器上使用以下喷雾干燥条件进行喷雾干燥：入口温度为90℃，抽吸百分比为90％，泵百分比为25％以及出口温度为46-50℃。

表5.CFTR-mRNA脂质-聚合物纳米颗粒干粉制剂

为了定量确定喷雾干燥后脂质-聚合物纳米颗粒中CFTR-mRNA的完整性，将纳米颗粒在乙醇中混合并溶解于乙醇中，并用RNA沉淀缓冲液将CFTR-mRNA从纳米颗粒中沉淀出来，所述RNA沉淀缓冲液包含硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和柠檬酸钠pH 6.5。使用RNeasy硅胶膜(Qiagen)进一步分离和纯化沉淀的mRNA，然后重新溶解在无RNA酶的水中。使用片段分析仪(Agilent)按照制造商公开的说明，通过毛细管电泳评估纯化的mRNA。简而言之，将适量的插层染料和RNA分离凝胶混合并上样到仪器上。将毛细管调理缓冲液稀释至所需浓度，然后上样到调理液管线上。将入口缓冲液、冲洗缓冲液和储存缓冲液添加至孔板，然后添加至指定位置。将提取的mRNA和对照mRNA稀释至150ng/μL，通过使用甲酰胺上样缓冲液，然后在70℃下加热变性，保持5分钟，然后立即冷却。根据制造商的说明，使用稀释标志物进一步稀释样品，并通过相关的分离方法在片段分析仪上运行。

如以上实施例中所述，制剂中不使用另外的聚合物的LNP-mRNA制剂不能成功地喷雾干燥。具体而言，LNP-mRNA材料聚集在喷雾干燥器中，并堵塞了喷雾干燥器的各个隔室，这样几乎没有或没有回收LNP-mRNA材料。如以上实施例所示，可以通过在LNP制剂中添加聚合物来克服无法成功喷雾干燥LNP-mRNA材料的问题，方法是将聚合物与脂质一起包含在内，以使聚合物存在于制备纳米颗粒并包封mRNA的步骤中，或者在产生脂质纳米颗粒并包封mRNA的步骤之后，通过向制剂中添加聚合物。

在此，通过添加聚合物，尤其是Eudragit聚合物，成功地将脂质纳米颗粒内包封的CFTR-mRNA喷雾干燥。具体而言，在产生纳米颗粒和包封mRNA的步骤之前，将Eudragit聚合物与脂质混合物包括在内，从而产生被脂质-聚合物纳米颗粒包封的CFTR-mRNA。还使用毛细管电泳(CE)分析评估了成功喷雾干燥的CFTR-mRNA脂质-聚合物纳米颗粒的完整性。图16A1-A6显示了喷雾干燥之前和之后CFTR-mRNA峰完整性的示例性CE色谱图，这表明在脂质-聚合物中喷雾干燥后CFTR-mRNA的完整性保持完整。图16A1-A3描绘了既未喷雾干燥也未包封的对照CFTR mRNA，而图16A4-A6描绘了从喷雾干燥制剂中提取的CFTR mRNA。

序列表

<110> 川斯勒佰尔公司

<120> 信使RNA的干粉制剂

<130> MRT-2008WO

<150> 62/702,193

<151> 2018-07-23

<160> 3

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 140

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 1

ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60

cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120

gacucaccgu ccuugacacg 140

<210> 2

<211> 105

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 2

cggguggcau cccugugacc ccuccccagu gccucuccug gcccuggaag uugccacucc 60

agugcccacc agccuugucc uaauaaaauu aaguugcauc aagcu 105

<210> 3

<211> 105

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 3

ggguggcauc ccugugaccc cuccccagug ccucuccugg cccuggaagu ugccacucca 60

gugcccacca gccuuguccu aauaaaauua aguugcauca aagcu 105